CN104661704B - 多量级光谱纳米显微镜 - Google Patents

Abstract

公开了一种用于非侵入式地追踪样本中的粒子的系统和方法。该系统包括2光子或者共焦激光扫描显微镜(LSM)以及耦接至具有X‑Y位置控制和Z位置控制的粒子保持设备。该系统还包括：追踪模块，具有追踪激发激光器；X‑Y辐射聚集部件和Z辐射聚集部件，被配置为在X‑Y方向上和在Z方向上检测粒子的偏差。该系统还包括耦接至X‑Y辐射聚集部件和Z辐射聚集部件的处理器，该处理器生成被配置为驱动载物台的X‑Y位置控制和Z位置控制以追踪粒子的移动的控制信号。该系统还可包括：同步模块，被配置为生成标记有载物台位置的LSM像素；以及处理模块，被配置为使用标记有载物台位置的LSM像素生成显示粒子3D轨迹的3D图像。

Description

多量级光谱纳米显微镜

本发明的政府权利

基于由能源部所授予的授权号DE-SC0006838，在政府的支持下创作本发明。政府拥有本发明的特定权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年7月18日提交的美国临时申请61/672,837和于2013年3月5日提交的美国临时申请61/772,617的优先权，将其全部内容结合于本文中。

技术领域

本发明总体上涉及用于追踪单个粒子的系统和方法，更具体地，涉及用于使单个粒子成像并且对其进行分析的系统和方法。

背景技术

本公开涉及多量级光谱纳米显微镜(Multiscale Spectral Nanoscopy)(MSN)，并且总体上涉及美国专利第7,982,194号中的公开内容-单纳米粒子追踪光谱学显微镜(SNTSM)，将其全部内容结合于本文中。在同时将分子交互作用和分子动力学置于它们的大分子生物学背景下，对生物学系统中的这些交互作用的研究长期受到不能在它们自然长度量级(下至<1nm)和与分子动力学有关的时间量级(<毫秒)层面上观察分子现象的阻碍。在上下文中对分子生物进行观察的传统方法为光学成像方法，故以最为普遍使用并且可商购的方法开始：共焦显微术(confocal microscopy)。

传统的成像方法：

当今，激光扫描共焦显微镜具有以高达8Hz提供光学切片(optical section)的能力。不幸的是，这个速度不足以评估三维空间内实时发生的生物学过程。通过尼普科夫转盘(Nipkow spinning disk)的实施方式进一步改善了共焦显微镜，这允许以高达1Hz来获取3D体积并且具有近共焦性能。然而，这样的时间量级(≥1秒)仍过于缓慢以致不能监控细胞或者亚细胞级别上的化学动态。

快速大规模3D成像方法：

为了解决对大体积进行成像的问题，利用高时间分辨率的选择性平面照明显微术(SPIM)，其使用由柱面透镜扩散并且传输给垂直于聚集物镜(collection objective)的样本的激发光束，创建允许用于光学切片的照明平面。尽管轴向分辨率为5微米的数量级，然而，已经实现了每隔6秒对400μm×400μm×200μm体积的神经元动作电位的快速成像。已通过快速扫描激光束来建立照明平面改善了这种方法，从而允许更为密集的照明和更快的获取时间，从而在60秒至90秒内以300nm横向分辨率和500nm轴向分辨率来获取1000μm×1000μm×600μm的体积。

超分辨率(superresolution)方法：

尽管上述方法已经打开了对发展的生物学中的更大动态的研究的大门，然而，其仍受到光的传播光束的衍射性质的限制，且最终分辨率限制于横向维度上的200nm的数量级和轴向维度上的600nm的数量级。为了突破这个限制，已经开发出了所谓的“超分辨率”方法。模拟发射损耗显微术(STED)使用高功率激光脉冲有效地关闭特定区域内的荧光发射。通过使激光脉冲小心地成形以限定焦点周围的球面面积，由于周围环境发光的损耗，有效地在尺寸上减少了焦点尺寸。下降至30nm分辨率的等方性的焦点已被用于使活细胞内的线粒体嵴(mitochondrial cristae)成像。不幸的是，这仍是一种点扫描技术并且在较大空间量级上具有有限的时间分辨率。

其他方法依赖于单个的光可转换荧光团的定位。最初，这些方法(随机光学重构显微术STORM、光激活定位显微术PALM)被实施为用于研究二维空间中的现象，但是，通过使用散光成像术(STORM，横向20nm–30n、轴向60nm)、双面成像术(BP-PALM，横向30nm、轴向75nm)、干涉测量术(iPALM，横向20nm、轴向10nm)、或者实施双螺旋术(DH-PSF，横向10nm、轴向10nm)，已经发展至高达几微米的三维结构。不幸的是，所有这些方法皆受到其轴向长度(通常，仅1-2微米)或者时间分辨率(PALM和STORM需要观察多个光转换事件，从而需要几十秒来获取单个的图像)的限制。

一些方法已经努力将快速3D成像与超分辨率相组合，诸如，扫描多焦点多光子4Pi共焦显微术(MMM-4Pi)，其中，将双光子激发光束分成扫描光学切片的小的子切片的16-64个细光束(beamlet)。通过将这些子区域拼合在一起并且轴向扫描该试样可以观察到小至150秒的10μm×10μm×5μm的体积，并且等方性分辨率为从100nm至140nm。旨在将超分辨率的优势与更大量级观察相组合的另一方法是结构化照明显微术(SIM)。通过在接近样本的空间频率的频率内实施激发技术，可以建立通过传统显微物镜观察到的更低拍频(beatfrequency)。该方法还显示了改善降低至～110nm的横向分辨率的能力。对于25μm×25μm×2.72μm的体积，该方法还被扩展至具有0.20Hz体积成像速率的三维(3D-SIM)。

尽管存在这些快速的超分辨率方法，然而，仍存在不能观察到的巨大范围的长度量级和时间量级。例如，诸如DH-PSF和iPALM等单个的分子方法示出了明显的空间分辨率，但是，由于其较小的轴向范围，所以其覆盖了相对较短的长度量级。很少有方法充分地解决1毫秒以下的时间量级。期望提供一种解决现有系统的这些以及其他缺点的系统和方法。

发明内容

公开了一种用于非侵入式地追踪样本中的粒子的系统和方法。该系统包括被配置为对样本进行扫描的2光子或者共焦激光扫描显微镜(LSM)。该系统还包括粒子保持设备，该粒子保持设备具有耦接至粒子保持设备的粒子，该粒子保持设备耦接至具有X-Y位置控制和Z位置控制的载物台。该系统还包括：追踪模块，具有追踪激发激光器；X-Y辐射聚集部件(radiation-gathering component)，被配置为在X-Y方向上检测粒子的偏差(deviation)；以及Z辐射聚集部件，被配置为在Z方向上检测粒子的偏差。该系统还包括耦接至X-Y位置控制和Z位置控制的处理器，该处理器生成被配置为驱动载物台X-Y位置控制和Z位置控制以追踪粒子的移动的控制信号。

该系统还可包括：同步模块，被配置为接收当前LSM扫描镜位置和LSM检测器读出(readout，读数)并且使它们与当前载物台位置同步以生成标记有载物台位置的LSM像素；以及处理模块，被配置为使用标记有载物台位置的LSM像素生成显示粒子的3D轨迹的3D图像。该同步模块可被配置为接收当前LSM扫描镜位置和LSM检测器读出并且使它们与当前载物台位置相同步以生成标记有载物台位置的LSM像素。像素至体素转换模块(pixel tovoxel conversion module)可被配置为基于LSM系统的已知放大倍率(实际空间像素大小)和样本扫描期间的各个时间点的压电载物台位置将来自LSM系统的各个检测器读出(像素)的实验帧(lab frame)转换成样本帧(sample frame)中的三维体素(voxel)。插值模块可被配置为生成包括平均过采样体素和插值未采样体素的插值数据。平滑化模块可被配置为使插值数据平滑化。图像生成模块可被配置为基于该插值数据生成显示粒子的移动的3D图像。

追踪激发激光器可被安装为平行于光学台(optical table)平面并且X-Y辐射聚集部件相对于光学台平面被垂直安装。各个X-Y辐射聚集部件可具有被配置为将来自光学台的平面的光反射至垂直定向的反射镜。垂直安装面可具有安装在一侧的X辐射聚集部件和安装在相对侧的Y辐射聚集部件。

还公开了一种用于非侵入式地追踪样本中的粒子的方法。该方法包括设置被配置为对样本进行扫描的2光子或者共焦激光扫描显微镜(LSM)。该方法还包括设置粒子保持设备，该粒子保持设备具有耦接至粒子保持设备的粒子，该粒子保持设备耦接至具有X-Y位置控制和Z位置控制的载物台。该方法还包括生成追踪激发激光束并且在X-Y方向和Z方向上检测粒子的偏差。该方法还包括生成被配置为驱动载物台的X-Y位置控制和Z位置控制以追踪粒子的移动的控制信号。

该方法还可包括接收当前LSM扫描镜位置和LSM检测器读出并且使它们与当前载物台位置同步以生成标记有载物台位置的LSM像素；并且使用该标记有载物台位置的LSM像素生成显示粒子的3D轨迹的3D图像。该方法还可包括接收当前LSM扫描镜位置和LSM检测器读出并且使它们与当前载物台位置同步以生成标记有载物台位置的LSM像素。该方法还可包括基于LSM系统的已知放大倍率(实际空间像素大小)以及在对样本扫描期间的每个时间点上的压电载物台位置将每个检测器读出(像素)从LSM系统的实验帧转换至采样帧中的三维体素。该方法还可包括生成包括平均过采样体素和插值未采样体素的插值数据。该方法还可包括使插值数据平滑化。该方法还可包括基于该插值数据生成显示粒子的移动的3D图像。

追踪激发激光束可被定向为平行于光学台平面，并且X-Y辐射聚集部件相对于光学台平面被垂直安装。每个X-Y辐射聚集部件可具有被配置为将来自光学台的平面的光反射至垂直定向的反射镜。该方法还可包括设置垂直安装面，该垂直安装面具有安装在一侧的X辐射聚集部件和安装在相对侧的Y辐射聚集部件。

附图说明

图1是MSN系统的框图；

图2是被配置用于MSN系统的显微镜座(microscope stand)的框图；

图3a是示出了示例MSN系统的激发波长和发射波长的示例的图表；

图3b是2P-LSM的框图；

图4是追踪模块的框图；

图5是Z追踪模块的框图；

图6是X-Y追踪模块的框图；

图7是X-Y紧凑型垂直APD装置的框图(正视图)；

图8是X-Y紧凑型垂直APD装置的框图(侧视图)；

图9a和图9b是示出了用于X-Y追踪检测的紧凑型3D架构的示图；

图10是示出了用于MSN系统的数据流的框图；

图11是示出了粒子的3D轨迹的3D图像。

具体实施方式

多量级光谱纳米显微镜(MSN)

本公开涉及多量级光谱纳米显微镜(MSN)，使得能够通过单纳米粒子追踪光谱学显微镜(SNTSM)进行3D单个粒子追踪光谱术。该技术允许极其高的空间分辨率和时间分辨率。重要的是，时间依赖的光谱学能力提供了对分子级的结构变化的研究(量子力学领域)，从而将空间信息向下推动至亚纳米量级(sub-nm scale)。该MSN系统将诸如2光子LSM或者共焦LSM等激光扫描显微镜(LSM)的大量上下文信息添加到SNTSM的时间分辨率和空间分辨率，从而建立用于解决其中涉及多个量级的实验的理想系统。应当理解的是，任意类型的LSM均适合于结合本文中的公开内容而使用。

通常，MSN将通过原始SNTSM设计所给予的高的空间分辨率和时间分辨率与通过LSM(例如，2光子扫描荧光显微镜)提供的大量上下文信息相组合。这是能够覆盖从粒子追踪超高分辨率(～10nm)达到利用2光子扫描荧光显微镜实现的多细胞量级的长度量级，以及范围从微秒至分和小时的时间量级的第一显微镜系统-这是真正的多量级能力。

该原始SNTSM系统通过使用快速3D压电载物台和移动整个样本以抵消纳米粒子的移动的光反馈回路，使得其可以执行实时的三维单纳米粒子追踪。尽管存在纳米粒子仍免于探测其局部环境的事实，然而这导致纳米粒子被有效地“保持”在显微镜物镜的焦点内。这种原始的实施方式实现了高的空间(～10nm)分辨率和时间(下至10μs)分辨率。除了高的时空分辨率之外，由于纳米粒子始终被保持在物镜的焦点内的事实，故SNTSM系统最为重要的方面在于对纳米粒子探针执行高度敏感光谱学技术的能力。这允许用户探测单个的移动纳米粒子的性能或者其环境，并且已经用于探测在溶液中自由扩散的单个的金纳米粒子的光谱性能。

尽管其存在多个强度，该SNTSM系统不能评估纳米粒子追踪探针的较大规模的环境。该SNTSM是基于仅评估物镜的焦点体积的改良型共焦显微镜。这允许SNTSM系统使用快速、单点光电探测器来执行反馈回路，而非仅依赖于相对缓慢的电荷耦合的显示成像设备。然而，这个速度以大量的上下文信息为代价。为了克服缺乏大量上下文的问题，该MSN系统将SNTSM的功率与扫描2光子显微镜相组合。该SNTSM能够从纳米粒子探针获取高精确度的空间、时间以及光谱数据，同时，2光子扫描显微镜提供关于环境的大量信息。使用2光子荧光允许显微镜呈现高分辨率的光学切片，并且纳米粒子探针对样本内的不同深度进行采样。还可使用具有光学切片功能的共焦LSM来实施MSN。

该MSN是一种非常适用于生物系统的系统。生物学问题本质上就是多量级的，从纳米量级的蛋白质的运动和它们的生物学反应至亚微型量级的细胞器官、至100μm量级放入细胞间信令的运动的范围。该MSN系统能同时观察所有的这些现象。同时，该MSN系统承载原始SNTSM设计的光谱功率，从而允许用户使用本领域的单个的分子光谱学来深入探测其中量化力学效应占主导的长度量级

图1是MSN系统20的基本框图。在该实例中，该系统总体上包括与显微镜座50互连的2光子或者共焦激光扫描显微镜(LSM)30，以及追踪模块70。在将LSM的功率与SNTSM系统相组合时所实施的重要原理是对来自各个系统的信号进行光谱分离。粒子追踪模块不得不受到扫描2光子光束或者由环境所生成的任意荧光的影响。可以以从600nm至750nm的近红外线(NIR)来执行单个粒子追踪，其中使细胞的自身荧光最小化。在一个实施例中，2光子LSM使用耦接至商用LSM系统(例如，蔡斯(Zeiss)LSM 410)的在800nm与1000nm之间操作的飞秒脉冲激光器(例如，纽波特的Tsnumai)。当对共焦LSM进行配置时，可以使用连续波(CW)激光器激发。

图2是被配置用于MSN系统的显微镜座50的框图。该显微镜座50包括：样本保持器52(即，粒子保持设备，具有耦接至粒子保持设备的粒子)；以及载物台54，被配置为提供X-Y位置控制和Z位置控制。在该实例中，载物台54包括3D压电载物台54a和粗调整载物台54b。应当理解的是，其他载物台配置适合于与本文中公开的配置一起使用。例如，用于MSN系统的合适载物台可具有0.1nm分辨率的75×75×50μm³的体积大小。载物台54被配置为相对于物镜56来移动样本保持器(以及样本或者粒子)。在一个实例中，尽管各式各样的物镜适合用于本文中公开的配置，该物镜是蔡斯100倍PlanApo。该显微镜座50还包括组合二向色滤光片58，该组合二向色滤光片被配置为将2光子激发光和发射光(400nm–600nm)全反射至2P-LSM 30/全反射来自2P-LSM 30的2光子激发光和发射光(400nm–600nm)，并且还将与追踪模块相关的所有光传输至追踪模块70。应当理解的是，组合二向色滤光片的选择由所选择的用于追踪LSM的波长确定并且可根据应用而变化。

图3a是示出了实例MSN系统的激发波长和发射波长的实例的图表。如上所述，可以以从600nm–750nm的近红外线(NIR)来执行单个粒子追踪，其中，使细胞的自身荧光最小化。在一个实施例中，2光子LSM使用耦接至商用LSM系统(例如，蔡斯LSM 410)的在800nm与1000nm之间操作的飞秒脉冲激光器(例如，纽波特的Tsnumai)。如上所述，根据使LSM与追踪激发和发射不重叠的要求而可以具有多个波长组合。

图3b是2P-LSM 30的框图。该2P-LSM 30总体上包括耦接至激光扫描显微镜34(例如，LSM技术公司的蔡斯LSM 410，)的被转换成期望频率(例如，900nm)的超快速脉冲激光源(例如，纽波特Tsunami)。LSM单元内的扫描镜34a通过100倍物镜(例如，蔡斯)对样本上的脉冲激光进行光栅扫描。通过同一组反射镜对收集的两个光子激发荧光进行去扫描(descanne)并且使其聚焦于三个光电倍增管(PMT)检测器34b上，可以从多个光谱窗口读出同步信号。总之，根据期望的实验，可以使用任意数目的检测信道来实施LSM模块。

图4是追踪模块70的框图。如图4所示，追踪模块70总体上包括追踪激发激光器71、监控器CCD 72、光谱学模块73、X-Y追踪模块74以及Z追踪模块75，其全部经由分光镜70a-70d耦接至来自2P-LSM 30的光路。用于追踪模块的光可耦合至2P-LSM 30的入射端口侧，并且移除镜筒透镜允许访问物镜的无限路径。在一个实例中，追踪激发激光器为642nm的二极管(相干体(Coherent Cube))，其通过655nm的长通二向色性镜71a与追踪发射光相分离。粒子发射被发送至从原始SNTSM设计所获得追踪光学器件。这个实施方式被修改为将追踪系统的整体覆盖范围减少至3’×1.5’的区域。

图5是Z追踪模块75的框图。使用经由两个物镜75b(例如，60倍物镜)成像至雪崩光电二极管(APD)75c上的略微偏移的针孔75a来监控Z(光轴)方向上的粒子偏差，从而将接近线性的指数给出为Z上的偏差。Z APD输出可相对于下面所论述的四个X‐Y APD而被标准化。

图6是X-Y追踪模块74的框图。为了检测X方向和Y方向上的粒子偏差，发光点被分光镜74g分隔并且投影到两个正交棱镜反射镜(X棱镜反射镜74a和Y棱镜反射镜74b)上。该X棱镜反射镜74a将分隔信号分开至两个单光子计算雪崩光电二极管(APD)(左侧APD 74c和右侧APD74d)中。该Y棱镜反射镜74b将分隔后的信号分开至顶部APD 74e和底部APD 74f上。可以从包括帕金埃尔默股份有限公司(Perkin Elmer)的各个制造商获得合适的APD。

可以使用如图6中所示的各种聚焦透镜。来自XYZ分光镜70d的输出(图4)被引导至包括回射器74i的紧凑折叠式光悬臂74h以提供用于分光镜74g的信号。通过空间滤光片74k和各个聚焦透镜还可引导来自XYZ分光镜70d的输出。

当粒子相对于X轴或者Y轴位于中部时，左侧APD、右侧APD或者顶部APD、底部APD具有相等的读出。当粒子从中心位置偏离时，APD中的一个将显示与另一个有关的增强信号并且(通过两个检测器的强度总和来进行标准化)这种差异被用作用于反馈控制的误差读出。

在一个实施例中，如图10中所示，来自X、Y以及Z追踪APD的信号被反馈至场可编程门阵列(例如，国家仪器的FPGA，NI PCIe‐7852R)，其中，APD计数被过滤并且使用比例、积分以及微分(PID)算法被转换成控制信号。这些控制通过FPGA被输出作为发送至3D压电载物台的模拟电压以完成反馈回路。该回路可以以100kHz(10μs)操作，因此，可以追踪并且由载物台补偿快速运动。在一个实施例中，静态粒子的定位精确度在X上为～10nm并且在Y和Z上为～13nm。可以在FPGA上执行追踪和2P‐LSM数据的注册。2P-LSM 30上的分支电缆(breakout cable)可以允许直接测量的像素时钟和光电倍增管(PMT)电压，然后使像素时钟和光电倍增管(PMT)电压与各个体素(voxel)的读出时间的载物台位置相关联，从而允许将各个体素从实验帧(lab frame)转换成样本帧。

图7是示出了X-Y紧凑型垂直APD装置80的正视图的框图。本文中所使用的术语“垂直”指代相对于光学台的平面为90°定向。在诸如图6中的示意性框图等传统实施例中，所有的X-Y APD被定向成平行于光学台的平面。在该实施例中，X-Y追踪所需的四个雪崩光电二极管(APD)被垂直安装在垂直电路试验板81的每一侧上，以尽可能多地节省空间并且使得易于进行校准。各个APD具有关联反射镜82，该关联反射镜被配置为将来自光学台的平面的光反射至垂直方向。通过使用分光镜对来自追踪模块的光进行分隔并且将其引导至通过二向色性进行分离的APD对或者通过使用光谱仪执行光谱分析。在该实例中，使用8/92的反射/透射薄膜分光镜将追踪信号的一小部分分隔至用于在追踪期间监控粒子的照相机(光度计Cascade 512b)。应当理解的是，在图7中仅示出了4个X-Y APD中的2个。各个PAD具有通过运动学反射镜(kinematic mirror)聚集光的相关联的可平移聚焦透镜。运动学反射镜和棱镜反射镜均具有相关联的平移载物台。图8是示出了X-Y紧凑型垂直APD装置80的侧视图的框图。图9a和图9b是示出了用于APD装置80的紧凑式3D架构的示图。

图10是示出了用于MSN系统的数据流的框图。追踪模块70使用追踪模块APD检测粒子在X、Y以及Z位置上的偏差。追踪模块APD输出端耦接至处理器100。在该实施例中，处理器被实施为FPGA。FPGA或者处理器将来自追踪模块的检测器信号转换成描述粒子位置距物镜焦点的偏差的误差函数。使用由方框102整体示出的比例、积分以及微分(PID)解决方案来处理误差信号。由FPGA输出这些控制信号作为发送至载物台54a的模拟电压，以完成反馈回路。载物台54a移动样本以抵消粒子的运动并且使误差函数最小化。应当理解的是，可以以包括模拟电路、数字信号处理器、场可编程门阵列(FPGA)或者在计算机或者微控制器上运行的软件等各种方式来实施反馈生成电路。该回路可以以100kHz(10μs)操作，因此，可以通过载物台对快速运动进行追踪和补偿。在一个实施例中，静态粒子的定位精确度在X上为～10nm并且在Y和Z上为～13nm。

当粒子被保持在物镜焦点内时，双光子或者共焦激光扫描显微镜30对当前光学切片进行扫描。当LSM激发光束移动通过样本(例如，荧光染色细胞)时，该样本还会被追踪系统移动，并且通过样本的移动将损坏通过双光子或者共焦LSM所收集的图像。为了提取真正的局部三维图像，将LSM扫描镜的当前位置(即，LSM光学切片内的线位置和像素位置)和LSM检测器读出发送至FPGA或者处理器单元，其中，它们与如通过方框104整体示出的当前载物台位置同步。通过标记包含从LSM读出的各个像素的数据集合(包括像素、线和帧值、检测器读取以及压电载物台读出)来实现此操作。在FPGA或者处理器板上完成此处理并且在后处理中完成所有的后续处理，而在该实施方式中，在MATLAB中执行该实施方式。

使用扫描反射镜位置、双光子或者共焦LSM系统(实际空间像素大小)的已知放大倍率以及实验过程中各个时间点的压电载物台位置，将来自LSM系统的各个检测器读出(像素)从实验帧(其中，样本正在移动并且粒子是静止的)转换成样本帧(其中，如通过方框110所示，样本现在是静止的)中的三维体素。为了实现此操作，其中，由追踪模块保持粒子的点被称之为LSM上的特定线路和像素值。在该实施方式中，追踪与LSM单元对准，使得粒子被保持在LSM图像的中间处。在该实例中，所收集的图像具有512个像素和512个线(任意组合均是可能的)并且将追踪点定位在像素256和线256处。然后将其用作测量LSM扫描仪的位置和任意给定点处的追踪粒子的参考点。在给定像素P和线L处，通过参考点对该位置(此处的像素256、线256)进行补偿。然后，使用通过光学选择确定的LSM系统中已知的像素大小来将像素/线距离转换成实际距离。在该实施方式中，像素大小为83.1nm，但是可以是值的范围。我们可以利用该值将像素值和线值转换成用于各个LSM读取的实际空间X值和实际空间Y值。通过压电载物台上的当前Z读取来确定Z值。从而给出描述关于追踪粒子的3D环境的一组3D体素。

当粒子随机穿过样本的不同区域时，对该组3D体素进行不均匀地采样。因此，在保持其他未被采样的同时，可以对体素进行多次采样。为了建立3D图像，取这些过采样体素的平均数，同时，插值算法被用于估计用于未被采样的体素的值。因此，3D图像经过共同的图像处理技术进行处理，诸如由方框112整体上示出的平滑化处理。3D图像可以与(通过压电载物台读出所观察到的)粒子轨迹的轨迹相组合，以创建3D多量级、多分辨率数据集合。利用3D图像的大量低分辨率信息来实现粒子轨迹的小量级、高分辨率(～10nm、～10μs的数据)，根据对LSM系统的放大倍率的选择，其可以高达至～100微米。图11是示出了上述所述粒子的3D轨迹的3D图像。在该实例中，图像示出了附着在巨噬细胞(macrophagecell)上的自由扩散93nm的近红外荧光纳米粒子。

在该实例中，示出了使用离线处理模块106生成3D图像。应当理解的是，基于通过包括数字信号处理器、场可编程门阵列(FPGA)或者在计算机或微控制器上运行的软件的同步模块104，可以使用各种实施方式生成3D图像。

在一个实施例中，在LabVIEW中执行针对所有仪器的界面。这种控制实施卡尔曼滤光片、PID控制或者与共焦数据同步。通过直接读取LSM内的PMT电压来实现共焦数据。然后，离线调整数据以补偿关于像素位置的载物台移动的影响。

对于追踪模块，重要的限制因素是压电载物台的速度和荧光探针的光稳定性。当前压电技术的状况将追踪限制到纯水溶液中的60nm的纳米粒子。这仅仅是载物台对来自追踪系统的信号做出响应而非缺少光子的时间函数。先前的SNTSM系统示出了单量子点以粘性介质形式提供将被追踪的足够的光子。这减小了在生物系统上的阻碍，其中，细胞内环境的拥挤特性使得扩散明显变得缓慢。

荧光探针的光稳定性和寿命也对仪器产生限制。由于追踪探针的持续照明，故需要稳健的发射器，排除使用有机荧光团或者荧光蛋白质。量子点极其稳健，但是，在其发射方面显示间歇性，从而使得追踪变得困难。通过使用由多个量子点构成的探针以提高始终有一个发射的概率可以解决此问题。此外，最近研究表明通过认真控制量子点结构可以减少或者消除间歇性。

MSN系统可以被实施为用于具有生物学专科的研究团体和企业的商用级显微镜。该系统可被整体封包为一体化系统或者追踪模块可以作为任意共焦显微镜系统的附加设备出售，许多生物学团体已经应用了此附加设备。较小覆盖区域的新追踪模块使得更易于实施。现有的共焦显微镜仅需要添加压电载物台并且访问物镜的无限路径以添加在追踪模块上并且制作功能完备的MSN系统。应当理解的是，在包括但不限于本文中所列出的各种应用中可以使用MSN系统。

细胞动力学阐述：

由于其高的空间分辨率和时间分辨率与较大空间尺度的独特组合，该MSN系统独有地适合于研究沿着基于微管的细胞骨架网络运输细胞器官的动力学行为。微管是允许传输细胞内的细胞器官并且在细胞分离时还起到基础作用的亚细胞结构。然而，具有沿着它们三围螺旋状结构以1-2μm/s的速度前进的细胞器官，使体内基于微管的运输的研究变得困难。给定微管直径(25nm)仍在我们系统的空间分辨率(～10nm)内，则MSN系统能够实时追踪细胞器官的快速3D运动。而且，通过荧光加标签于微管蛋白子单元并且利用MSN能力来评估大规模的环境，我们将能够看到其整个3D上下文的整个处理。MSN原型已经能够检测活细胞内纳米粒子的运动。

通过高分辨率光谱学进行环境感测：

该MSN系统的主要优势在于其始终有效地保持感兴趣的粒子位于物镜的焦点体积内的能力。粒子本身仍可在样本内自由地移动，而实验人员有能力对粒子及其环境进行探测，如同粒子在实验帧内是静止的。尽管存在纳米粒子的3D运动，然而，这允许在焦点体积内执行高精确度的时间相似光谱分析。MSN系统可追踪并且监控在工程上被视为对pH、温度以及一系列化学和生物高分子敏感的半导体量子点。通过分析量子点传感器的光谱读出，可将MSN系统应用于迄今为止未开发的细胞生物学领域，诸如亚细胞温度、pH以及电子领域。重要的是，MNS系统提供具有高的空间分辨率和时间分辨率的光谱读出，其基本用于感测生物学环境的局部动态不均匀性及其功能结果。例如，利用线粒体靶向肽可以使温度敏感量子点钝化，从而允许在线粒体和细胞溶质的控制区域处进行高度定位温度测量以记录细胞间温度梯度。然后，可以化学形式刺激细胞以查看局部温度梯度如何依赖于细胞的状态。最后，将化学试剂添加到诸如羰基氰化对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)等解偶联的氧化磷酸物，可有助于确定局部温度是否依赖于细胞新陈代谢的低效率。直接测量线粒体温度可对癌症生物学和神经生物学产生深远的影响。

体内单分子动力学：

为了阐述蛋白质的分子构造和反应堆细胞器官或者细胞级功能的影响的方式，仅追踪空间定位是不够的。为了遵循分子内动力学，即在其中必须考虑量子力学的长度量级上发生的分子动力学，该MSN系统可采用诸如Forster型共振能量转移(FRET)光谱学、能够使研究人员通过测量捐赠者和接受者荧光团的相对强度来观察蛋白质结构和动力学以提取两个氨基酸残留物之间的距离的分子级规则等敏感的光谱学方法。即使在单蛋白质级(被称为单分子FRET或者smFRET)变化时，时间依赖FRET轨迹生成关于蛋白质动力学的信息，诸如存在培养基时的折叠/未折叠以及构象变化。对单分子级的蛋白质的研究使得有能力阐述通过传统的整体测量不能观察到的分子状态，其中，可观察到的通常指总平均值。然而，由于在3D细胞环境中不能追踪和观察蛋白质，故还未实现这种高分辨率的单分子测量。将MSN系统应用于细胞间环境表示在生物学系统中完成单分子测量层面上的完整范式转移。通过将单FRET标记的蛋白质附接至追踪纳米粒子，可以执行单分子FRET测量以在多个生物学环境中观察蛋白质动力学，即，从细胞外自由扩散至在细胞膜上的脂筏(lipidraft)上浮动至其中蛋白质可在其自然状态下作用的细胞内。捕捉瞬态蛋白质间交互作用是不能以其他方式完成的多个实验之一。而且，使用MSN系统的2光子荧光扫描仪可以将这些单分子测量放置于细胞或者多细胞器官的更大背景中。

影响细胞环境中的变化：

该MSN还可用于影响细胞环境中的高度局部化变化。附接金属纳米粒子可允许局部加热来以热量形式激活敏感路径或者能够进行纳米级光热治疗。可以使用光激活释放或者光分裂链接器以较高的精确度将较小的分子、缩氨酸、RNA以及蛋白质传输给细胞。一旦纳米粒子到达生物学系统内的期望位置时，利用UV光的脉冲在不破坏光分裂键的情况下，可以实现这些物质的传输。

如同本文中完整阐述的，本文中所列出的引用文件也是本申请的一部分并且通过引用将其全部内容结合在此。应当理解的是，基于本公开可以进行多种变化。尽管上述的在特定组合中描述了各种特征和元件，然而，在没有其他特征和元件的情况下可以单独使用各个特征或者元件、或者结合或者不结合其他特征和元件以各种组合形式使用。在整合到用于由通用计算机或者处理器执行的非易失性计算机可读存储介质中的计算机程序、软件、或者固件中可以实现本文中所提供的方法或者流程图。计算机可读存储介质的实例包括只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、寄存器、缓存存储器、半导体存储设备、诸如内部硬盘和可移动磁盘等磁性介质、磁光学介质以及诸如CD-ROM光盘、数字通用磁盘(DVD)等光学介质。

Claims (9)

1.一种用于非侵入式地追踪样本中的粒子的系统，包括：

被配置为对所述样本进行扫描的2光子或者共焦的激光扫描显微镜(LSM)，包括：

多个扫描镜；以及

多个检测器；

粒子保持设备，具有耦接至所述粒子保持设备的所述粒子，所述粒子保持设备耦接至具有X-Y位置控制和Z位置控制的载物台；

追踪模块，包括：

追踪激发激光器；

X-Y辐射聚集部件，被配置为在X-Y方向上检测所述粒子的偏差；

Z辐射聚集部件，被配置为在Z方向上检测所述粒子的偏差；以及

处理器，耦接至所述X-Y辐射聚集部件和所述Z辐射聚集部件，所述处理器被配置为生成用于驱动所述载物台的X-Y位置控制和Z位置控制以追踪所述粒子的移动的控制信号；以及

同步模块，被配置为通过以下方式同步所述LSM和所述追踪模块：

从所述LSM接收当前扫描镜位置和检测器读出；

从所述追踪模块接收当前载物台位置；并且

生成标记有载物台位置的LSM像素。

2.根据权利要求1所述的系统，进一步包括处理模块，所述处理模块被配置为使用标记有所述载物台位置的LSM像素生成显示所述粒子的3D轨迹的3D图像。

3.根据权利要求2所述的系统，进一步包括像素至体素转换模块，所述像素至体素转换模块被配置为基于LSM系统的已知放大倍率以及在对所述样本进行扫描期间的各个时间点的压电载物台位置将各个检测器读出从实验帧转换成样本帧中的三维体素。

4.根据权利要求3所述的系统，进一步包括插值模块，所述插值模块被配置为生成包括平均过采样体素和插值未采样体素的插值数据。

5.根据权利要求4所述的系统，进一步包括平滑化模块，所述平滑化模块被配置为使所述插值数据平滑。

6.根据权利要求4所述的系统，进一步包括图像生成模块，所述图像生成模块被配置为基于所述插值数据生成显示所述粒子的移动的3D图像。

7.根据权利要求1所述的系统，其中，所述追踪激发激光器被安装为平行于光学台平面，并且所述X-Y辐射聚集部件相对于所述光学台平面被垂直安装。

8.根据权利要求7所述的系统，其中，各个所述X-Y辐射聚集部件具有被配置为将来自所述光学台平面的光反射至垂直方向的反射镜。

9.根据权利要求7所述的系统，进一步包括垂直安装面，所述垂直安装面具有安装在一侧的X辐射聚集部件和安装在相对侧的Y辐射聚集部件。