BR112012025587B1 - Processo de detecção de um acúmulo de partículas biológicas - Google Patents

Abstract

processo de detecção de um acúmulo de partículas biológicas. a presente refere-se a processo de detecção de um acúmulo de partículas biológicas (12) sobre uma superfície (11), comportando as etapas que consistem em: a. determinar (e1) uma representação topográfica (20) dessa superfície; b. detectar (e3,e4) sobre essa representação topográfica pelo menos um contorno que delimita uma região capaz de corresponder a um acúmulo de partículas biológicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO DE DETECÇÃO DE UM ACÚMULO DE PARTÍCULAS BIOLÓGICAS.

[001] A invenção refere-se a um processo de detecção de um acúmulo de partículas biológicas, tais como micro-organismos (bactérias, leveduras, fungos...) ou células vegetais ou animais, sobre uma superfície, por exemplo, a superfície de um meio de cultura ou de um substrato funcionalizado. Essas partículas apresentam dimensões microscópicas, tipicamente da ordem de 0,5 pm a 3 mm, e, mais particularmente, de 0,5 pm a 10 pm.

[002] A invenção se aplica, em particular, à detecção de colônias de micro-organismos.

[003] Para numerosas aplicações, deseja-se detectar o mais cedo possível o crescimento de micro-organismo, tais como bactérias ou lêvedos sobre um meio de cultura, mais freqüentemente uma superfície de gel nutritivo. Em geral, a superfície de um meio e cultura gelosado se afasta notavelmente de uma planeidade perfeita, pois ela apresenta freqüentemente defeitos locais de alguns micrometros (mm) de profundidade sobre distâncias de alguns milímetros (mm). Poeiras ou restos fornecidos ao mesmo tempo que a amostra podem também introduzir deformações locais de elevada freqüência espacial da superfície.

[004] As bactérias e lêvedos dificilmente são marcáveis no início de seu crescimento, pois sua absorção é muito pequena nos domínios do visível, do próximo ultravioleta e do próximo infravermelho, e seu índice de refração muito próximo daquele de seu meio ambiente. Assim tipicamente só as colônias tendo um diâmetro superior a 100 pm são detectáveis a olho nu; o tempo necessário ao crescimento de colônias dessas dimensões é tipicamente da ordem de 6 a 24 horas (h).

[005] O exame microscópico impulsionado, de preferência em

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2/18 fundo escuro, é uma via possível, mas difícil de aplicar.

[006] Outras técnicas são comumente aplicadas.

[007] Por exemplo, é possível tornar os micro-organismos fluorescentes por diferentes aditivos não-fluorescentes que o metabolismo dos micro-organismos transforma em uma substância fluorescente, escolhida para permanecer longo tempo no interior dos micro-organismos. Esse processo exige um tempo bastante longo (> 5 horas, antes que as bactérias se tornem fluorescentes e o desenvolvimento de um metabólito fluorógeno.

[008] Da mesma forma, meios cromógenos permitem visualizar os micro-organismos de maneira seletiva, mas o mesmo problema é encontrado: a coloração reclama um tempo bastante longo (várias horas) antes de ser visível a olho nu.

[009] Além disso, todos esses processos correm o risco de fornecer perturbações sérias ao metabolismo dos micro-organismos, enquanto que a seqüência dos testes (por exemplo, medida da sensibilidade aos antibióticos) exige um desenvolvimento dos microorganismos, nas condições as mais favoráveis.

[0010] A invenção visa a prevenir os inconvenientes pré-citados, oferecendo um processo de detecção de u acúmulo de partículas biológicas tão pouco intruso quanto possível e permitindo a detecção precoce de um acúmulo de pequenas dimensões tais como colônias de micro-organismos no início de seu crescimento.

[0011] De acordo com a invenção, essa finalidade é atingida por um processo de detecção de acúmulo de partículas biológicas sobre uma superfície, comportando as etapas que consistem em:

a. determinar uma representação topográfica dessa superfície;

b. detectar sobre essa representação topográfica pelo menos um contorno que delimita uma região capaz de corresponder a

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3/18 um acúmulo de partículas biológicas.

[0012] Essas etapas são utilizadas com o auxílio de um computador programado de maneira oportuna ou de um outro meio eletrônico de tratamento dos dados, associado (notadamente para a execução da etapa a) a um dispositivo de medida apropriado.

[0013] Segundo modos de realização vantajoso da invenção:

- essas partículas biológicas podem ser escolhidos dentre micro-organismos, tais como bactérias, leveduras ou fungos, e células vegetais ou animais;

- essas partículas biológicas podem apresentar um diâmetro ou uma dimensão principal compreendida entre 10 pm e 3 pm, ou, preferencialmente, inferior ou igual a algumas centenas de 100 pm, e, por exemplo, inferior ou igual a 100 pm;

- essa superfície pode ser escolhida dentre: a interface entre u meio de cultura e um meio ambiente, tal com o ar, a superfície de um substrato funcionalizado ou a superfície de uma membrana microporosa;

- essa etapa a consistindo em determinar uma representação topográfica dessa superfície pode ser utilizada por um processo óptico que é aplicado sem contato e sem preparo da amostra, a fim de assegurar uma intrusividade mínima. Pode tratar-se em particular de um processo de microtopografia confocal cromática ou estrioscopia ou ombroscopia;

- essa etapa b consistindo em detectar pelo menos um contorno pode ser utilizada por medida da inclinação local dessa representação topográfica da superfície, com limitação;

- o processo pode comportar também uma operação de prétratamento dessa representação topográfica que comporta a detecção e a subtração de uma superfície de referência;

- o processo pode comportar a repetição das etapas a e b

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4/18 em tempos sucessivos, e a seleção das únicas regiões identificadas nas etapas b, cuja forma ou cujo tamanho evolui no tempo.

[0014] De acordo com uma variante vantajosa da invenção, o processo pode comportar uma etapa suplementar c que consiste em quantificar um indicador relativo ao tamanho de um acúmulo detectado, por exemplo, seu volume. Isto apresenta notadamente interesse, quando o tamanho médio das partículas biológicas de interesse é conhecida. Com efeito, nesse caso, essa etapa c permite avaliar a quantidade de partículas biológicas presentes no acúmulo. Com efeito, conhecendo o tamanho médio das partículas biológicas de interesse, consideradas individualmente, pode ser fácil uma vez que o tamanho do acúmulo é determinado, quantificar as partículas biológicas presentes nesse acúmulo. Essa variante da invenção é particularmente vantajosa, quando as partículas biológicas são micro-organismos e que um tratamento subseqüente sobre esses micro-organismos é considerado, caso no qual, uma coleta de colônia é necessária. Essa variante permite então se assegurar que a quantidade de microorganismos presentes é suficiente, antes de efetuar, por exemplo, uma coleta.

[0015] De acordo com uma outra variante vantajosa da o]invenção, o processo pode comportar uma etapa suplementar de identificação, in situ ou ex situ, dos micro-organismos dispostos em acúmulo.

[0016] Outras características, detalhes e vantagens da invenção sobressairão com a leitura da descrição feita com referência aos desenhos anexados dados a título de exemplo e que representam, respectivamente:

- a figura 1, a superfície de um meio de cultura sobre a qual são apresentadas colônias bacterianas;

- a figura 2, uma ilustração esquemática das diferentes etapas de um processo, conforme um modo de realização da invenção;

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- a figura 3, uma ilustração do princípio da microtopografia confocal cromática, utilizada em uma primeira variante do processo, de acordo com a invenção;

- as figuras 4A, 4B e 5A, 5B, 5C, 5D e 5E resultados experimentais obtidos, aplicando-se a técnica de microtopografia confocal cromática a um meio de cultura inseminado por bactérias;

- as figuras 6A - 6D, uma segunda variante do processo, de acordo com a invenção, baseada na técnica da estrioscopia; e

- as figuras 7A - 7C, uma terceira variante do processo, de acordo com a invenção, baseada na técnica da ombroscopia.

[0017] A figura 1 mostra uma caixa de Pétri 10, vista em plano; essa caixa contém um meio nutritivo (uma gelose), sobre a superfície 11, da qual se desenvolveram colônias bacterianas 12. O processo da invenção visa a detectar colônias em um estágio precoce de seu conhecimento, quando seu diâmetro é muito pequeno, para que elas sejam visíveis a olho nu (diâmetro de algumas dezenas de micrometros, por exemplo, 30 pm ou menos). A superfície 11 do meio de cultura (isto é, a interface gelose-ar) apresenta irregularidades 13, ligadas ao estado de superfície da gelose. No exemplo da figura 1, a gelose é diretamente exposta ao ar; por conseguinte, ela tem tendência a secar, o que induz modificações de sua superfície e notadamente uma variação de seu nível médio. Vantajosamente, um processo de detecção de acúmulo de partículas biológicas sobre uma superfície de gelose considera essas irregularidades da superfície, assim como as modificações às quais ela é submetida.

[0018] O processo da invenção explora o fato, conhecido, que a multiplicação das bactérias na superfície de um meio nutritivo forma uma protuberância. A altura dessa protuberância se mede, nas fases iniciais do crescimento da colônia, em centenas de nanômetros ou em micrometros. A idéia à base da invenção consiste em detectar as

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6/18 protuberâncias associadas aos acúmulos de partículas biológicas por meio de técnicas - conhecidas por elas mesmas - de topografia de superfície, associadas a um tratamento de imagem adaptado.

[0019] Conforme mostra a figura 2, a primeira etapa E1 do processo da invenção consiste em determinar uma representação topográfica 20 da superfície 11 sobre a qual se desenvolvem os acúmulos 12 a detectar. No caso representado nessa figura, trata-se de uma representação topográfica tridimensional, tomando, em particular, a forma de uma camada tridimensional. Uma representação topográfica tridimensional associa, a cada ponto da superfície, coordenadas (x, y) em um plano Oxy e uma coordenada z, segundo um eixo POZ, de preferência perpendicular ao plano Oxy. Essa representação pode assumir a forma de uma superfície em três dimensões em uma marcação Ox, Ou, Oz ou de uma matriz cujos elementos ai,j correspondem à altura segundo z dos pontos de coordenadas (i, j) em um plano Oxy.

[0020] A segunda etapa E2 é uma operação de pré-tratamento da representação topográfica 20 comportando a detecção e a subtração de um superfície de base. Com efeito, conforme explicado mais acima, a superfície 11 pode ser mal definida e mesmo variável no tempo. Para assegurar uma boa detecção dos acúmulos de partículas, é preciso determinar uma superfície de base extraída por um tratamento apropriado dos dados, por exemplo, uma filtragem espacial passabaixo,a freqüência de corte sendo tipicamente da ordem de 0.001 pm1, e, por exemplo, compreendida entre 1/2000 pm-1 e 1/500 pm-1. Os riscos devido ao preparo do meio de cultura, as variações mesmo heterogêneas da espessura e a não planeidade desaparecem.

[0021] De acordo com uma variante mais simples, uma inclinação média é calculada no nível de uma região da superfície, para determinar uma superfície de base plana e inclinada.

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7/18 [0022] A referência 21 indica a camada tridimensional (mais geralmente: a representação topográfica), filtrada, na qual as irregularidades 201 de baixa freqüência espacial (devido, por exemplo, às irregularidades do meio de cultura 13) foram eliminadas pela operação de tratamento que acaba de ser descrita. Sozinhas persistem, sobre a camada 21, as irregularidades e asperezas 202 de tamanho suficientemente pequeno e/ou contendo freqüências espaciais suficientemente elevadas. Entendem-se por freqüências espaciais elevadas freqüências superiores a 1/500 pm^-1. poderão ser eliminadas das componentes freqüências muito elevadas, isto é, as componentes correspondentes a freqüências espaciais superiores a alguns pm^-1, essas componentes correspondendo à rugosidade do gel que compõe o meio de cultura.

[0023] A terceira etapa E3 consiste em extrair contornos 22 a partir da camada tridimensional 21. De maneira conhecida em si, os contornos podem ser detectados por filtros de detecção de contorno conhecidos do técnico, por medida da inclinação local da camada seguida de um limite, ou por filtragem espacial passa-banda, por exemplo, um filtro que tem uma banda passante compreendida entre alguns 1/500 pm-1 e alguns 1/10 pm-1. Pelo menos determinados dos contornos 22 definem regiões fechadas 23 que são identificadas, quando da quarta etapa E4, como podendo corresponder a acúmulos de partículas biológicas. A etapa 4 pode compreender uma operação de seleção das regiões fechadas a consideradas. Por exemplo, é possível aplicar um critério de seleção segundo qual somente as regiões de dimensões suficientemente pequenas (diagonal ou diâmetro da ordem de algumas dezenas de micrometros) são retidas como capazes de representar acúmulos de partículas biológicas. Como variante ou em combinação, é possível repetir as etapas E1-E4 em tempos sucessivos, e selecionar as únicas regiões 22, cuja forma ou cujo tamanho varia no tempo. Com

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8/18 efeito, os acúmulos de partículas biológicas são estruturas vivas que evoluem, enquanto que as estruturas não biológicas não mudam, ou mudam muito pouco, entre duas medidas sucessivas. Isto permite também medir a cinética de crescimento de acúmulos.

[0024] A primeira etapa E1 do processo, consistindo em determinar uma representação topográfica da superfície sobre a qual se desenvolvem os acúmulos a detectar, pode ser utilizada por aplicação de várias técnicas diferentes de microtopografia, conhecidas por si mesmo. A fim de não perturbar o crescimento de acúmulos a detectar, as técnicas sem contato, e em particular as técnicas ópticas sem preparo da amostra (isto é, não se baseando na utilização de corantes, fluoróforos ou seus precursores) são particularmente preferidas.

[0025] De maneira geral, uma técnica de microtopografia óptica comporta:

- a iluminação por uma fonte luminosa da superfície, da qual uma representação tridimensional deve ser realizada;

- a detecção, por um captador de luz, de um sinal, correspondente à luz refletida ou transmitida por essa superfície; e

- a determinação de uma representação topográfica tridimensional da superfície a partir do sinal detectado.

[0026] A iluminação da superfície pode ser dirigida do meio ambiente para a superfície. Quando a iluminação não é colimatada, pode-se focalizá-la sobre a zona a medir. A fonte de luz pode ser espacialmente e/ou temporalmente coerente, ou bem incoerente. Ela pode ser policromática ou monocromática. A detecção pode ser realizada por um captador de imagem monodimensional (barrete) ou bidimensional (matriz), de tipo CMOS, CCD, fotomultiplicador, fotodiodo, etc. Esse captador pode ter uma função espectrométrica, permitindo analisar o espectro da luz detectada. Pode também ser acoplado a um diafragma, ou orifício estenopeico, a fim Ed constituir um

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9/18 dispositivo de detecção confocal.

[0027] Duas técnicas serão descritas em detalhes na seqüência como constituindo modos de realização preferidos da invenção. Todavia, outros processos ópticos podem também ser aplicados ao processo da invenção, por exemplo: um desenvolvimento automático sobre a superfície, por auto-colimação ou por tratamento de imagem; processos interferométricos e/ou halográficos; uma análise do fronte de onda em reflexão; etc.

[0028] A primeira técnica óptica de microtopografia que foi aplicada com sucesso à detecção precoce de acúmulo de partículas biológicas sobre uma superfície é a microtopografia confocal cromática. A microtopografia confocal cromática foi desenvolvida pela sociedade STIL S.A. e é descrita em detalhes pelo documento FR 2 738 343.

[0029] A técnica de microtopografia confocal cromática - ou imageria confocal cromática - é ilustrada na figura 3.

[0030] Uma fonte pontual 300 de luz branca (ou, em todos os casos, policromática), por exemplo, realizada a partir de uma fonte estendida associada a um orifício estenopeico (pinhole, em inglês), emite um feixe luminoso 301 que é focalizado por uma objetiva 310. Essa objetiva 310 apresenta um cromatismo axial estendido: por conseguinte, as diferentes componentes espectrais do feixe 301 são focalizadas em pontos focais respectivos 321, 322, 323... espaçados ao longo do eixo óptico da objetiva. O feixe assim focalizado em incidência normal é dirigido sobre a superfície 330 de uma amostra. A luz refletida pela superfície 330 atravessa uma segunda vez a objetiva 310, dessa vez propagando-se para fonte 300; uma parte da luz refletida é extraída por um separador de feixe (Beamsplitter, em inglês) 340 e dirigido para um orifício estenopeico 350 móvel axialmente, disposto diante de um espectrofotômetro 360. Realiza-se assim uma filtragem espacial: só os raios luminosos oriundos de um ponto conjugado do orifício

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10/18 estenopeico 350 podem atingir o espectrofotômetro 360. Em razão da cromaticidade axial da objetiva 310, esses raios apresentam um comprimento de onda (λ) bem definido Ài, que depende da distância H entre a objetiva 310 e a superfície refletora 330. Da medida, realizada pelo espectrofotômetro 360, do comprimento de onda Ài é, portanto, possível de determinar H.

[0031] Uma representação topográfica da superfície 330 pode, portando, ser obtida por varredura.

[0032] Uma demonstração experimental da utilização dessa técnica para a aplicação do processo da invenção foi realizada, utilizando um meio de cultura gelosado inseminada e um sistema óptico caracterizado por:

- uma freqüência de amostragem de 1 kHz;

- uma dinâmica de distância de aproximadamente 300 pm;

- um espectrofotômetro utilizando como detector uma barra CCD de 1000 pixel, cada pixel codificando uma altura de 300 nm. [0033] Processos de tratamento do sinal, por exemplo, processos de super-pixelização, permitem obter uma resolução vertical inferior a 300 nm. Esses processos, conhecidos, permitem uma melhoria da resolução, combinando o conteúdo de pixels adjacentes.

[0034] A título de exemplo, pode-se utilizar o aparelho Altisurf 500 da sociedade Altimet.

[0035] Os resultados experimentais são ilustrados nas figuras 4A e 4B, assim como 5A - 5E. Nessas figuras, a camada tridimensional foi substituída por uma representação inteiramente equivalente explorando uma escala de cinza (cinza escuro para as baixas altitudes, cinza claro ou branco para as altitudes mais elevadas).

[0036] A figura 4A mostra uma representa topográfica da superfície de um meio de cultura gelosado inseminado com Staphylococcus epidermidos. Pode-se anotar uma distorção da superfície de varais

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11/18 dezenas de micrometros, sob a forma de estrias. A figura 4B mostra a mesma representação, após um pré-tratamento de subtração de uma superfície de base. A distorção de superfície desapareceu, mas se podem distinguir sem dificuldade colônias de bactérias de aproximadamente 2 pm de altura, e de diâmetro compreendido entre 10 pm e algumas centenas de pm. Em seguida, essas colônias foram identificadas automaticamente por cálculo de inclinação local e limite. O tamanho da superfície de gelose estudada nesse exemplo é de 1,2 x 5 mm.

[0037] A figura 5A mostra uma representação topográfica da superfície de u outro meio de cultura gelosado inseminado com Escherichia Coli, antes da subtração do fundo. A figura 5B mostra a superfície de fundo, colocando em evidência irregularidades de superfície em forma de estrias e a figura 5C à superfície após subtração do fundo, sobre a qual são claramente visíveis colônias bacterianas. [0038] As figuras 5D e 5E mostram a evolução no tempo (a 0 hora; 1,3 h; 2,2 h; 3 h; 3,9 h) dos perfis (unidimensionais) de duas dessas colônias. Pode-se ver que as colônias se tornam detectáveis ao cabo de 2 horas aproximadamente, e que é possível seguir sua dinâmica de crescimento.

[0039] Nesse processo, a representação da topografia da superfície do meio é uma representação tridimensional. Os contornos detectados correspondem a linhas fechadas delimitando um volume. Em função do processo de detecção de contorno retido, essas linhas fechadas ligam pixels correspondentes seja a uma mesma inclinação, seja a uma mesma altitude.

[0040] Cada volume delimitado por u contorno talvez quantificado por um indicador, este podendo compreender a integral do peso (isto é, da altura) dos pixels compreendido nesse volume. Quando do cálculo dessa integral, o peso dos pixels pode constituir o objeto de um limite.

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Em outros termos, só se considera o valor dos pesos que ultrapassam um certo limite. Esse limite pode ser estabelecido a partir do peso de um ou de uma pluralidade de pixels que constituem o contorno, ou do peso de um ou de uma pluralidade de pixels repartidos sobre uma superfície delimitada pelo contorno.

[0041] Quando o tipo de micro-organismos que constitui o volume é conhecido, esse indicador permite uma estimativa da biomassa.

[0042] De acordo com um outro modo de realização, os acúmulos de partículas biológicas são detectados por um processo de estrioscopia.

[0043] A estrioscopia é um processo óptico, conhecida por ela mesma, baseada nos princípios da óptica de Fourier. A figura 6A mostra uma montagem estrioscópica, permitindo a utilização de um segundo modo de realização da invenção.

[0044] Uma fonte pontual 600 emite um feixe divergente 601 de luz sensivelmente monocromático que é em seguida focalizado por uma objetiva 620. Uma caixa de Pétri transparente 610 contendo um meio de cultura inseminado sobre a superfície 611 do qual se desenvolve, colônias 612 de micro-organismos a detectar 611, do qual se desenvolvem colônias 612 dse micro-organismos a detectar é disposta imediatamente a jusante da objetiva 620, de maneira a ser atravessada pelo feixe focalizado. UM ocultador 630 é disposto no plano focal da objetiva 620. Esse ocultador oculta todos os raios luminosos provenientes da fonte, através da objetiva e da caixa de Pétri, sem terem sido desviados. Se a superfície 611 fosse perfeitamente plana e homogênea (em aproximação de óptica geométrica), toda a luz do feixe 601 seria interceptada pelo ocultador. Na realidade, as irregularidades da superfície 611 - aí compreendidas aquelas devido às colônias 612, se torna raios luminosos, que passam assim ao lado do ocultador. Do ponto de vista da óptica de Fourier, sabe-se que, no plano focal da

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13/18 objetiva, se forma uma distribuição luminosa correspondente ao espectro de freqüências espaciais da superfície 611; o ocultador realiza assim uma filtragem espacial passa-alto.

[0045] A jusante do ocultador é posicionado um sistema de imagem (aparelho fotográfico 640) desenvolvido sobre a superfície do meio de cultura. A imagem conseguida pelo sistema de imagem contém uma informação sobre a inclinação local da superfície 611, e permite, portanto, reconstituir uma camada tridimensional dessa superfície (que, além disso, já está parcialmente filtrada passa-alto, sem necessidade de pré-tratamento).

[0046] Considerando-se que o ocultador tem uma dimensão finita, só os raios luminosos que são desviados de um ângulo superior ou igual a um valor limite são detectados. Esse valor limite é minimizado quando o ocultador tem o tamanho da mancha de difração da lente. Caso se suponha que a fonte 600 é realmente pontual (o que é sempre uma aproximação), só poderão ser detectadas as inclinações locais superiores a À/(n-1)d na qual lambda é o comprimento de onda da luz utilizada, d é o diâmetro da lente e n o índice óptico do meio. Com efeito, uma inclinação local de ângulo alfa desvia os raios do ângulo (n-1) α e só os desvios superiores à difração podem ser observados. Na prática, os meios de cultura têm defeitos de superfície de alguns mili-rradianos, o que impõe um ocultador bem maior do que esse limite teórico, caso se queira poder se livrar de todo o pré-tratamento. O diâmetro do ocultador deverá ser da ordem de (n-1) I * Pmax, pmax sendo a inclinação local máxima dos defeitos de superfície, e I é a distância entre a lente e o ocultador. Uma micro-colônia de espessura 1 pm e de diâmetro 30 pm impõe à superfície de onda uma inclinação local média de (1,35-1)/15 = 23 milirradianos, muito superior aos defeitos de superfície do gel, e é, portanto, facilmente visível. A inclinação local no nível do bordo da colônia é ainda mais elevada, tipicamente de pelo menos algumas

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14/18 centenas de milirradianos (ou décimos de radianos).

[0047] Uma vantagem da estrioscopia sobre as técnicas de cartografia geométrica, tais como a imageria confocal cromática, é que não é necessário ter uma resolução lateral melhor que a dimensão das micro-colônias: já que se está em fundo negro, detecta-se e se localiza sem nenhuma dificuldade objetos menores que o limite de resolução (não se separam evidentemente dois objetos mais próximos que esse limite de resolução).

[0048] Uma outra vantagem é que, com uma única aquisição, o campo observado pode abranger uma região mais extensa que com a técnica de microtopografia confocal anteriormente descrita. Assim, uma aquisição de uma imagem por um processo de estrioscopia permite observar parte extensa de uma caixa de Pétri, até mesmo a totalidade dessa caixa.

[0049] Segundo esse processo, a representação da topografia da superfície do meio é uma representação bidimensional, isto é, uma imagem, sobre a qual a variação de intensidade entre dois pixels adjacentes traduz uma variação de altitude da superfície objeto iluminada e/ou uma variação local do índice de refração. Os contornos detectados correspondem a linhas fechadas, delimitando uma superfície. Essas linhas ligam pixels correspondentes a uma mesma variação do nível de cinza.

[0050] Quando a variação de altitude, entre dois pixels adjacentes é produzida por uma colônia bacteriana, sua borda forma com a superfície do meio de cultura o ângulo tipicamente superior a alguns décimos de radianos. Essa inclinação é superior àquela formada pelas variações de níveis do meio de cultura, cujo ângulo é tipicamente inferior a 10 milirradianos.

[0051] A figura 6B ilustra uma outra montagem que permite a aplicação do processo da invenção por estrioscópia. Contrariamente ao

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15/18 caso da figura 6A, o feixe de iluminação 301' é colimatado, quando atravessa a caixa de Pétri transparente 610, depois é focalizado por uma primeira lente 620 a jusante desta última (comprimento focal da lente: 200 mm; diâmetro: 50 mm - esses valores são dados a título de exemplo unicamente). Uma segunda lente 621 (comprimento focal: 10 mm: abertura numérica ON: f/3 - ainda, esses valores são dados a título de exemplo unicamente) forma uma imagem da caixa de Pétri. O ocultador 630', disposto no plano focal da lente 620', intercepta os raios luminosos que não foram desviados por variações de inclinação local no nível da superfície observada 611, ou por variações locais de índice de refração no nível dessa superfície (assim como aqueles que foram desviados para baixo, embora isto não seja essencial).

[0052] Quando uma colônia bacteriana se desenvolve na superfície 611 do meio de cultura, ela desvia a irradiação luminosa que lhe é incidente, de modo que este não converge para o ocultador 630', mas é detectado pelo detector 640 (por exemplo, uma câmera de 1400 x 1000 pixels de 3 pm cada um). Assim, as colônias bacterianas 612, porque elas geram localmente uma flutuação de inclinação no nível da superfície 611, podem ser detectadas pelo detector 640, sob a forma de pontos luminosos sobre o fundo negro.

[0053] A utilização de um feixe de iluminação paralela, ao invés do feixe divergente / convergente da montagem da figura 6A, tem por efeito tornar a intensidade do sinal independente da posição da parte de superfície observada. Em outros termos, sobre todo o campo observado uma mesma inclinação local no nível da superfície observada produz um sinal de mesma intensidade sobre o detector, independentemente da posição da inclinação local sobre a superfície 611 do meio de cultura 610.

[0054] A figura 6C corresponde à observação, com a montagem da figura 6B, de colônias bacterianas de tipo Escherichia Coli, 8 horas após

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16/18 sua inseminação na superfície de uma gelose TSA (Trypcase Soja Gelose). Os pontos brancos correspondem a colônias bacterianas. A linha contínua formando um ângulo reto luminoso, na parte inferior direita da imagem, corresponde a uma lâmina de vidro, formando uma marcação visual.

[0055] A figura 6D apresenta uma fotografia do mesmo meio de cultura, 24 horas após a inseminação. Pode-se apreciar a boa coerência entre as colônias bacterianas fotografadas na figura 6D e aquelas detectadas, por estrioscopia de transmissão, na figura 6C.

[0056] A estrioscopia pode também ser utilizada, segundo uma geometria em reflexo, a fone de luz sendo disposta face o meio de cultura, da mesma forma que o detector. Isto convém à observação de meios opacos.

[0057] Segundo um outro modo de realização, as colônias bacterianas são observadas por uma montagem, aplicando a técnica de ombroscopia. Essa montagem está representada na figura 7A. Um feixe luminoso paralelo atravessa a caixa de Pétri 710 contendo o meio de cultura, depois é focalizado em direção a um detector 740 por uma primeira lente 720 (comprimento focal da lente: 200 mm,; diâmetro: 50 mm - esses valores são dados a título de exemplo unicamente). Quando de uma colônia bacteriana 712 se desenvolve na superfície 711 do meio de cultura, ela desvia a irradiação luminosa, devido à variação de altitude, e, portanto, da inclinação local, formada na superfície 711. Contrariamente ao processo de estrioscopia, a irradiação desviada por uma variação de altitude, e/ou uma variação de índice, sobre a superfície observada, não é captada pelo detector 740 (câmera de 1400 x 1000 pixels de 3 pm, cada um, objetiva de comprimento focal f = 10 mm, abertura numérica ON = f/3 - esses valores são dados a título de exemplo unicamente). Esse dispositivo permite detectar uma inclinação local sobre uma superfície plana a analisar, traduzindo-se pelo

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17/18 aparecimento de uma zona escura sobre a imagem formada pelo detector 740. Assim, segundo esse processo, as colônias bacterianas 712 aparecem sob a forma de manchas escuras sobre um fundo claro, este correspondendo à superfície 711 do meio de cultura.

[0058] Conforme evocado anteriormente a respeito da estrioscopia, quando da utilização da ombroscopia, a representação da topografia da superfície do meio é uma representa bidimensional, isto é, uma imagem, sobre a qual a variação de intensidade entre dois pixels adjacentes traduz uma variação de altitude da superfície objeto iluminada. Ela pode também traduzir uma variação local de índice no nível dessa superfície. [0059] A figura 7B apresenta a observação, com a montagem da figura 7A, de colônias bacterianas de tipo Escherichia Coli 8 horas, após sua inseminação na superfície de gelose TSA. Os pontos escuros correspondem às colônias bacterianas. Observar-se-á a coerência da localização dessas colônias com os resultados da figura 6D (fotografia) e da observação, em estrioscopia de transmissão, representada na figura 6C.

[0060] Da mesma forma que a técnica de estrioscopia, a observação de colônias bacterianas por ombroscopia pode ser feita, segundo uma geometria de reflexo, a fonte de luz 700 sendo disposta na face da caixa de Pétri 710 contendo o meio d5e cultura a observar, da mesma forma que o detector 740. A figura 7C representa essa montagem, a irradiação produzida pela fonte de luz sendo desviada por uma lâmina semirrefletora 750, depois tornada paralela pela lente 720. Essa montagem será preferida, quando o meio de cultura é opaco.

[0061] Tanto no caso da estrioscopia quanto em cartografia de superfície, pode-se vantajosamente aplicar todos os processos de tratamento de imagem e de subtração de imagens consecutivas capazes de colocar em evidência modificações devido ao crescimento. [0062] Uma vez a localização do acúmulo realizado, uma

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18/18 identificação das bactérias pode ser realizada por uma medida conhecida, por exemplo por análise in-situ (difração, espectrometria Raman) ou por outros meios de análise, tais como a espectrometria de massa. Neste caso, a análise é feita ex-situ e necessita, portanto, coletar a colônia de bactérias.

[0063] A localização por topografia pode, por exemplo, permitir selecionar acúmulos, cujo volume ultrapassa um certo limite, os acúmulos selecionados constituindo em seguida o objeto de uma análise qualitativa.

[0064] A invenção não está limitada à detecção de colônias de micro-organismos sobre a superfície de um meio de cultura. A superfície sobre a qual se acham os acúmulos biológicos, e mais geralmente as partículas biológicas, a detectar pode também ser um sólido, por exemplo, um substrato em vidro ou silício funcionalizado, ou um filtro microporoso utilizado para recuperar bactérias contidas em um líquido filtrado e que pode, por exemplo, mas não necessariamente, ser colocado sobre u meio de cultura. As operações de pré-tratamento utilizadas, quando da segunda etapa E2 do processo serão, de preferência, adaptadas ao tipo de superfície considerado.

[0065] O meio ambiente, situado acima da superfície, pode ser o vácuo ou um fluido, tal como um gás ou um líquido, tal como um gás ou um líquido, o gás e, em particular, o ar sendo o modo preferido. O meio ambiente pode ser confinado, o que evita os riscos de contaminação e, se for o caso, de evaporação da gelose.

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo de detecção de um acúmulo de partículas biológicas (12) formando protuberâncias sobre uma superfície (11), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas que consistem em:

   (a) determinar (E1) uma representação topográfica (20) da referida superfície consistindo em uma imagem numérica de uma altitude ou em uma variação de altitude da referida superfície;

   (b) detectar (E3, E4) na referida imagem em pelo menos um contorno;

   (c) selecionar (E4), dentre o contorno ou os contornos detectado(s) em pelo menos um contorno que defina uma região que corresponda potencialmente a um acúmulo de partículas biológicas sendo que as referidas etapas são utilizadas com o auxílio de um meio eletrônico de tratamento dos dados, sendo que as referidas partículas biológicas são escolhidas dentre microorganismos.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos microorganismos são selecionados dentre bactérias, leveduras ou fungos.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as referidas partículas biológicas apresentam um diâmetro ou uma dimensão principal inferior ou igual a 100 pm.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida superfície (11) é selecionada dentre:

   a interface entre o meio de cultura e um meio ambiente;

   a superfície de um substrato funcionalizado; ou a superfície de uma membrana microporosa.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado

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   2/3 pelo fato de que os referidos acúmulos de partículas biológicas são colônias bacterianas crescendo em um meio de cultura gelosado.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida etapa (a) consistindo em determinar uma representação topográfica da referida superfície é implementada por um processo óptico efetuado sem contato e sem preparo da amostra.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida etapa (a) consistindo em determinar uma representação topográfica da referida superfície é implementada por microtopografia confocal cromática.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de pré-tratamento da imagem numérica que consiste em manter frequências espaciais superiores a 1/500 pm^-1.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes da etapa (b), uma etapa de pré-tratamento da imagem numérica consistindo em:

   calcular uma imagem numérica de referência através da aplicação de um filtro espacial de banda passante à imagem numérica, o dito filtro espacial apresentando uma frequência de corte de 0,001 pm^-1;

   subtrair a imagem numérica de referência da imagem numérica.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido filtro espacial apresenta uma frequência de corte na faixa de 1/2000 pm^-1 a 1/500 pm^-1.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende, antes da etapa (b), uma etapa de prétratamento da imagem numérica que consiste em filtrar frequências espaciais superiores a alguns pm^-1.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado

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    3/3 pelo fato de que a referida etapa (a) consistindo em determinar uma representação topográfica da referida superfície é implementada por estrioscopia ou por ombroscopia.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida etapa (b) consistindo em detectar pelo menos um contorno é implementada pela medida da inclinação local da referida representação topográfica da superfície, com limite.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inclui ainda uma operação de pré-tratamento (E2) da referida representação topográfica, a operação de pré-tratamento compreendendo detectar e subtrair uma superfície de referência.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inclui repetir as etapas (a) e (b), em tempos sucessivos, e selecionar as únicas regiões identificadas nas etapas (b) que a forma ou o tamanho varia ao longo do tempo.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inclui uma etapa (c) adicional consistindo em avaliar a quantidade de partículas biológicas presentes em um acúmulo.
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que inclui uma etapa adicional de identificar, in situ ou ex situ, os microorganismos dispostos em acúmulos.