CN107703027A - 一种基于量子点三维示踪测定细胞质粘度的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于量子点三维跟踪获取细胞质粘度的方法,首先通过脂质体Lipo‑2000转染法使量子点进入细胞内,实现细胞标记;再通过搭建的量子点三维成像系统,采用光学调制的方法对细胞内分散的可识别的单一量子点进行三维定位及跟踪;进而使用三维运动信息求解量子点运动参数均方位移值MSD,依据MSD数学特性选取符合自由扩散特性的量子点;最后,对所有符合自由扩散特性的量子点,通过其MSD值求解量子点在细胞质中的扩散系数D,进而依据斯托克斯‑爱因斯坦方程获取细胞质粘度;本发明在细胞成活的状态下,可获得较准确的细胞质粘度,同时可获得直观的细胞质内分子三维运动信息,为细胞内物质运输、信号传递、代谢和分化等的研究提供了技术基础。
Description
技术领域
本发明属于微纳三维成像技术领域,具体涉及一种基于量子点三维示踪测定细胞质粘度的方法。
背景技术
细胞质是细胞生命活动的主要场所,是细胞质膜包围的除核区外的一切半透明、胶状、颗粒状物质的总称。细胞质的粘度是影响生物分子扩散的主要因素,通过获取细胞质粘度值,可以进一步了解活细胞物质运输、信号传递、代谢和分化等重要过程。目前确定细胞质粘度的方法为使用粘度计,以抽取细胞质的方法测量细胞质粘度。然而细胞质抽取出细胞体外后,对其在细胞内的特性有所改变,并且粘度计不能用于测量诸如单个细胞的细胞溶质的微小体积溶液的粘度,获取的粘度值为对大量细胞进行细胞质抽取后测到的综合粘度值,同时也带来了较大的工作量。
使用量子点作为荧光探针标记工具,其光热特性多用于细胞内部温度测试。目前已有学者将其作为细胞内粘度探针,通过荧光强度变化,荧光各向异性和荧光寿命等方式反应细胞粘度值,但该方法不能直观的了解特定细胞质粘度下分子三维运动特性。为获取细胞质内分子三维运动特性,涉及到量子点实时定位追踪技术,该技术目前多为二维系统下的定位,常见的三维共聚焦扫描显微镜、断层扫描显微镜虽然可以对量子点进行三维定位,但是都需要对样品进行扫描,不适用于在细胞内量子点实时追踪的情况。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种基于量子点高精度实时定位技术,通过追踪单个量子点在细胞内的活动路径,计算其在细胞质内的扩散系数并进一步获取细胞质粘度。
为了达到上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种基于量子点三维示踪测定细胞质粘度的方法,包括以下步骤:
(一)量子点对细胞进行标记
(1)、待第四代HepG2细胞80~90%融合时,用体积浓度2.5%胰酶-EDTA进行消化,培养液重悬后对细胞进行计数,根据计数结果,将细胞密度稀释至1.0×105个/mL,取1mL该细胞悬液接种于直径20mm的共焦培养皿,培养10h后细胞完全贴壁;
(2)、细胞完全贴壁后移除细胞培养液,更换为700μL的DMEM培养基,CO2细胞培养箱中培养;
(3)、取3μL的脂质体Lipo-2000,用150μL的DMEM培养基稀释混合后孵育5min;
(4)、取已知浓度为10μM的CdTe量子点溶液100μL,用50μL的DMEM培养基稀释,混合均匀,并与步骤(3)产物混合均匀,室温下静置20min;
(5)、将300μL步骤(4)产物加入到步骤(2)产物所在的细胞培养皿中,混匀。
(6)、将步骤(5)培养皿置于5%CO2细胞培养箱中,在37℃培养5h后移除培养液,用DPBS清洗两遍,更换为含有血清的完全培养液,得到样品4。
(二)量子点三维成像系统搭建
量子点三维成像系统包括激光器1,激光器1发出的激光通过第一半反半透镜2反射激发载物台3上的量子点标记过的细胞样品4,样品4经物镜5放大成像,再经第二半反半透镜6作用分成两路光路,一路为反射光路,一路为透射光路,在第二半反半透镜6的反射光路上依次设置有第一透镜7、相位调制器8、第二透镜9、CCD10,经第二半反半透镜6反射得到的像位于第一透镜7的前焦面,相位调制器8位于第一透镜7的后焦面,相位调制器8同时也位于第二透镜9的前焦面,相位调制器8与计算机11连接,CCD10位于第二透镜9的后焦面,CCD10与计算机11连接,经半反半透镜透射的像进入目镜12,以供实验者观察;
(三)量子点三维成像示踪
(1)将量子点标定好的细胞置于载物台3上,通过目镜12观察成像,调整载玻片位置使视场范围内有足够多且荧光强度较高的量子点,调整物镜5工作距离使成像清晰;
(2)移动载玻片,通过目镜12观察并寻找量子点较分散、荧光较强的区域,在该区域中寻找分散的可识别的数个量子点,将其作为测量对象,并移至视场中心;
(3)上述激光器1采取间歇性激发方式,激发的同时,利用CCD10采集量子点成像并保存;
(4)以图像中心为坐标原点,对采集到的每张图片,分别对视场内的所有单个量子点的像进行处理,通过像的中心位置信息及角度信息,得到该点的三维位置信息,从而得到该图像采集时刻下,视场内所有单个量子点在该空间中的三维位置,依次对不同时刻采集到的图片It进行处理,则可得到视场内每个量子点不同时刻的位置信息,连接不同时刻位置点坐标,便可得到每个量子点的运动轨迹;
(四)量子点在细胞质内扩散系数求解
(1)依据量子点的运动轨迹信息,通过求解单个量子点均方位移MSD的值,选取具有自由扩散特性的量子点;
(2)根据选取到的量子点,在已求解其MSD值的基础上,根据关系式n为维度值,在三维空间求解,故n=3;D为扩散系数;t为时间变量;σn表示在n个维度各个方向上的位置精度,求解量子点在细胞质内的扩散系数D;
(五)细胞质粘度计算
(1)获取多个符合自由扩散运动特性的量子点,通过步骤(四)求解到多个D值,再通过剔除异值后求平均的方式,得到最终的扩散系数D;
(2)得到D值后,根据斯托克斯-爱因斯坦方程D=kT/6πηr,其中k为螺栓曼常数,T为绝对温度,r为量子点的水力半径,即可求解细胞质粘度值η。
所述的相位调制器8为固定相位板,或为透射式液晶相位调制器,或为反射式液晶相位调制器。
本发明的有益效果:本发明所使用的量子点标定追踪方法,不会对细胞造成伤害,在细胞成活的状态下,测得细胞质粘度η;同时通过本方法,可直观的获知分子在细胞内的运动状态,可获得自由扩散系数;本发明采用的空间光调制方法实现量子点的空间定位,具有较高的实时性和定位精度,可获取较准确的细胞质粘度。
附图说明
图1为量子点三维成像系统结构示意图。
图2为量子点三维成像追踪示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
一种基于量子点三维跟踪获取细胞质粘度的方法,包括以下步骤:
(一)量子点对细胞进行标记
本方法以CdTe量子点标记HepG2细胞为例,采用脂质体Lipo-2000转染法,通过多次实验参数调整与优化后得到如下的操作流程:
(1)、待第四代HepG2细胞80~90%融合时,用体积浓度2.5%胰酶-EDTA进行消化,培养液重悬后对细胞进行计数,根据计数结果,将细胞密度稀释至1.0×105个/mL,取1mL该细胞悬液接种于直径20mm的共焦培养皿(NEST),培养10h后细胞完全贴壁;(2)、细胞完全贴壁后移除细胞培养液,更换为700μL的DMEM培养基,CO2细胞培养箱中培养;
(3)、取3μL的脂质体Lipo-2000,用150μL的DMEM培养基稀释混合后孵育5min;
(4)、取已知浓度为10μM的CdTe量子点溶液100μL,用50μL的DMEM培养基稀释,混合均匀,并与步骤(3)产物混合均匀,室温下静置20min;
(5)、将300μL步骤(4)产物加入到步骤(2)产物所在的细胞培养皿中,混匀。
(6)、将步骤(5)培养皿置于5%CO2细胞培养箱中,在37℃培养5h后移除培养液,用DPBS清洗两遍,更换为含有血清的完全培养液,得到样品4。之所以用DPBS清洗,是为了排除培养液中存在的CdTe量子点对荧光观察的影响。
(二)量子点三维成像系统搭建
参照图1,量子点三维成像系统包括激光器1,激光器1发出的激光通过第一半反半透镜2反射激发载物台3上的量子点标记过的细胞样品4,样品4经物镜5放大成像,再经第二半反半透镜6作用分成两路光路,一路为反射光路,一路为透射光路,在第二半反半透镜6的反射光路上依次设置有第一透镜7、相位调制器8、第二透镜9、CCD10,经第二半反半透镜6反射得到的像位于第一透镜7的前焦面,相位调制器8位于第一透镜7的后焦面,相位调制器8同时也位于第二透镜9的前焦面,相位调制器8(当相位调制器8为透射式液晶相位调制器或为反射式液晶相位调制器时)与计算机11连接,计算机11实时控制并改变相位调制器8的调制函数,从而控制样品4的定位精度,CCD10位于第二透镜9的后焦面,CCD10与计算机11连接,实时传输采集数据。经半反半透镜透射的像进入目镜12,以供实验者观察。
所述的相位调制器8为固定相位板,或为透射式液晶相位调制器,或为反射式液晶相位调制器。
所述的第一透镜7、相位调制器8、第二透镜9、CCD10构成光学调制系统,它们之间的位置不能发生变化,其他组件位置可做一定的变动,如光学调制系统整体可与目镜12位置进行交换,保证经第二半反半透镜6透射得到的像位于第一透镜7的前焦面即可;或激光器1也可从载物台3上方激发样品4,同时在光学调制系统和目镜12前加可滤除光源激发光波长的滤镜即可。总之,图1中系统搭建需保证激光器1激发光可激发样品4,样品4发射荧光可被物镜5放大后被光学调制系统和目镜12接收,并且激发光不会干扰光学调制系统和目镜12观察,在此基础上,器件搭建方式可有变化。
本系统的工作原理为:
细胞内的量子点4成像于第一透镜7的前焦面,第一透镜7对其进行傅里叶变换并成像于后焦面,通过计算机11控制相位调制器8的调制函数,被调制的光经第二透镜9成像于CCD10上,通过相位调制器8的调制,量子点4的成像从单光斑转换为双光斑,双光斑中心连线的中点反映量子点4的横向位置,连线的角度反映量子点4沿激发光轴的轴向位置。
(三)量子点三维成像示踪,参照图2,
(1)将量子点标定好的细胞置于载物台3上,通过目镜12观察成像,调整载玻片位置使视场范围内有足够多且荧光强度较高的量子点,调整物镜5工作距离使成像清晰;
(2)移动载玻片,通过目镜12观察并寻找量子点较分散、荧光较强的区域,在该区域中寻找分散的可识别的数个量子点,将其作为测量对象,并移至视场中心;如图2(a)所示,通过目镜寻找到视场中三个分散的单一量子点。
(3)上述激光器1采取间歇性激发方式,激发的同时,利用CCD采集经过相位调制器调制的量子点成像并保存。图2(b)所示为不同时刻记录到的量子点双光斑成像图片序列。
(4)以图像中心为坐标原点,对采集到的每张图片,分别对视场内的所有单个量子点的像进行处理。如图2(c)所示,通过双光斑中心连线的中点确定量子点横向位置(x,y),通过双光斑连线的角度(α)确定量子点的轴向位置(z)。从而得到该图像采集时刻下,视场内所有单个量子点在该空间中的三维位置。依次对不同时刻采集到的图片It进行处理,则可得到视场内每个量子点不同时刻的位置信息,连接不同时刻位置点坐标,便可得到每个量子点的运动轨迹。图2(d)中给出了可能的运动轨迹的示意图。
(四)量子点在细胞质内扩散系数求解
(1)量子点在细胞内的运动模式有三种,为求解扩散系数,需选择运动状态为自由扩散的量子点进行下一步的计算。均方位移(MSD)的值可反映出不同的运动模式,依据位置运动信息,求解量子点均方位移(MSD)的值,选取MSD函数成直线的量子点(即运动模式为自由扩散量子点);
(2)根据选取到的量子点,在已求解其MSD函数值的基础上,根据关系式(n为维度值,本发明在三维空间求解,故n=3;D为扩散系数;t为时间变量;σn表示在n个维度各个方向上的位置精度)求解量子点在细胞质内的扩散系数D(MSD斜率值除以6)。
(五)细胞质粘度计算
(1)在步骤(四)中,有可能在一次实验观察中,获取不到符合自由扩散特性的量子点,也有可能获取到多个。此处可通过对同期同样培养标定方式下的细胞样品,做多次实验,获取较多符合自由扩散运动特性的量子点,通过4)步骤,求解到多个D值,再通过剔除异值后求平均的方式,得到最终的扩散系数D。
(2)得到D值后,根据斯托克斯-爱因斯坦方程D=kT/6πηr(其中k为螺栓曼常数,T为绝对温度,r为量子点的水力半径半径)求解细胞质粘度值η。
Claims (4)
1.一种基于量子点三维跟踪获取细胞质粘度的方法,包括以下步骤:
(一)量子点对细胞进行标记
(1)、待第四代HepG2细胞80~90%融合时,用体积浓度2.5%胰酶-EDTA进行消化,培养液重悬后对细胞进行计数,根据计数结果,将细胞密度稀释至1.0×105个/mL,取1mL该细胞悬液接种于直径20mm的共焦培养皿,培养10h后细胞完全贴壁;
(2)、细胞完全贴壁后移除细胞培养液,更换为700μL的DMEM培养基,CO2细胞培养箱中培养;
(3)、取3μL的脂质体Lipo-2000,用150μL的DMEM培养基稀释混合后孵育5min;
(4)、取已知浓度为10μM的CdTe量子点溶液100μL,用50μL的DMEM培养基稀释,混合均匀,并与步骤(3)产物混合均匀,室温下静置20min;
(5)、将300μL步骤(4)产物加入到步骤(2)产物所在的细胞培养皿中,混匀。
(6)、将步骤(5)培养皿置于5%CO2细胞培养箱中,在37℃培养5h后移除培养液,用DPBS清洗两遍,更换为含有血清的完全培养液,得到样品4。
(二)量子点三维成像系统搭建
量子点三维成像系统包括激光器1,激光器1发出的激光通过第一半反半透镜2反射激发载物台3上的量子点标记过的细胞样品4,样品4经物镜5放大成像,再经第二半反半透镜6作用分成两路光路,一路为反射光路,一路为透射光路,在第二半反半透镜6的反射光路上依次设置有第一透镜7、相位调制器8、第二透镜9、CCD10,经第二半反半透镜6反射得到的像位于第一透镜7的前焦面,相位调制器8位于第一透镜7的后焦面,相位调制器8同时也位于第二透镜9的前焦面,相位调制器8与计算机11连接,CCD10位于第二透镜9的后焦面,CCD10与计算机11连接,经半反半透镜透射的像进入目镜12,以供实验者观察;
(三)量子点三维成像示踪
(1)将量子点标定好的细胞置于载物台3上,通过目镜12观察成像,调整载玻片位置使视场范围内有足够多且荧光强度较高的量子点,调整物镜5工作距离使成像清晰;
(2)移动载玻片,通过目镜12观察并寻找量子点较分散、荧光较强的区域,在该区域中寻找分散的可识别的数个量子点,将其作为测量对象,并移至视场中心;
(3)上述激光器1采取间歇性激发方式,激发的同时,利用CCD10采集量子点成像并保存;
(4)以图像中心为坐标原点,对采集到的每张图片,分别对视场内的所有单个量子点的像进行处理,通过像的中心位置信息及角度信息,得到该点的三维位置信息,从而得到该图像采集时刻下,视场内所有单个量子点在该空间中的三维位置,依次对不同时刻采集到的图片It进行处理,则可得到视场内每个量子点不同时刻的位置信息,连接不同时刻位置点坐标,便可得到每个量子点的运动轨迹;
(四)量子点在细胞质内扩散系数求解;
(五)细胞质粘度计算。
2.(四)量子点在细胞质内扩散系数求解
(1)依据量子点的运动轨迹信息,通过求解单个量子点均方位移MSD的值,选取具有自由扩散特性的量子点;
(2)根据选取到的量子点,在已求解其MSD值的基础上,根据关系式n为维度值,在三维空间求解,故n=3;D为扩散系数;t为时间变量;σn表示在n个维度各个方向上的位置精度,求解量子点在细胞质内的扩散系数D。
3.(五)细胞质粘度计算
(1)获取多个符合自由扩散运动特性的量子点,通过步骤(四)求解到多个D值,再通过剔除异值后求平均的方式,得到最终的扩散系数D;
(2)得到D值后,根据斯托克斯-爱因斯坦方程D=kT/6πηr,其中k为螺栓曼常数,T为绝对温度,r为量子点的水力半径,即可求解细胞质粘度值η。
4.所述的相位调制器8为固定相位板,或为透射式液晶相位调制器,或为反射式液晶相位调制器。
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