一种新型精子质量评价方法
技术领域
本发明属于用于精液检查的显微成像技术领域,具体涉及一种新型精子质量评价方法。
背景技术
精子的活力和形态等作为人类精液检查中的关键部分,对于生殖与发育研究,特别是对于临床生殖医学来说具有十分重要的意义。现有的医学临床检测采用不同的样本制备和显微检测方法来分别检测精子的浓度、活力和形态。
精子的活力可以由人工或者计算机辅助完成,利用计算机辅助精子分析技术可以高精确性的提供精子活力的量化参数,有利于精液检查的规范化和标准化。计算机辅助精子分析技术利用低倍显微成像系统、图像采集、处理及分析系统,通过记录精子连续的运动轨迹,量化统计和分析精子的活力和浓度等。但临床研究显示,在精子的质量评估方面,仅仅靠精子的运动还是不够的,还需要结合精子的形态、结构,特别是其遗传学功能指标。而精子形态计量分析需要通过涂片染色的研究方法,观察与分析静止精子的形态,人类精液检查中精子的形态检查需要在高倍放大显微成像系统下观察涂片染色的样本,样本的处理过程会杀死精子,并且涂片染色由于渗透压改变等因素会对精子形态会造成一定影响。另外,由于对精子的活力检测和形态分析是分开进行的,所以无法得到精子活力于形态之间的对应关系,而这些对于精子的质量分析都是至关重要的。
精子运动速度极快,速度在几十微米/秒,在保证连续观测运动精子和上百个目标追踪需要大视野成像;而精子的头部大小为3到5个微米,囊泡等形态结构在数百纳米量级,而低倍放大成像的极限分辨率在微米级别,无法实现清晰成像,头部形态无法精确测量分析。
受到现有光学成像设计限制,成像的视野大小与物镜的放大倍数成反比,低倍放大成像可以实现大视野无法做到高分辨,高倍放大成像可以实现高分辨无法直接做到大视野。尽管对于不运动的样品,通过成像视野拼接等方法可以对样品进行大视野高分辨的成像,但是对于精子这种快速运动的物体而言,简单的视野拼接是不适合的,会造成运动精子的遗漏或者重复统计。而有效成像面积同时受到显微成像检测元件和光学设计的限制,显微图像采集元件的有效成像面积受到技术和成本的限制。
涂片染色的处理方法观察精子的形态,只能观察精子一侧的信息,而通过观察精子旋转运动可以得到其三维结构信息以及尾部的运动动态测量结果。
发明内容:
本发明的目的是提供一种新型精子质量评价方法,可以更加快速准确的检测精子的特性。
本发明的一种新型精子质量评价方法,是在对大量精子的活力指标进行检测的同时,实现对精子的形态进行高分辨的观测和评价。
该方法同时具备两个成像系统:一个大视野显微成像系统和一个高分辨显微成像系统,并能够快速对同一焦面附近的精子进行共定位和同时成像。
优选,大视野显微成像系统通过对足够多的精子进行连续拍摄,实现对每个精子的位置和速度的测量,进而实现对大视野中各个精子的活力评估。
优选,高分辨显微成像系统为快速高分辨显微成像系统,可以对视野内的运动精子实现高分辨的位置、速度和形态检测。
优选,高分辨显微成像系统的成像区域可以在大视野显微成像系统的成像区域中做任意的快速相对移动,通过高分辨显微成像系统的成像区域在大视野显微成像系统的成像区域中的快速扫描,将大视野显微成像系统的成像区域中的各个部分的精子全部进行高分辨成像,进而对大视野中的所有精子进行形态分析。
优选,在高分辨显微成像系统在大视野显微成像系统的成像区域中进行形态信息采集时,同时采集精子的位置信息,并与大视野显微成像系统的成像区域的各精子的位置信息同步对应。
优选,任意精子的运动速度可以和它的形态指标一一对应,同时在大视野显微成像系统的监视下,可以使得高分辨显微成像系统进行形态分析时,不会对同一精子进行重复计算。
优选,大视野显微成像系统的成像区域可以在样品池中任意移动,以取得具有统计学意义的足够多的精子样本数。
优选,大视野显微成像系统的分辨率可以成像和识别单个精子,大视野只相对于高分辨显微成像系统,方法并不局限成像具体的器件系统和方式。
优选,方法可以根据需求选取一个或者多个大视野显微成像系统的成像区域进行检测。
优选,高分辨显微成像系统的分辨率可以成像和识别单个精子的形态,高分辨只相对于大视野显微成像系统,方法并不局限成像具体的器件系统和方式。
优选,高分辨显微成像系统在大视野显微成像系统的成像区域中进行扫描成像时,部分精子可能丢失和进入成像区域,可以根据大视野显微成像系统采集的信息对目标进行添加或者不再采集其相关信息。
优选,具体步骤如下:
a、将精液样品置于载物台上,大视野显微成像系统和高分辨显微成像系统可同时对精液样品成像,所述的高分辨显微成像系统的成像范围位于大视野显微成像系统的成像范围中,并使两个系统成像清晰;
b、大视野显微成像系统的成像区域包含多个快速运动的精子,通过连续采集的图像信息进行分析,根据大视野显微成像系统内的精子的分布及其实时位置信息,利用高分辨显微成像系统和精子样品相对移动,使得高分辨显微成像系统对大视野显微成像系统内的精子进行区域扫描成像。在扫描过程中,高分辨显微成像系统对成像区域内的精子进行图像信息采集,采集目标精子的形态相关信息后切换下一视野,同时保存目标精子大视野显微成像系统和高分辨显微成像系统采集的图像等数据信息;
c、根据b采集的精子活性等信息选定下一个大视野显微成像系统采集区域,使得两次采集不会重复采集同一个精子的信息,按照此原则在多个选定区域重复步骤b,直到收集足够统计运动精子的活性和形态信息后,结束采集。
本发明利用两个成像系统,可同时检测精液样本中间精子的活力和形态等指标,并且单个精子的活力和形态等一一对应的关系、该方法同时具备两个成像系统:一个大视野显微成像系统和一个高分辨显微成像系统,其中大视野显微成像系统在精液样本中的成像区域为101,大视野显微成像系统的成像区域101中通过对足够多的精子(大视野显微成像系统的成像区域101中共N多个等待采集的精子影像,可按照高分辨显微成像系统采集的顺序为其编号为1S1、1S2、1S3、1S4......1SN)进行连续拍摄记录,实现对大视野显微成像系统的成像区域101中每个精子的位置和速度的测量,得到时间序列下精子的运动轨迹(编号为1S1、1S2、1S3、1S4......1SN对应的轨迹编号为1S1P、1S2P、1S3P、1S4P......1SNP),进而实现对视野中各个精子的活力评估;
其中高分辨显微成像系统为快速高分辨显微成像系统,在精液样本中的成像区域为102高分辨显微成像系统的成像区域,可以实现对在102高分辨显微成像系统的成像区域内的一个或者多个运动精子1Si进行高分辨形态检测,记录其对应的形态1SiM。
102高分辨显微成像系统的成像区域可以在101大视野显微成像系统的成像区域中做任意的快速相对移动。通过102高分辨显微成像系统的成像区域在101大视野显微成像系统的成像区域中的快速扫描覆盖,将当前101大视野显微成像系统的区域中的各个部分的运动的精子(1S1、1S2、1S3、1S4......1SN)全部进行高分辨成像记录(1S1M、1S2M、1S3M、1S4M......1SNM),进而实现对101大视野显微成像系统的成像区域中的所有精子进行形态分析记录。
101大视野显微成像系统的成像区域实时记录了精子的运动轨迹(1S1P、1S2P、1S3P、1S4P......1SNP),在102显微成像系统的成像区域快速扫描,对101大视野显微成像系统的成像区域进行快速遍历,在当前位置102高分辨显微成像系统的成像区域内包含的精子如1Si等成像清晰后,根据101大视野显微成像系统的成像区域实时记录了精子的运动轨迹(1S1P、1S2P、1S3P、1S4P......1SNP)按照对应编号记录其形态。
102高分辨显微成像系统的成像区按照这种方法完成了对101大视野显微成像系统的成像区域内精子(1S1、1S2、1S3、1S4......1SN)的形态(1S1M、1S2M、1S3M、1S4M......1SNM)的扫描记录,并与101大视野显微成像系统的成像区采集的精子(1S1、1S2、1S3、1S4......1SN)运动轨迹(1S1P、1S2P、1S3P、1S4P......1SNP)一一对应。
方法可以在CELL样品池的检测区域选取多个101大视野显微成像系统的成像区域,第一次采集选取的区域为第一个大视野检测区域LR1,第二个大视野检测区域LR2、第三个大视野检测区域LR3......第n个大视野检测区域LRn。LR1与LR2两个检测区域之间的距离RD1、LR2与LR3两个检测区域之间的距离RD2、LR3与LR4两个检测区域之间的距离RD3......LRn-1与LRn两个检测区域之间的距离RDn。RD1、RD2、RD3等的选取有CELL和101大视野显微成像系统的成像区域一次完整的采集时间(1S1T、1S2T、1S3T......1SNT)估计,应该保证第i次检测第i个大视野检测区域LRi不会出现上一个检测第i-1个大视野检测区域LRi-1区域已经检测过的精子。
本发明的有益效果如下:
1、本发明实现精液中活精子的形态检测与统计,且可以选择无染色标记检测,因此本发明保持了精子活性和受精能力,后经分选可继续用于科学研究和临床医疗(体外受精)等。
2、利用现有的显微成像方法无法实现在高分辨的条件下观察数百个高速运动精子的形态,而本发明可以一次检测可同时检测精液样本大量精子的活力和形态,方便科研和临床进行统计分析。
3、本发明兼容荧光、拉曼等测量以及其他超分辨成像方法,可以实现更高要求的应用。
4、本发明可以精确测量单个活精子的活力(曲线速度、直线速度等)和形态(头部大小、头部形态、空泡等),叠加统计可以更加准确的反映精子质量。
5、本发明可以实现精子形态的3D信息采集,精子顶部和头部形态以及空泡位置等信息可推广用于单精子注射,为试管婴儿疾病诊断提供更加精确的临床指导,为基础研究中精子细胞蛋白组学检测、单细胞测序提供技术方法。
附图说明:
图1是大视野显微成像系统和高分辨显微成像系统的成像区域方法示意图;
图2是样本中多采集区域示意图
图3是一种新型精子质量评价方法的高分辨显微成像系统的结构示意图;
图4是大视野显微成像系统采集精子图片;
图5是高分辨显微成像系统采集精子图片;
其中1、大视野显微成像系统的物镜;2、大视野显微成像系统的中继光路;3、大视野显微成像系统的附属功能模块;4、大视野显微成像系统的光电图像探测器;5、高分辨显微成像系统的物镜;6、高分辨显微成像系统的中继光路;7、高分辨显微成像附属功能模块;8、高分辨显微成像系统的光电图像探测器;9、载物台;10、计算机图形工作站;11、精液样品;
101、大视野显微成像系统的成像区域;102、高分辨显微成像系统的成像区域;1Si、高分辨显微成像系统的成像区域内精子;
LR1、第一个大视野检测区域;LR2、第二个大视野检测区域;LR3、第三个大视野检测区域;LR4、第四个大视野检测区域;LRn、第n个大视野检测区域;RD1是LR1与LR2两个检测区域之间的距离;RD2是LR2与LR3两个检测区域之间的距离;RD3是LR3与LR4两个检测区域之间的距离;RD4是LR4与LR5两个检测区域之间的距离;RDn是LRn-1与LRn两个检测区域之间的距离;CELL样品池的检测区域;
具体实施方式:
为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能,解析本发明的优点与精神,藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。
实施例1:
如图3所示,本实施例的大视野下大量运动精子的高分辨显微成像系统,包括大视野显微成像系统的物镜1、大视野显微成像系统的中继光路2、大视野显微成像系统的附属功能模块3、大视野显微成像系统的光电图像探测器4、高分辨显微成像系统的物镜5、高分辨显微成像系统的中继光路6、高分辨显微成像附属功能模块7、高分辨显微成像系统的光电图像探测器8、载物台9和计算机图形工作站10,所述的大视野显微成像系统的物镜1和高分辨显微成像系统的物镜5分别设于载物台的上、下两侧,大视野显微成像系统的物镜1、大视野显微成像系统的中继光路2、大视野显微成像系统的光电图像探测器4顺序相连,高分辨显微成像系统的物镜5、高分辨显微成像系统的中继光路6、高分辨显微成像系统的光电图像探测器8顺序相连,大视野显微成像系统的光电图像探测器4和高分辨显微成像系统的光电图像探测器8分别都与计算机图形工作站10信号相连。所述的大视野显微成像系统的附属功能模块3与大视野显微成像系统的中继光路2相连。所述的高分辨显微成像附属功能模块7与高分辨显微成像系统的中继光路6相连。
所述的大视野显微成像系统的附属功能模块可以是系统光源,其照明光源的发光光谱范围主要在400-700纳米,标称功率150W瓦,色温3450开尔文。
所述的大视野显微成像系统的物镜1:物镜的放大倍数为20,NA为0.25,工作距离为25毫米,400-700纳米透过率大于90%。
所述的高分辨显微成像系统的物镜5:物镜的放大倍数为100,NA为1.4,工作距离为0.15毫米,400-700纳米透过率大于80%。
所述的大视野显微成像系统的光电图像探测器4曝光时间小于1毫秒,可实现对曝光时间微秒大小的精确控制。
所述的载物台9横向行程110毫米,纵向行程75毫米,位移分辨率0.1微米,重复精度大于1微米,最大运行速度7毫米每秒,载物台最大负重5千克。
大视野显微成像系统的中继光路2中分光镜,所述分光镜基质为熔融石英,二维尺寸宽为25毫米长为36毫米,厚度1毫米,在光谱350到1100纳米范围内,反射率和透射率在10%到90%之间,反射率和透射率平均值之比为9∶1到9∶1之间。
利用上述大视野下大量运动精子的高分辨显微成像系统进行大视野下大量运动精子的高分辨成像的方法,其步骤如下:
精液样本在37摄氏度液化后,按照相应实验室手册方法对精液样本进行混匀制片并保持稳定的温度37摄氏度,得到制片精液样品。将制片精液样品9放置在大视野显微成像系统的物镜和高分辨显微成像系统的物镜两者之间的载物台9上,载物台9提前预热保存温度恒定在37摄氏度。所述的高分辨显微成像系统的物镜的成像区域102位于大视野显微成像系统的成像区域101中(图1),具体是:高分辨显微成像系统的成像区域102位于大视野显微成像系统的成像区域101的正中,从侧面看,大视野显微成像系统的成像区域101和高分辨显微成像系统的成像区域102应处于同一成像面。
调节照明强度,精液样品的位置等参数,使得大视野显微成像系统的成像区域101和高分辨显微成像系统的成像区域102的成像清晰,大视野显微成像系统的物镜1采集的成像信息,经过大视野显微成像系统的中继光路2将成像信息传输给大视野显微成像系统的光电图像探测器4,大视野显微成像系统的光电图像探测器将成像信息转换为图像信息,再将图像信息传输给计算机图形工作站10,计算机图形工作站通过连续的采集观测多个目标并保存记录追踪;高分辨显微成像系统的物镜5采集的成像信息,经过高分辨显微成像系统的中继光路6将成像信息传输给高分辨显微成像系统的光电图像探测器8,高分辨显微成像系统的光电图像探测器8将成像信息转换为图像信息,再将图像信息传输给计算机图形工作站10中。
其中大视野显微成像系统通过物镜1在精液样本中的大视野显微成像系统的成像区域101,大视野显微成像系统的成像区域101中通过对足够多的精子(大视野显微成像系统的成像区域101中有N多个可采集的精子影像,按照高分辨显微成像系统采集的顺序为其编号为1S1、1S2、1S3、1S4......1SN)进行连续拍摄记录,实现对大视野显微成像系统的成像区域101中每个精子的位置和速度的测量,得到时间序列下精子的运动轨迹(编号为1S1、1S2、1S3、1S4......1SN对应的轨迹编号为1S1P、1S2P、1S3P、1S4P......1SNP),进而实现对视野中各个精子的活力评估。
其中高分辨显微成像系统为快速高分辨显微成像系统,在精液样本中的成像区域为102高分辨显微成像系统的成像区域,可以实现对在102高分辨显微成像系统的成像区域内的一个或者多个运动精子1Si进行高分辨形态检测,记录其对应的形态1SiM。
102高分辨显微成像系统的成像区域可以在101大视野显微成像系统的成像区域中做任意的快速相对移动。通过102高分辨显微成像系统的成像区域在101大视野显微成像系统的成像区域中的快速扫描覆盖,将当前101大视野成像区域中的各个部分的运动的精子(1S1、1S2、1S3、1S4......1SN)全部进行高分辨成像记录(1S1M、1S2M、1S3M、1S4M......1SNM),进而实现对101大视野显微成像系统的成像区域中的所有精子进行形态分析记录。
101大视野显微成像系统的成像区域实时记录了精子的运动轨迹(1S1P、1S2P、1S3P、1S4P......1SNP),在102高分辨显微成像系统的成像区域快速扫描,对101大视野显微成像系统的成像区域进行快速遍历,在当前位置102高分辨显微成像系统的成像区域内包含的精子如1Si等成像清晰后,根据101大视野显微成像系统的成像区域实时记录了精子的运动轨迹(1S1P、1S2P、1S3P、1S4P......1SNP)按照对应编号记录其形态。
102高分辨显微成像系统的成像区按照这种方法完成了对101大视野显微成像系统的成像区域内精子(1S1、1S2、1S3、1S4......1SN)的形态(1S1M、1S2M、1S3M、1S4M......1SNM)的扫描记录,并与101大视野显微成像系统的成像区采集的精子(1S1、1S2、1S3、1S4......1SN)运动轨迹(1S1P、1S2P、1S3P、1S4P......1SNP)一一对应。
方法可以在CELL样品池的检测区域选取多个101大视野显微成像系统的成像区域,第一次采集选取的区域为第一个大视野检测区域LR1,第二个大视野检测区域LR2、第三个大视野检测区域LR3......第n个大视野检测区域LRn。LR1与LR2两个检测区域之间的距离RD1、LR2与LR3两个检测区域之间的距离RD2、LR3与LR4两个检测区域之间的距离RD3......LRn-1与LRn两个检测区域之间的距离RDn。RD1、RD2、RD3等的选取有CELL和101大视野显微成像系统的成像区域一次完整的采集时间(1S1T、1S2T、1S3T......1SNT)估计,应该保证第i次检测第i个大视野检测区域LRi不会出现上一个检测第i-1个大视野检测区域LRi-1区域已经检测过的精子。
将大视野显微成像系统的物镜的成像区域101和高分辨显微成像系统的物镜的成像区域102采集的成像数据-图像信息传输、记录在计算机图形工作站10之中,并对其进行分析,完成对目标精子的成像数据的采集工作。
根据统计等原则确定大视野显微成像系统的成像区域101中的下一个待检测的目标精子,重复上述步奏,开始下一个循环采集,直到大视野显微成像系统的成像区域101中所有应采集目标精子后结束当前一次采集。
随机或者按照统计原则,移动载物台9,更换大视野显微成像系统的成像区域101,开始新一个视野的采集,直到达到统计要求数目的精子信息。
大视野显微成像系统采集精子的图片如图4所示,高分辨显微成像系统采集精子的图片如图5所示。
从上面可以看出,本发明的系统和方法采用两个不同成像范围和分辨率的显微成像系统,两个显微成像系统对检测样本同时共定位成像,通过耦合大视野显微成像系统和高分辨显微成像系统的成像信息,可以获取活精子连续的运动轨迹,量化统计和分析精子的活力和浓度等,精子的形态、结构,可以检测运动精子形态的动态信息,尾部运动的状态,可以精确测量单个活精子的活力(曲线速度、直线速度等)和形态(头部大小、头部形态、空泡等),叠加统计可以更加准确的反映精子质量。方法可以实现活精子3D信息采集,精子顶部和头部形态以及空泡位置等信息可推广用于单精子注射,为试管婴儿疾病诊断提供更加精确的临床指导,为基础研究中精子细胞蛋白组学、单细胞测序。而且方法使用的活精子样本无需染色检测,因此本发明保持了精子活性和受精能力,后经分选可用于科学研究和临床医疗(体外受精)。本发明的系统和方法还可以一次性检测精液样本的大量精子的活力和形态,方便科研和临床进行统计分析。