JP6422864B2 - マルチスケールスペクトルナノスコピー - Google Patents
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Description
本発明は、エネルギー局によって承認された許可番号第DE−SC0006838号の下に政府支援によって作製された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、両出願の全体が本明細書に組み込まれる、2012年7月18日に出願された米国仮出願第61/672,837号及び2013年3月5日に出願された米国仮出願第61/772,617号の優先権を主張するものである。
現代のレーザスキャニング共焦点顕微鏡は、最高8Hzでオプティカルセクションを提供する能力を有する。残念ながら、これらの速度は、3次元においてリアルタイムで発生する生物学的プロセスを評価するためには十分ではない。共焦点顕微鏡は、近共焦点性能によって最高1Hzで3D体積を捕捉することを可能にするNipkowスピニングディスクの実装によってさらに改善されている。しかしながら、これらの時間スケール(1秒以上)は、依然として、細胞レベル又は細胞内レベル(subcellular level)における化学力学をモニタするにはあまりにも遅すぎる。
大容量を高い時間分解能で撮像する問題を解決するために、選択的平面照明顕微鏡法(SPIM)は、円柱レンズによって展開され、採集対物レンズ(collection objective)に直角なサンプルに送出する励起ビームを使用して、オプティカルセクショニングを可能にする被照面を作成する。6秒ごとにニューロン活動電位の400×400×200μmの体積の高速撮像が実現されているが、軸方向分解能(axial resolution)は約5ミクロンである。この方法は、レーザビームを急速にスキャニングして照明面(illumination plane)を作成し、より強い照明とより速い捕捉時間とを可能にし、60〜90秒で1000×1000×600μmの体積を300nmの横方向分解能と500nmの軸方向分解能で捕捉することによって改善されている。
上記の方法は、発生生物学におけるより大きい力学の研究への扉を開いたが、それらは、依然として、伝搬する光線の回折的性質によって制限され、横寸法で約200nm及び次軸方向寸法で約600nmの究極的分解能限界を有する。この限界を回避するために、いわゆる「超分解能」法が開発されてきた。誘導放射抑制顕微鏡法(STED:stimulated emission depletion microscopy)は、高出力レーザパルスを使用して一定のエリア内で蛍光放射を効果的に曲げる。レーザパルスを慎重に整形して焦点周りの球形エリアを画定することで、焦点サイズが、周囲の放射の枯渇によって効率的にサイズが低減され得る。30nmまでの分解能を有する等方性焦点が、生細胞内のミトコンドリアクリステを撮像するために使用されてきた。残念ながら、これは、依然として点スキャン技法であり、より大きい空間規模における時間分解能を制限している。
他の方法は、単一のフォトスイッチング可能な蛍光体(photoswitchable fluorophore)の局在性に依存している。これらの方法(確率的光学再構築顕微鏡法、STORM:stochastic optical reconstruction microscopy;光活性化局在性顕微鏡法、PALM:photoactivated localization microscopy)が、初期に、2次元の現象を究明するために実施されたが、非点収差イメージング(STORM、横方向20〜30nm、軸方向60nm)、二重平面イメージング(biplane imaging)(BP−PALM、横方向30nm、軸方向75nm)、干渉法(interferometry)(iPALM、横方向20nm、軸方向10nm)の使用によって、又は二重らせんPSF(DH−PSF、横方向10nm、軸方向10nm)を実施することによって最高数ミクロンまでの3次元に展開されてきた。残念ながら、これらの方法はすべて、それらの軸方向の広がり(通常わずか1〜2ミクロン)又は時間分解能(PALM及びSTORMは多くのフォトスイッチング事象の観測が必要であり、単一画像を捕捉するために数十秒を必要とする)によって制限される。
本開示は、単一ナノ粒子追跡分光顕微鏡(SNTSM)によって使用可能になる3D単一粒子追跡分光法であるマルチスケールスペクトルナノスコピー(MSN)を対象とする。本技法は、極めて高い空間分解能及び時間分解能を可能にする。重要なことには、時間依存性分光能力(time-dependent spectroscopic capability)は、分子レベルの構造的変化(量子力学的領域)の研究を可能にし、空間的情報をサブnmスケールまで押し下げている。MSNシステムは、二光子レーザスキャニング顕微鏡(LSM)又は共焦点LSMなどのLSMの大規模コンテキスト情報をSNTSMの時間分解能及び空間分解能に追加して、多重スケール(multiple scales)が関連する実験に取り組むための理想的なシステムを作成する。いずれのタイプのLSMも、本明細書の開示に関連する使用に好適であることを理解されたい。
図3aは、例示的なMSNシステムの励起波長及び放射波長の一例を示すグラフである。 上述のように、単一粒子追跡は、細胞の自己蛍光が最小化される600〜750nmの近赤外(NIR)において実施され得る。一実施形態では、二光子LSMは、市販のLSMシステム(たとえば、Zeiss LSM 410)に結合された800〜1000nmで動作するフェムト秒パルスレーザ(たとえば、Tsunami、Newport)を使用する。上述のように、いくつかの波長の組合せは、LSM並びに追跡励起及び放射が重複しないという要件の下で可能である。
図6は、X−Y追跡モジュール74のブロック図である。X方向及びY方向における粒子偏移を検出するために、放射スポットがビーム分割器74gによって分割され、2つの直交するプリズムミラー、すなわちXプリズムミラー74a及びYプリズムミラー74b上に投影される。Xプリズムミラー74aは、分割された信号を、2つの単一光子計数アバランシェフォトダイオード(APD)、すなわち左APD 74c及び右APD 74dの上に分割する。Yプリズムミラー74bは、分割された信号を、上のAPD 74e及び下のAPD 74fの上に分割する。好適なAPDが、Perkin Elmerを含む多様な製造業者から入手可能である。
図7は、X−Yコンパクト垂直APD搭載台80の正面図を示すブロック図である。本明細書で使用する垂直という用語は、光学テーブルの平面に対して90°の方向を指す。図6の概略ブロック図など、従来の実施形態では、X−Y APDのすべては、光学テーブルの平面に平行に配向されている。本実施形態では、X−Y追跡に必要な4つのアバランシェフォトダイオード(APD)は、できるだけ空間を節約し、位置合わせの容易さを提供するために、垂直のブレッドボード81の両側に垂直に搭載されている。各APDは、光学テーブルの平面から垂直方向に光を反射するように構成された連携ミラー82を有する。分光法は、ビーム分割器を使用して追跡モジュールからの光を分割すること、及び分割された光をダイクロイックによって、又は分光計を使用することによって分離されたAPDのペアに案内することによって実行される。この例では、8/92反射/透過ペリクルビーム分割器が、追跡信号のうちの小部分を、追跡中に粒子をモニタするためのカメラ(Cascade 512b、Photometrics)に向けて分割するために使用される。図7では、4つのX−Y APDのうちの2つだけを示していることを理解されたい。各APDは、キネマティックミラーを介して光を合焦する連携平行移動可能な収束レンズを有する。キネマティックミラー及びプリズムミラーは、それぞれ、連携平行移動ステージを有する。図8は、X−Yコンパクト垂直APD搭載台80の側面図を示すブロック図である。図9a及び図9bは、APD搭載台80に対するコンパクト3D構成を示す図である。
この例では、3D画像の生成は、オフライン処理モジュール106を使用して示されている。多様な実施態様が、デジタル信号プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)、又はコンピュータ若しくはマイクロコントローラ上で動作するソフトウェアを含む同期モジュール104によって生成されたデータに基づいて3D画像を生成するために使用され得ることを理解されたい。
高い空間分解能及び時間分解能と大きい空間規模とのユニークなその組合せによって、MSNシステムは、微小管ベースの細胞骨格ネットワークに沿った細胞小器官追跡の動的挙動を研究するために、ユニークに適している。微小管は、細胞内で細胞小器官の移送を可能にする細胞内構造であり、同じく、細胞分裂において基本的な役割を果たす。しかしながら、生体内の微小管ベースの移送の研究は、細胞小器官が3次元らせん構造に沿って1〜2μm/secの速度で進むので、困難であった。微小管直径(25nm)は、我々のシステムの空間分解能(約10nm)の範囲内で十分であることを考えれば、MSNシステムは、細胞小器官のこの高速3D運動をリアルタイムで追跡することができることになる。その上、チューブリンサブユニットを蛍光標識化すること、及び大規模環境を評価するためにMSNの能力を活用することによって、我々は、全プロセスをその完全な3Dコンテキストにおいて可視化することができる。MSNプロトタイプは、すでに、生体細胞内のナノ粒子の運動を検出することが可能になっている。
高分解能分光法による環境検知
MSNシステムの主要な強みは、対象の粒子を常時対物レンズの焦点体積内に効果的に留める、その能力にある。粒子自体は、依然として、サンプル内を自由に移動し得る一方で、実験者は、粒子がラボフレームの中で固定されているかのように粒子及びその環境をプローブする能力を有する。これは、ナノ粒子の3D運動にもかかわらず、高精度で時間依存性の分光法が焦点体積内で実行されることを可能にする。MSNシステムは、pH、温度、並びに多種多様な化学物質及び生体高分子に反応するように設計され得る半導体量子ドットを追跡しモニタすることができる。量子ドットセンサのスペクトル読出しを分析することによって、MSNシステムは、細胞内温度、pH、及び電場など、細胞生物学のこれまで未開拓の領域に適用され得る。重要なことには、MSNシステムは、生物環境及びその機能的結果における局所的動的不均一性を検知するために必須である、高い空間分解能及び時間分解能を有するスペクトル読出しを提供することになる。たとえば、温度を検知する量子ドットは、ミトコンドリア標的化ペプチドによって不動態化され得、細胞内温度勾配を記録するために細胞質ゾル内のミトコンドリア及び制御エリアにおける高度に局所化された温度測定が可能になる。次に、細胞は、局所温度勾配が細胞の状態にいかに依存するかを確かめるために、化学的に刺激され得る。最後に、カルボニルシアニド-p-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)など、酸化的リン酸化を脱共役化するために化学薬剤を添加することが、局所温度が細胞代謝の無効性に依存するかどうかを判断することを助けることがある。ミトコンドリア温度の直接測定が、癌生物学及び神経生物学に広範囲にわたる影響を与えることができた。
タンパク質の分子配座及び反応性が細胞小器官レベル又は細胞レベルの機能に影響を与える様相を解明するためには、単に空間ロケーションを追跡するだけでは不十分である。量子力学が考慮されなければならない長さスケールにおいて発生する分子内力学を追求するために、MSNシステムは、フェルスター型共鳴エネルギー移動(FRET:Forster-type Resonance Energy Transfer)分光法、ドナーの相対強度を測定することによって研究者がタンパク質の構造及び力学を観測することを可能にした分子スケールルーラー、及び2つのアミノ酸残基の間の距離を抽出するためのアクセプタ蛍光体(acceptor fluorophore)など、敏感な分光法を使用することができる。時間依存性のFRET軌跡は、単一タンパク質レベル(単一分子FRET又はsmFRETと呼ばれる)においてさえ、フォールディング/アンフォールディング及び基質の存在における配座変化など、タンパク質の力学についての情報をもたらす。単一分子レベルのタンパク質の研究は、可観測量(the observable)が一般に母平均である伝統的なアンサンブル測定を介して観測され得ない分子状態を解明する能力を有する。しかしながら、この種の高分解能単一分子測定は、タンパク質を3D細胞環境内で追跡して観測することができないため、生体内で実現されていない。MSNシステムを細胞内環境に適用することは、単一分子測定が生物系の中でいかにして実施されるかにおける完全なパラダイムシフトを提示している。単一FRETで標識化されたタンパク質を、追跡されるナノ粒子に添付することによって、単一分子FRET測定が、細胞の外で自由に拡散することから、タンパク質がその自然状態で機能し得る細胞の内側に向かって細胞膜内の脂質ラフト上で浮遊することまで、無数の生物環境におけるタンパク質の力学を観測するために実行され得る。過渡的なタンパク質間相互作用を補足することは、多くの実験のうちの、それ以外では実施され得ない唯一の実験である。その上、これらの単一分子測定値は、MSNシステムの二光子蛍光スキャナを使用して、細胞又は多細胞生物のより大きいコンテキストの中で確認され得る。
同じく、MSNは、細胞環境における高度に局所化された変化に影響を与えるために使用され得る。金属ナノ粒子を添加することが、熱を感知する細道(thermally sensitive pathway)を活性化するための局所加熱を可能にし、又はナノスケールの光熱セラピー(photothermal therapy)を可能にする。光活性化アンケージング(photoactivated uncaging)又は光分解性リンカが、小分子、ペプチド、RNA、及びタンパク質を細胞に、高精度で送達するために使用され得る。これらのカーゴ(cargo)の送達は、ナノ粒子が生物系内の所望のロケーションに到達すると、UV光のパルスで光分解性ボンドを破壊することで実現されることになる。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載の事項を、そのまま、付記しておく。
[1] サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するためのシステムであって、
前記サンプルをスキャンするように構成された、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡(LSM)と、
粒子保持デバイスに結合された粒子を有する、X−Y及びZの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスと、
追跡励起レーザと、X−Y方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたX−Y放射収集構成要素と、Z方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたZ放射収集構成要素とを有する追跡モジュールと、
前記X−Y及びZの放射収集構成要素に結合され、前記粒子の運動を追跡するために前記ステージのX−Y及びZの位置制御を駆動するように構成された制御信号を生成するプロセッサとを備える、システム。
[2] 現在のLSMスキャニングミラー位置とLSM検出器読出しとを受信し、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたLSMピクセルを生成するように構成された同期モジュールと、ステージ位置でスタンプされた前記LSMピクセルを使用して粒子の3D軌跡を示す3D画像を生成するように構成された処理モジュールとをさらに備える、[1]に記載のシステム。
[3] 現在のLSMスキャニングミラー位置とLSM検出器読出しとを受信し、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたLSMピクセルを生成するように構成された同期モジュールをさらに備える、[1]に記載のシステム。
[4] 前記LSMシステム(実空間のピクセルサイズ)の知られている倍率及び前記サンプルの前記スキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、前記LSMシステムからの各検出器読出し(ピクセル)を、ラボフレームからサンプルフレーム内の3次元ボクセルに変換するように構成されたピクセルからボクセルへの変換モジュールをさらに備える、[2]に記載のシステム。
[5] オーバーサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成するように構成された補間モジュールをさらに備える、[4]に記載のシステム。
[6] 前記補間データを平滑化するように構成された平滑化モジュールをさらに備える、[5]に記載のシステム。
[7] 前記補間データに基づいて前記粒子の運動を示す3D画像を生成するように構成された画像生成モジュールをさらに備える、[5]に記載のシステム。
[8] 前記追跡励起レーザが光学テーブル平面に平行に搭載され、前記X−Y放射収集構成要素が前記光学テーブル平面に垂直に搭載される、[1]に記載のシステム。
[9] 各X−Y放射収集構成要素が、前記光学テーブルの前記平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有する、[8]に記載のシステム。
[10] 一方の面に搭載されたX放射収集構成要素と、反対面に搭載されたY放射収集構成要素とを有する垂直搭載面をさらに備える、[8]に記載のシステム。
[11] サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するための方法であって、
前記サンプルをスキャンするように構成された、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡(LSM)を提供することと、
粒子保持デバイスに結合された前記粒子を有する、X−Y及びZの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスを提供することと、
追跡励起レーザビームを生成し、X−Y方向及びZ方向において前記粒子の偏移を検出することと、
前記粒子の運動を追跡するために前記ステージのX−Y及びZの位置制御を駆動するように構成された制御信号を生成することとを備える、方法。
[12] 現在のLSMスキャニングミラー位置とLSM検出器読出しとを受信することと、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたLSMピクセルを生成することと、ステージ位置でスタンプされた前記LSMピクセルを使用して粒子の3D軌跡を示す3D画像を生成することとをさらに備える、[11]に記載の方法。
[13] 現在のLSMスキャニングミラー位置とLSM検出器読出しとを受信することと、それらを現在のステージ位置と同期させて、ステージ位置でスタンプされたLSMピクセルを生成することとをさらに備える、[11]に記載の方法。
[14] 前記LSMシステム(実空間のピクセルサイズ)の知られている倍率及び前記サンプルの前記スキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、前記LSMシステムからの各検出器読出し(ピクセル)を、ラボフレームからサンプルフレーム内の3次元ボクセルに変換することをさらに備える、[12]に記載の方法。
[15] オーバーサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成することをさらに備える、[14]に記載の方法。
[16] 前記補間データを平滑化することをさらに備える、[15]に記載の方法。
[17] 前記補間データに基づいて前記粒子の運動を示す3D画像を生成することをさらに備える、[15]に記載の方法。
[18] 前記追跡励起レーザビームが光学テーブル平面に平行に配向され、X−Y放射収集構成要素が前記光学テーブル平面に垂直に搭載される、[11]に記載の方法。
[19] 各X−Y放射収集構成要素が、前記光学テーブルの前記平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有する、[18]に記載の方法。
[20] 一方の面に搭載されたX放射収集構成要素と、反対面に搭載されたY放射収集構成要素とを有する垂直搭載面を提供することをさらに備える、[18]に記載の方法。
Claims (18)
- サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するためのシステムであって、
前記サンプルをスキャンするように構成され、複数のスキャニングミラーと複数の検出器を備えた、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡(LSM)と、
粒子保持デバイスに結合された粒子を有する、X−Y及びZの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスと、
追跡励起レーザと、X−Y方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたX−Y放射収集構成要素と、Z方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたZ放射収集構成要素と、前記X−Y及びZの放射収集構成要素に結合され、前記粒子の運動を追跡するために前記ステージのX−Y及びZの位置制御を駆動するための制御信号を生成するように構成されたプロセッサとを備える、追跡モジュールと、
現在のスキャニングミラー位置とレーザスキャニング顕微鏡(LSM)からの検出器読出しとを受信し、前記追跡モジュールからの現在のステージ位置を受信し、そしてステージ位置が刻まれたLSMピクセルを生成することによって、前記レーザスキャニング顕微鏡(LSM)と前記追跡モジュールを同期するように構成された同期モジュールと、を備えたシステム。 - 前記ステージ位置が刻まれた前記LSMピクセルを使用して粒子の3D軌跡を示す3D画像を生成するように構成された処理モジュールをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
- LSMシステムの知られている倍率及び前記サンプルの前記スキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、前記LSMシステムからの各検出器読出し(ピクセル)を、ラボフレームからサンプルフレーム内の3次元ボクセルに変換するように構成されたピクセルからボクセルへの変換モジュールをさらに備える、請求項2に記載のシステム。
- 複数回のサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成するように構成された補間モジュールをさらに備える、請求項3に記載のシステム。
- 前記補間データを平滑化するように構成された平滑化モジュールをさらに備える、請求項4に記載のシステム。
- 前記補間データに基づいて前記粒子の運動を示す3D画像を生成するように構成された画像生成モジュールをさらに備える、請求項4に記載のシステム。
- 前記追跡励起レーザが光学テーブル平面に平行に搭載され、前記X−Y放射収集構成要素が前記光学テーブル平面に垂直に搭載される、請求項1に記載のシステム。
- 各X−Y放射収集構成要素が、前記光学テーブル平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有する、請求項7に記載のシステム。
- 一方の面に搭載されたX放射収集構成要素と、反対面に搭載されたY放射収集構成要素とを有する垂直搭載面をさらに備える、請求項7に記載のシステム。
- サンプル中の粒子を非侵襲的に追跡するための方法であって、
前記サンプルをスキャンするように構成され、複数のスキャニングミラーと複数の検出器を備えた、二光子又は共焦点のレーザスキャニング顕微鏡(LSM)を提供することと、
粒子保持デバイスに結合された前記粒子を有する、X−Y及びZの位置制御を有するステージに結合された、粒子保持デバイスを提供することと、
追跡励起レーザと、X−Y方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたX−Y放射収集構成要素と、Z方向における前記粒子の偏移を検出するように構成されたZ放射収集構成要素と、前記X−Y及びZの放射収集構成要素に結合されたプロセッサとを備える、追跡モジュールを提供することと、
前記レーザスキャニング顕微鏡(LSM)及び前記追跡モジュールと同期するように構成された同期モジュールを提供し、前記追跡励起レーザによって追跡励起レーザビームを生成し、X−Y方向及びZ方向において前記粒子の偏移を検出することと、
前記粒子の運動を追跡するために前記ステージのX−Y及びZの位置制御を駆動するように構成された制御信号を前記プロセッサによって生成することと、
現在のスキャニングミラー位置と、レーザスキャニング顕微鏡(LSM)からの検出器読出しを受信することと、
前記追跡モジュールからの現在のステージ位置を受信することと、
前記現在のスキャニングミラー位置と検出器読出しを、前記現在のステージ位置と同期させることと、
ステージ位置が刻まれたLSMピクセルを生成することと、を備える方法。 - ステージ位置が刻まれた前記LSMピクセルを使用して粒子の3D軌跡を示す3D画像を生成することとをさらに備える、請求項10に記載の方法。
- LSMシステムの知られている倍率及び前記サンプルの前記スキャンの間の各時点における圧電ステージ位置に基づいて、前記LSMシステムからの各検出器読出し(ピクセル)を、ラボフレームからサンプルフレーム内の3次元ボクセルに変換することをさらに備える、請求項11に記載の方法。
- 複数回のサンプリングを平均したボクセル及び補間された未サンプリングボクセルを含む補間データを生成することをさらに備える、請求項12に記載の方法。
- 前記補間データを平滑化することをさらに備える、請求項13に記載の方法。
- 前記補間データに基づいて前記粒子の運動を示す3D画像を生成することをさらに備える、請求項13に記載の方法。
- 前記追跡励起レーザビームが光学テーブル平面に平行に配向され、X−Y放射収集構成要素が前記光学テーブル平面に垂直に搭載される、請求項10に記載の方法。
- 各X−Y放射収集構成要素が、前記光学テーブル平面から垂直方向に光を反射するように構成されたミラーを有する、請求項16に記載の方法。
- 一方の面に搭載されたX放射収集構成要素と、反対面に搭載されたY放射収集構成要素とを有する垂直搭載面を提供することをさらに備える、請求項16に記載の方法。
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