CN110081996B - 一种量子点空间示踪测温系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种量子点空间示踪测温系统及方法，在暗场环境中，使用激光器激发标记在细胞样品中的量子点探针，通过物镜显微放大后再经半反半透镜将光路一分为二，一路采用光学相位调制法获取分散在样品细胞内量子点的三维空间位置信息，由EMCCD在图像模式下一定频率的采集不同时刻下的图像数据，实现量子点三维空间定位和示踪；第二路采用光谱仪获取量子点的荧光强度与波长信息，由EMCCD在光谱模式下同步地采集不同时刻下的光谱数据，并根据量子点的光热特性得到量子点的实时温度，两个EMCCD分别将采集的数据发送给计算机，由计算机将不同时刻下量子点的位置与温度匹配，完成对量子点空间示踪测温。实现对细胞内量子点高精度的三维空间示踪及同步测温。
Description
技术领域
本发明属于微纳测温及三维示踪技术领域，具体涉及一种量子点空间示踪测温系统及方法。
背景技术
细胞是生命活动的基本单元，而细胞参与生命活动的基础是细胞内外大量生物大分子之间的相互作用。同时，细胞中存在着各种生化反应，在其三维空间结构中必然存在着温度变化，这种温度梯度能够反映细胞各个器官的热力学特性和功能乃至整个生命现象的状态变化。若有一种方法可以跟踪粒子并感知实时的温度，将为研究细胞内各种生命活动过程提供有效手段。然而，目前现有的单粒子示踪技术大多利用荧光微球等粒子在亚细胞层次上通过光学手段可实现二维空间和时间尺度(x-y-t)上运动的相关信息，而且针对细胞内测温大多采用微体积温度计，只适用于整体测温，而不能实现对细胞内单粒子的跟踪测温。
量子点作为一种荧光探针标记工具，利用其光热特性可以用于温度测量。目前已有学者将其作为温度探针，通过荧光强度峰值波长与温度的关系获得细胞整体温度。粒子示踪方面，目前多为二维平面内的示踪，常见的荧光共聚焦扫描技术和随机光学重构技术都需要对样品进行分层扫描，无法实现对细胞内量子点的实时三维空间定位跟踪。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种量子点空间示踪测温系统及方法，能够在微纳尺度下对细胞内量子点实现高精度三维空间跟踪并实时监测该量子点温度。
本发明采用以下技术方案：
一种量子点空间示踪测温方法，在暗场环境中，使用激光器激发标记在细胞样品中的量子点探针，通过物镜显微放大后再经半反半透镜将光路一分为二，一路采用光学相位调制法获取分散在样品细胞内量子点的空间位置信息，由一个EMCCD在图像模式下一定频率的采集不同时刻下的图像数据，实现量子点三维空间定位和示踪；第二路采用光谱仪获取量子点的荧光强度与波长信息，由第二个EMCCD在光谱模式下同步地采集不同时刻下的光谱数据，并根据量子点的光热特性得到量子点的实时温度，两个EMCCD分别将采集的数据发送给计算机，由计算机将不同时刻下量子点的位置与温度匹配，完成对量子点的空间示踪测温。
具体的，包括以下步骤：
S1、将已被量子点标记的细胞样品置于载物台上，通过目镜观察成像，调整载玻片位置，调整物镜的工作距离使成像清晰；
S2、平移载玻片，将两个EMCCD设置为实时成像模式，观察并寻找量子点清晰可辨的区域，并在该区域中寻找分散的可识别的单个或若干量子点，将其作为测量对象，并移至视场中心；
S3、将两个EMCCD设置相同的采集频率，并将与光谱仪连接的EMCCD设置为光谱模式，同时触发，激光器采用连续激发的方式，两个EMCCD同步采集经过相位片调制的量子点成像和经过光谱仪的光谱图；
S4、经相位片调制后的量子点成像由单个亮点变为带有z轴信息旋转角的双斑；然后计算机对不同时刻采集到的图像进行处理，得到每个量子点的运动轨迹；
S5、经光谱仪得到的光谱图包含不同波长下荧光强度的信息，计算机根据量子点的光热特性得到每个量子点的环境温度，依次对不同时刻的光谱图处理得到量子点环境温度与时间的关系；
S6、根据步骤S4和步骤S5所得到的结果得到量子点运动轨迹和温度的变化信息。
进一步的，步骤S4中，以图中心为坐标原点，对采集到的每张图片，分别对视场内的所有单个量子点的像进行处理；双光斑中心连线的中点确定量子点横向位置，通过双光斑连线的角度确定量子点的轴向位置，得到该图像采集时刻下视场内所有单个量子点在该空间中的三维位置；依次对不同时刻采集到的图片进行处理，得到视场内每个量子点不同时刻的位置信息，连接不同时刻位置点坐标，便可得到每个量子点的运动轨迹。
本发明的另一个技术方案是，一种量子点空间示踪测温系统，包括激光器，激光器发出的激发光经第一半反半透镜照射至样品，然后通过物镜显微放大后再经第二半反半透镜将光路一分为二，一路经量子点示踪光路和第一EMCCD后与计算机连接，另一路经测温光路和第二EMCCD后与计算机连接。
具体的，量子点示踪光路包括滤光片，滤光片设置在第二半反半透镜和第一EMCCD之间，滤光片与第一EMCCD之间间隔设置有第一透镜、相位片和第二透镜。
进一步的，第一透镜与第二透镜的焦距相等。
进一步的，第一透镜、相位片、第二透镜和第一EMCCD之间的位置不变。
更进一步的，样品的成像在第一透镜的前焦面，相位片位于第一透镜的后焦面，同时也是第二透镜的前焦面，第一EMCCD位于第二透镜的后焦面。
具体的，测温光路包括设置在第二半反半透镜和第二EMCCD之间的光谱仪，光谱仪与第二半反半透镜之间设置有用于改变光路的反射镜。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明一种量子点空间示踪测温方法，在微纳尺度下，对量子点三维空间示踪与量子点光谱测温实现了实时同步耦合，可直观获得量子点在细胞内的运动轨迹和微小的局部温度变化；采用非接触式的光学测量，对细胞结构没有损害，且量子点体积小(10nm以下)，生物兼容性好，保证了细胞的完整性和活性，示踪测温操作步骤简单，确定观测区域后，可同时对单个或若干个量子点同时监测。
进一步的，对不同时刻的图像采用相关算法获得量子点的三维空间位置，具有毫秒级的时间分辨率和纳米级的定位精度。
本发明还公开了一种量子点空间示踪测温系统，将显微放大、量子点空间示踪和光谱测温耦合为一个同步测量系统，可实现微纳尺度的量子点三维空间示踪及同步测温。
进一步的，滤光片根据量子点荧光的发射波长确定中心波长，一般为550nm，半带宽为40nm，用于减少杂光对量子点示踪的影响。
进一步的，采用焦距相等的第一透镜和第二透镜，便于搭建经典4f光学系统。
进一步的，第一透镜、相位片、第二透镜和第一EMCCD之间的间隔皆为透镜的焦距，是因为按此搭建的光路，相位片刚好位于傅里叶频谱面，利用相位片上带有点扩散函数可完成对空间光的相位调制，使第一EMCCD采集到的像不仅是平面图像，而且带有三维深度信息，可根据算法得到量子点的三维空间位置。
进一步的，光谱仪将入射光分解为不同波长的谱线，实时获得量子点的荧光光谱线，由第二EMCCD采集不同波长位置的荧光强度信息。反射镜并不一定需要设置，但必须保证光路进入光谱仪。
综上所述，本发明不仅实现了微纳尺度下对细胞三维空间内局部的温度测量，而且将量子点空间示踪与量子点光谱测温耦合为一个实时同步系统，单次操作后，由计算机对不同时刻的位置数据和温度数据进行计算、匹配、整合，实现对细胞内量子点高精度的三维空间示踪及同步测温，在实际应用中将为科研人员了解细胞内物质在三维空间的运动规律以及物质运输时实时的微小热反应变化提供一种有效的技术手段。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为量子点空间示踪测温系统示意图；
图2为量子点空间示踪测温示意图；
图3为本发明实施例示意图。
其中：1.激光器；2.第一半反半透镜；3.载物台；4.样品；5.物镜；6.第二半反半透镜；7.滤光片；8.第一透镜；9.相位片；10.第二透镜；11.第一EMCCD；12.反射镜；13.光谱仪；14.第二EMCCD；15.计算机。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“一侧”、“一端”、“一边”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明提供了一种量子点空间示踪测温系统及方法，通过搭建的量子点空间示踪测温系统，在暗场环境中，使用激光器激发标记在细胞样品中的量子点探针，通过物镜显微放大，经半反半透镜将光路一分为二后，一路采用光学相位调制的方法获取分散在样品细胞内量子点的空间位置信息，由一个EMCCD(电子倍增光电探测器)在图像模式下一定频率的采集不同时刻下的图像数据，实现量子点三维空间定位和示踪；另一路采用光谱仪获取量子点荧光强度与波长信息，由另一个EMCCD(电子倍增光电探测器)在光谱模式下同步地采集不同时刻下的光谱数据，并根据量子点的光热特性得到量子点的实时温度。最后由计算机将不同时刻下量子点的位置与温度匹配，即可完成对量子点的空间示踪测温。本发明可在活细胞内直观地获得量子点三维空间运动轨迹及其温度信息，为细胞内物质运输、传递、代谢等生化反应研究提供技术手段支持。
请参阅图1，本发明一种量子点空间示踪测温系统，包括激光器1、第一半反半透镜2、载物台3、物镜5、第二半反半透镜6、第一EMCCD11、第二EMCCD14和计算机15，激光器1发出的激发光经第一半反半透镜2和物镜5后照射到载物台3上的样品4，样品4被量子点标记过，样品4经第二半反半透镜6分两路，一路经量子点示踪光路与第一EMCCD11连接，第二路经测温光路与第二EMCCD14连接，第一EMCCD11和第二EMCCD14分别与计算机15连接。
激光器1发出固定波长的激发光经过半反半透镜2反射至载物台3上量子点标记过的样品4，使量子点光致发光，样品4经物镜5显微放大成像后被半反半透镜6分为两路光路。
量子点示踪光路包括滤光片7、第一透镜8、相位片9和第二透镜10，一路反射光路依次经滤光片7、第一透镜8、相位片9和第二透镜10与第一EMCCD11连接，反射光经过滤光片7过滤掉指定波长范围外的杂光，样品4的成像在第一透镜8的前焦面，相位片9位于第一透镜8的后焦面，同时也是第二透镜10的前焦面，精密加工而成的相位片9通过改变光程差来改变相位，其上带有用于三维定位的相位调制函数，第一EMCCD11(电子倍增光电探测器)位于第二透镜10的后焦面，第一EMCCD11与计算机15连接，用于量子点位置数据的实时采集与传输；
其中，第一透镜8与第二透镜10为焦距相等的透镜，第一透镜8、相位片9、第二透镜10和第一EMCCD11之间的位置不变。
测温光路包括依次连接的光谱仪13和第二EMCCD14，透射光路经过反射镜12进入光谱仪13和第二EMCCD14，反射镜12用于改变光路使样品4放大后的像进入光谱仪13，光谱仪13对光进行分光，获得不同波长上的荧光强度，第二EMCCD14将光谱仪13处理过的光信号转化为电信号，实时传输给计算机15。
工作原理：
样品4内的量子点成像于第一透镜8的前焦面，第一透镜8对其进行傅里叶变换并成像于后焦面，载有相位调制函数的相位片9对光进行调制，被调制的光经第二透镜10成像于EMCCD10上，通过相相位片9的调制，样品4中量子点的成像从单光斑转换为双光斑，双光斑中心连线的中点反映量子点4的横向位置(即x-y轴坐标)，连线的角度反映量子点沿激发光轴的轴向位置(即z轴坐标)，对不同时刻的量子点位置连线即为对量子点的空间示踪。
此外，样品4内量子点荧光强度的峰值波长与温度存在对应函数关系，通过光谱仪13和第二EMCCD14可得到量子点的强度谱图，带入相应的函数便可得到温度数据。
第一EMCCD10和第二EMCCD14同时触发并同频率的采集位置与温度信息，通过计算机15处理即可完成对量子点的示踪测温。
请参阅图2，本发明一种量子点空间示踪测温系统及方法，包括以下步骤：
S1、将已被量子点的细胞样品4置于载物台3上，通过目镜观察成像，调整载玻片位置，调整物镜5的工作距离使成像清晰；
S2、平移载玻片，将第一EMCCD11和第二EMCCD14设置为实时成像模式，观察并寻找量子清晰可辨的区域，在该区域中寻找分散的可识别的单个或若干量子点，将其作为测量对象，并移至视场中心，如图2(a)；
S3、在计算机15上对第一EMCCD11和第二EMCCD14设置相同的采集频率，并将与光谱仪13连接的第二EMCCD14设置为光谱模式，同时触发，激光器1采用连续激发的方式，第一EMCCD11和第二EMCCD14同步采集经过相位片9调制的量子点成像(如图2(b))和经过光谱仪13的光谱图(如图2(c))；
S4、经相位片9调制后的量子点成像由单个亮点变为带有z轴信息旋转角的双斑；然后对不同时刻采集到的图像进行处理，得到每个量子点的运动轨迹；
以图中心为坐标原点，对采集到的每张图片，分别对视场内的所有单个量子点的像进行处理；双光斑中心连线的中点确定量子点横向位置(x,y)，通过双光斑连线的角度确定量子点的轴向位置(z)，得到该图像采集时刻下，视场内所有单个量子点在该空间中的三维位置；依次对不同时刻采集到的图片进行处理，得到视场内每个量子点不同时刻的位置信息，连接不同时刻位置点坐标，便可得到每个量子点的运动轨迹(x-y-z-t)；
S5、经光谱仪13得到的光谱图包含不同波长下荧光强度的信息，计算机15根据量子点的光热特性，便可得到每个量子点的环境温度，依次对不同时刻的光谱图做上述的处理便可得到量子点环境温度与时间的关系(T-t)；
S6、因为EMCCD同时触发并同频率采集信息，因此结合步骤S4和步骤S5所得到的结果，得到量子点运动轨迹和温度的变化信息，如图2(d)。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中的描述和所示的本发明实施例的组件可以通过各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图3，实验中对某时刻单次成像及测温的过程：系统同步采集某时刻的6个量子点的双斑图像和光谱图，分别由计算机进行算法匹配和带入标定函数，从而得到该时刻6个量子点的三维空间位置与温度，计算机将连续的不同时刻的数据进行如上处理，分别将每个量子点的坐标连接，即可得到每个量子点三维空间内的运动轨迹及其温度变化，如图2(d)所示。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种量子点空间示踪测温方法，其特征在于，在暗场环境中，使用激光器激发标记在细胞样品中的量子点探针，通过物镜显微放大后再经半反半透镜将光路一分为二，一路采用光学相位调制法获取分散在样品细胞内量子点的空间位置信息，由一个EMCCD在图像模式下一定频率的采集不同时刻下的图像数据，实现量子点三维空间定位和示踪；第二路采用光谱仪获取量子点的荧光强度与波长信息，由第二个EMCCD在光谱模式下同步地采集不同时刻下的光谱数据，并根据量子点的光热特性得到量子点的实时温度，两个EMCCD分别将采集的数据发送给计算机，由计算机将不同时刻下量子点的位置与温度匹配，完成对量子点的空间示踪测温，包括以下步骤：
S1、将已被量子点标记的细胞样品置于载物台上，通过目镜观察成像，调整载玻片位置，调整物镜的工作距离使成像清晰；
S2、平移载玻片，将两个EMCCD设置为实时成像模式，观察并寻找量子点清晰可辨的区域，并在该区域中寻找分散的可识别的单个或若干量子点，将其作为测量对象，并移至视场中心；
S3、将两个EMCCD设置相同的采集频率，并将与光谱仪连接的EMCCD设置为光谱模式，同时触发，激光器采用连续激发的方式，两个EMCCD同步采集经过相位片调制的量子点成像和经过光谱仪的光谱图；
S4、经相位片调制后的量子点成像由单个亮点变为带有z轴信息旋转角的双斑；然后计算机对不同时刻采集到的图像进行处理，得到每个量子点的运动轨迹，以图中心为坐标原点，对采集到的每张图片，分别对视场内的所有单个量子点的像进行处理；双光斑中心连线的中点确定量子点横向位置，通过双光斑连线的角度确定量子点的轴向位置，得到该图像采集时刻下视场内所有单个量子点在该空间中的三维位置；依次对不同时刻采集到的图片进行处理，得到视场内每个量子点不同时刻的位置信息，连接不同时刻位置点坐标，便可得到每个量子点的运动轨迹；
S5、经光谱仪得到的光谱图包含不同波长下荧光强度的信息，计算机根据量子点的光热特性得到每个量子点的环境温度，依次对不同时刻的光谱图处理得到量子点环境温度与时间的关系；
S6、根据步骤S4和步骤S5所得到的结果得到量子点运动轨迹和温度的变化信息。
2.一种根据权利要求1所述测温方法的系统，其特征在于，包括激光器(1)，激光器(1)发出的激发光经第一半反半透镜(2)照射至样品(4)，然后通过物镜(5)显微放大后再经第二半反半透镜(6)将光路一分为二，一路经量子点示踪光路和第一EMCCD(11)后与计算机(15)连接，另一路经测温光路和第二EMCCD(14)后与计算机(15)连接，量子点示踪光路包括滤光片(7)，滤光片(7)设置在第二半反半透镜(6)和第一EMCCD(11)之间，滤光片(7)与第一EMCCD(11)之间间隔设置有第一透镜(8)、相位片(9)和第二透镜(10)，第一透镜(8)与第二透镜(10)的焦距相等，第一透镜(8)、相位片(9)、第二透镜(10)和第一EMCCD(11)之间的位置不变，样品(4)的成像在第一透镜(8)的前焦面，相位片(9)位于第一透镜(8)的后焦面，同时也是第二透镜(10)的前焦面，第一EMCCD(11)位于第二透镜(10)的后焦面。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，测温光路包括设置在第二半反半透镜(6)和第二EMCCD(14)之间的光谱仪(13)，光谱仪(13)与第二半反半透镜(6)之间设置有用于改变光路的反射镜(12)。
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