CN116324386A - 用确定生物量沿光轴的空间分布来分析生物样本的方法 - Google Patents

Abstract

一种分析生物样本的方法，生物样本包括生物剂并且被放置在全息成像系统的视场内的分析容器中，全息成像系统定义采集焦平面，所述方法包括，针对多个测量时间的每个测量时间进行：在采集焦平面的各自不同位置处采集生物样本的多个全息图像(S02a)，从采集的每个全息图像中确定表示在采集焦平面的所述位置处的生物剂的量的生物量参数值(S02b)，所述方法包括从同一测量时间的针对采集焦平面的几个位置的生物量参数值来构建分布指标(S03)，以及从分析结果中提供生物剂生物量分布的表示(S05)，所述生物剂生物量分布的表示是由测量时间的至少一个分布指标得出。

Description

用确定生物量沿光轴的空间分布来分析生物样本的方法

技术领域

本发明涉及通过成像分析生物样本的领域，并且更具体地涉及随时间监测生物量沿光轴的空间分布。

背景技术

通过成像分析生物样本使用光学分析仪器，将待分析的生物样本引入到该光学分析仪器中。生物样本由生物剂的悬浮液组成。例如，生物剂是微生物(细菌、酵母、霉菌等)。生物样本的分析是应用于生物样本的体外分析。生物样本中生物剂的分析可以包括鉴定所述生物剂或者确定该生物剂的特征，例如对所述生物剂有效的抗生素的最小抑制浓度或甚至形成生物膜的能力。

将称为接种物的生物样本以其初始状态放置在至少部分透明的容器或孔中，分析仪器可以通过该容器或孔对生物样本的光学性质进行测量。孔包含营养培养基以及一种或多种试剂，例如酶底物或抗生素，以旨在与生物样本中存在的生物剂相互作用。通常，提供多个孔，每个孔接收接种物，每个孔包含不同的试剂或者相同但浓度不同的试剂。取决于接种物中存在的生物剂的性质，所述制剂与某些试剂反应但不与其他试剂反应，或者与某些浓度反应而不与其他浓度反应。例如，在用于测试抗生素敏感性的抗菌谱的背景下，试剂由不同浓度的不同抗生素组成，生物剂将在含有它们不敏感的抗生素或其中抗生素浓度不足的孔中繁殖，然而所述生物剂的生长将在含有该生物剂对其在足够浓度下敏感的抗生素的孔中或多或少地受到阻碍。

因此，生物剂和试剂之间相互作用的这些差异导致孔中生物量的不同发展。生物量，即每个孔中存在的生物材料的量，直接地影响每个孔中存在的生物样本的光学特性，因为生物剂本身具有的光学特性不同于生物剂悬浮在其中的溶液的光学特性。

特别地，生物样本的透射率受生物剂浓度变化的影响。出于这个原因，已经开发了用于分析生物样本的方法，该方法基于在孵育期确定充满生物样本的孔的总透射率(或吸光度，等同词)随时间的变化，以便确定浊度量度，浊度量度通常以麦克法兰(McFarland，McF)表示。这种浊度量度直接表示了生物样本中生物剂的生物量。为此，发光二极管用已知强度的光束照射样本，并且相对于样本放置在发光二极管的对面的点接触型光电二极管允许用于确定光束穿过生物样本后接收到的光强度。然而，这种透射率测量具有相当低的灵敏度，使得不可能测量小于0.05McF甚至小于0.1McF的浊度。此外，生物量不能总是用于确定生物剂的浓度：如果生物剂的体积增加，例如通过细菌的伸长，生物量增加而生物剂的数量保持不变。

此外，该测量是总体测量，其没有考虑分析容器内生物剂的空间分布，尤其是沿光轴(通常由坐标Z表示)的空间分布。事实上，这种分布可能是高度不均匀的。例如，一些生物剂优先在容器的某些区域生长，并且在分析生物样本期间确定这种不均匀性可以有助于识别生物剂和/或确定它们的一些特性。此外，通常将试剂布置在分析容器的壁上。因此，生物剂生物量生长的空间分布至少受到试剂空间不均匀性的短暂影响，但是总体测量不允许考虑这一点。特别地，不均匀性可以表明生物剂可能形成生物膜，在这种情况下可能采取特定措施，例如使医学治疗适应生物膜的存在。

发明内容

因此，本发明的目的是，在分析生物样本期间，为生物样本提供生物剂生物量沿光轴的空间分布随时间的变化，例如以便表明生物剂的特性，例如形成生物膜的能力。

为此，本发明提出了一种通过分析仪器来分析生物样本的方法，所述生物样本包括生物剂并且被放置在全息成像系统的视场内的分析容器中，所述全息成像系统定义光轴和采集焦平面，所述方法包括针对测量期的多个测量时间的每个测量时间：

-在采集焦平面的光轴上的各自不同位置处采集生物样本的多个全息图像，

-从采集的每个全息图像中确定表示所述全息图像在采集焦平面的所述位置处的生物剂的量的生物量参数值，

该方法包括使用来自测量时间的针对采集焦平面的几个位置的生物量参数值来构建分布指标，所述分布指标表示在所述测量时间分析容器中生物剂的量沿光轴的空间分布，以及该方法包括从分析结果中提供生物剂生物量分布的表示，该生物剂生物量分布的表示是由测量时间的至少一个分布指标得出。

本发明有利地通过以下各种特征单独地或根据它们各种可能组合来完成：

-通过根据采集焦平面的各个位置对生物量参数值进行空间组织来获得分布指标，或者通过与采集焦平面的不同位置的生物量参数值相关的计算来获得该分布指标；

-生物剂生物量分布的表示是生物剂生物量分布的时间变化的表示，该生物剂生物量分布的表示是由多个测量时间的几个分布指标得出；

-该方法包括通过根据它们各自的测量时间对分布指标进行空间组织来构建生物剂生物量分布的时间变化的表示；

-全息图像的生物量参数是由所述全息图像的像素的灰度相关的统计得出；

-生物量参数是全息图像的每个像素的灰度绝对值的平均值；

-全息图像的生物量参数的确定包括全息图像的预先归一化，其包括：

-通过对采集的全息图像应用平滑滤波器来确定背景图像，

-将采集的全息图像的灰度逐像素除以背景图像的灰度；

-采集焦平面在光轴上的各自不同位置在分析容器中的数量为至少10个，优选为至少20个；

-分析容器包括位于光轴上不同位置的两个相对的透明面，并且采集焦平面在光轴上的各自不同位置从一个透明面延伸到另一个透明面；

-采集焦平面在光轴上的至少一个位置不位于两个透明面之间，和/或采集焦平面在光轴上的位置对应于透明面的位置；

-全息成像系统围绕每个采集焦平面在光轴方向上定义了深度为至少100μm的场深；

-全息图像是全息图或从全息图重建的图像。

本发明还涉及一种分析仪器，其包括全息系统和数据处理装置，该全息系统具有视场并且被配置为采集全息图像，该分析仪器被配置为接收全息系统的视场中的分析容器中的生物样本，并且用于实施根据本发明的方法的步骤。

附图说明

本发明的其他特征、目的和优势将从以下描述中显现出来，这些描述纯粹是说明性的而非限制性的，并且参考附图进行阅读，其中：

-图1示出根据本发明的可能实施方式的包括孔形式的可用于放置待分析生物样本的多个容器的分析卡的示例；

-图2示意性地示出根据本发明的可能实施方式的可以在分析仪器中使用的全息成像系统的示例；

-图3是图示根据本发明的可能实施方式的分析方法的步骤的示意图；

-图4是分析容器在包含光轴的平面内的横截面的示意图；

-图5是生物剂生物量沿光轴的空间分布随时间变化的图形表示的示例。

具体实施方式

通过包括具有视场的全息成像系统的分析仪器来实施用于分析生物样本的方法，该分析仪器被配置为接收全息成像系统的视场中的分析容器中的生物样本。

图1示出包括孔形式的多个分析容器2的分析卡1的示例，该多个分析容器可以用于放置待分析的生物样本。在此，分析容器2被组织成在平面上的二维阵列中，通常使用分析容器2中存在的不同试剂，每个容器2与不同的分析条件关联。例如，在用于测试抗生素敏感性的抗菌谱方面，试剂由不同浓度的不同抗生素组成。分析卡1的使用不是必需的，但是这类分析卡1使得在同一分析周期内以标准化方式进行多个测试成为可能。

每个分析容器2对至少一种可见光波长或不可见光波长至少部分透明，并且优选地对可见光谱至少部分透明。这种透明度允许通过如全息成像系统的光学装置来分析容纳在容器中的生物样本。优选地，并且如图4中可见，分析容器2具有至少两个相对的透明面2a、2b，以便为光的传播提供透明轴。这两个相对的透明面2a、2b相距例如小于10mm，或优选地相距小于5mm。通常，相对的透明面2a、2b沿光轴16相距大于0.1mm，优选大于0.5mm，更优选大于1mm。通常，相对的透明面2a、2b是限定分析容器2的透明薄膜。通常将试剂固定到至少一个透明面上。因此，在将薄膜应用到分析卡1之前，可以通过将试剂布置在旨在形成透明面2a、2b的薄膜上而将该试剂引入至分析容器2中。

为了允许填充分析容器2，这样的分析卡1可以例如包括管道5，该管道5用于浸没在管4中所制备的接种物量3中。通过操作者如下制备接种物，操作者将生物剂(用棒或拭子从培养皿中的培养物中取出的生物剂)以悬浮液引入到盐水溶液中，其稀释度对应于指定的浊度范围，例如对于细菌作为生物剂，在0.5McF和0.63McF之间，或者对于酵母作为生物剂，在1.8McF至2.2McF之间，范围取决于执行的分析类型和测量仪器。然后进一步稀释这种初始悬浮液，例如对于分析革兰氏阴性细菌稀释20倍或甚至100倍，或者对于分析革兰氏阳性细菌稀释10倍或甚至100倍。这种进一步的稀释尤其可以是自动化的，因此该稀释可以在将管4放置在分析仪器中之后由测量仪器来执行。当然，可以使用其他指定的浊度范围，这取决于使用的方案。可以在一个步骤中获得所需的稀释度，或者如上示例所示，在多个步骤中获得所需的稀释度。

然后将管道5的一端浸没在管4中制备得到的接种物量3中，并且将全部接种物引入到分析仪器中。当然，这些制备步骤的全部或部分可以是自动化的。接种物穿过管道5，然后通过在分析卡1中布置的流体循环回路分布在分析容器5之间。可以由毛细管作用和/或通过对存在于管4开口端的空气进行减压来引起接种物在管道5和分析卡1中的这种移动。例如，在减压的情况下，存在于分析卡1中的空气(其为大气压力)经由管道5通过接种物3离开分析卡1，为接种物3空出空间，因而接种物3经由管道5上升到分析卡1中。相反地，可以通过管4的开口端将气压施加至接种物，以便引起接种物3上升到管道5。然后由接种物组成的生物样本在分析容器2中就位。

该分析仪器包括具有视场的全息成像系统，该全息成像系统配置为采集该视场的全息图像。全息图像的采集允许相当大的场深，因此对生物剂的检测灵敏度非常高。在采集全息图像时，全息成像系统被放置在分析容器2的对面。作为非限制性示例，图2示意性地表示在线全息成像系统10，其被放置为使得所述全息成像系统10的视场11被涵盖在分析容器2中容纳的生物样本量中。分析卡1以及它因而包括的分析容器2被放置在全息成像系统10的物平面中。全息成像系统10限定成像轴16，成像轴16在此简化为对应于光轴的线，但是该成像轴可以由一组定义光路的连续的线组成，取决于全息成像系统10的光学部件的配置。

在分析容器2的一侧，在此是在光轴16上，光源4被配置为通过充分相干光的照明光束来照亮全息成像系统10的视场中的分析容器2。光源14可以产生照明光，或者只是承载该照明光的光纤的端部，其可能配备有光阑或光圈。照明光束具有全息成像的常规特性，没有任何特殊的附加限制。因此，照明光束可以是单色的(例如具有约640nm至670nm的波长)或者可能地可以由多个波长组成，例如一个接一个地使用。

在分析容器2的另一侧，在此是在光轴16上，图像传感器12是数字传感器，例如CMOS或CCD传感器。图像传感器12被放置在全息成像系统10的像平面上，并且被配置为采集全息图，也就是由放置在视场11中的接种物与照明光束之间的相互作用引起的干扰强度的空间分布。

在此，全息成像系统10设置有光学元件组件18，该光学元件组件被放置在分析容器2和数字图像传感器12之间，例如所示示例中的显微镜物镜18a和镜筒透镜18b。然而，如显微镜物镜18a的光学元件是可选的，因为本发明不限于具有透镜的全息显微镜。显然，本文描述的布置当然是非限制性示例。可以使用具有不同光学元件的任何全息成像系统10(具有或不具有显微镜物镜等)。因此，只要全息成像系统10能够采集在图像中出现生物样本产生的干涉图案的图像，该全息成像系统就适合用于实施该方法。然而，优选地，全息成像系统10被配置为围绕每个采集焦平面20在光轴16的方向上限定深度为至少100μm、优选至少150μm、并且更优选至少250μm的场深。典型地，分析容器2包括沿光轴16布置的两个相对的透明面2a、2b，并且场深在分析容器的两个相对的透明面之间延伸至少100μm，并且优选地至少150μm，并且更优选地至少250μm、或甚至至少300μm。视场11以空间的形式延伸，在该空间中可以从所述视场11成像的全息图来确定生物剂的存在。

测量仪器还包括用于处理数据的部件，例如处理器、存储器、通信总线等。由于这些其他部件除了它们实现的方法和它们包含的指令外没有特殊性，因此它们不在下文进行详细说明。

图3是图示分析方法的步骤的示意图，该方法在将生物样本初始放置在全息成像系统10的视场11中的分析容器2中(步骤S1)之后进行，如上详述。该方法包括针对测量期的多个测量时间，以重复方式实施的如下步骤组成的多个循环(步骤S02)：

-在采集焦平面的光轴16上的各自不同位置处采集生物样本的多个全息图像，

-从采集的每个全息图像中确定表示采集焦平面的所述位置处的生物剂的量的生物量参数值。

这些循环通常在1分钟至30分钟的时间范围内重复进行，取决于分析仪器的速度、平行处理的生物样本的数量，以及例如分析卡1中分析容器2的数量。测量期持续数小时，通常超过10小时，导致几十个甚至几百个测量时间。

当然，在采集焦平面的光轴16上的各自不同位置处采集生物样本的多个全息图像意味着在每次由图像传感器12采集全息图像(步骤S02a)之前，移动采集焦平面(步骤S02c)。采集焦平面的这些不同位置可以例如通过移动由图像传感器12和光学元件18a、18b形成的整个组件来获得，例如通过电动导轨或电动转台进行。还可以通过调整全息成像系统10的光学元件来移动采集焦平面，从而获得采集焦平面20的这些不同位置，通过调整入射到图像传感器12的光线的聚焦，从而移动图像传感器12的采集焦平面。

采集焦平面在光轴16上的各自不同位置在分析容器中的数量为至少2个，优选为至少5个，更优选为至少15个，尽管为了简便在图4中仅图示了其中的6个。允许更多数量的采集平面以改进对生物剂沿光轴16的空间分布的不均匀性的分析。应当注意，采集焦平面优选地以基本垂直于光轴16的方式延伸，使得光轴16上的各自不同位置对应于分析容器2内的尽可能多的不同深度。

如前所述，分析容器2通常包括位于光轴16上的不同位置的两个相对的透明面2a、2b，并且采集焦平面20的光轴16上的各自不同位置20a、20b、20c、20d、20e、20f从2a、2b的一个透明面延伸到2a、2b的另一个透明面。优选地，各自不同位置20a、20b、20c、20d、20e、20f沿着光轴16在两个相对的透明面2a、2b之间规则地间隔开。优选地，采集焦平面的各自不同位置20a、20b、20c、20d、20e、20f间隔开的方式使得所采集的每个图像出现不同生物剂。通常，采集焦平面在光轴16上的各自不同位置20a、20b、20c、20d、20e、20f沿光轴16延伸的深度大于0.1mm，优选地大于或等于0.5mm，并且优选地大于或等于0.8mm。优选地，采集焦平面在光轴16上的连续位置20a、20b、20c、20d、20e、20f以至少50μm、优选至少100μm、更优选至少150μm间隔开。

靠近两个透明面2a、2b的区域构成了分析生物剂的空间分布的有利区域。除了试剂可以存在于这些透明面2a、2b中的至少一个上的事实之外，这些面还形成机械支撑物，生物剂可以在其上形成生物膜，这是待检测的特别有趣的特征。为了确保紧邻两个透明面2a、2b之一的区域被正确成像，可以安排采集焦平面在光轴16上的至少一个位置不位于两个透明面2a、2b之间，更准确地说，采集焦平面在光轴16上的至少两个位置位于透明面2a、2b的任一侧。理想地，采集焦平面在光轴16上的位置对应于透明面2a、2b的位置。

当采集全息图像时，全息成像仪10采集全息图，其提供了大场深的优势，并因此对生物样本中的生物剂的检测具有高灵敏度。在采集全息图像的过程中，全息成像系统采集全息图。在采集全息图期间，光源14发射参考照明光束，其可以对应于沿成像轴16在Z方向上传播的参考平面波。存在于分析容器2中的视场11中的生物剂，通过它们的衍射特性，散射入射参考光。在图像传感器12上由生物剂散射的波与参考波干涉以形成全息图。由于图像传感器12仅对电磁场强度敏感，因此全息图对应于总场强度的空间分布，该总场对应于散射波和参考波的相加，其对应于每个像素的灰度值。所使用的全息图像可以是全息图，或者可以是使用例如基于瑞利-索末菲衍射理论的传播算法，基于全息图通过反向传播计算所重建的图像。通过使用不重建的全息图，可以获得高检测灵敏度，因为每个生物剂出现在全息图中，被对应于由所述生物剂的存在引起的干涉图案的环包围，因此促进检测这些生物剂的存在。此外，非重建可节省时间和计算资源。然而，使用重建图像具有其他优势，例如能够精确地定位(可能是三维地)出现在重建图像中的生物剂。与全息图一样，由每个像素的灰度来定义这种重建的图像。

优选地，全息图像的生物量参数是由与所述全息图像的像素的灰度相关的统计得出，并且更优选地，生物量参数是全息图像的每个像素的灰度绝对值的平均值。然而，可以使用其他生物量参数，例如全息图像中出现的生物剂的计数，或者生物剂出现或不出现的全息图像的比例。

优选地，全息图像的生物量参数的确定包括全息图像的预先归一化，包括：

-通过对采集的全息图像应用平滑滤波器、优选高斯滤波器来确定背景图像，

-将采集的全息图像的灰度逐像素除以背景图像的灰度。

选择平滑滤波器的参数，例如高斯滤波器的标准偏差，以创建具有一定截止频率的低通滤波器，该截止频率足够低以使滤波后的图像仅表示全息图像的背景，因此称为背景图像，例如在此滤波后的图像中没有可辨别的生物剂。图像的归一化还可以包括从该除法产生的全息图像的灰度中减去常数。然后可以获得具有负灰度值的归一化的全息图像。因此，在确定生物量参数值时，考虑的是灰度的绝对值。

在使得能够在同一测量时间获得采集焦平面的不同位置的多个生物量参数值的测量周期之后，基于来自同一测量时间的针对采集焦平面的几个位置的生物量参数值，来构建分布指标(步骤S03)。分布指标表示在该测量时间的生物剂的量沿光轴的空间分布。例如，可以通过根据它们的采集焦平面的各自位置，对生物量参数进行空间组织，来获得分布指标。通常，分布指标采用生物量参数值的串接形式，并且优选地采用空间串接的形式，其中生物量参数值在空间上串接。因此，分布指标可以解释为向量，其分量对应于不同位置的生物剂的量。通常，根据与它们所来自的全息图像的采集焦平面的各自位置相同的空间组织，来组织不同的生物量参数值。分布指标也可以对应于单个值，该单个值对应于在测量时间的生物剂的量沿光轴的空间分布的均匀性或非均匀性。因此，可以通过应用于不同采集焦平面上的生物量参数值的计算，特别是通过这些值之间的差值，来获得分布指标。例如，分布指标可以对应于采集焦平面靠近孔中部(在光轴上)的至少一个生物量参数值与采集焦平面靠近透明面2a、2b的至少一个生物量参数值的差值。还可以进行其他计算，例如标准差、方差或其他。

因此，以图4为例，在采集焦平面20的第一位置20a处采集第一全息图像，然后在采集焦平面20的第二位置20b处采集第二全息图像，然后在采集焦平面20的第三位置20c处采集第三全息图像，依此类推，直到在采集焦平面20沿光轴的每个位置20a、20b、20c、20d、20e、20f处采集全息图像。为每个全息图像确定生物量参数值，并因此与每个位置20a、20b、20c、20d、20e、20f关联，即第一位置20a的第一值，第二位置20b的第二值，第三位置20c的第三值，等等。因此，为了构建分布指标，将第一值与第二值相邻放置，将第二值与第三值相邻放置，将第三值与第四值相邻放置，依此类推。因此，第二值位于第一值和第三值之间，正如第二位置20b位于第一位置20a和第三位置20c之间。由此，恢复采集焦平面的各自位置的空间组织。

因此，每个测量周期允许获得分布指标，该分布指标表示在该周期发生期间在测量时间的生物剂的量沿光轴16的空间分布。测量周期通常以1分钟至30分钟的周期重复，取决于分析仪器的速度、平行处理的生物样本的数量，以及例如取决于分析卡1中分析容器2的数量，并且可能取决于生物剂和试剂之间相互作用的速度。分析持续时间通常延续几个小时，并且因此在该测量期间，该方法通常包括超过10个测量周期，并且优选地超过20个测量周期。

在对应于多个测量时间的这些测量周期之后，因此获得多个分布指标，该分布指标表示在多个测量时间的生物剂的量沿光轴16的空间分布。随后，优选地该方法包括构建生物剂生物量分布的表示(S04)，该生物剂生物量分布的表示是由测量时间的至少一个分布指标得出。优选地，生物剂生物量分布的表示是生物剂生物量分布的时间变化的表示，该生物剂生物量分布的表示由多个测量时间的几个分布指标得到。这种生物剂生物量分布的表示可以通过根据它们各自的测量时间对分布指标进行空间组织来构建。这是因为每个分布指标对应特定的测量时间。因此，分布指标的组合允许监测生物剂生物量沿光轴16的空间分布的时间变化。优选地，这是按时间顺序组织的分布指标的串接。

图5示出了这种时间变化的表示的示例。所成像的生物样品是铜绿假单胞菌作为生物剂在盐水溶液中的悬浮液。在每个测量时间，在采集焦平面沿光轴的27个位置采集27张全息图像，对应27个不同深度。测量时间的间隔为15分钟。因此，在图5中，纵轴是沿光轴的Z-位置的轴，对应于深度，横轴是时间轴，以分钟为单位。因此，图的底部对应于分析容器2的2a、2b的一个透明面，图的顶部对应于2a、2b的另一个透明面，而图的左侧对应于测量期的开始，图的右侧对应于测量期的结束。

该图对应于以图形形式的生物剂生物量分布的表示，由几个测量时间的分布指标得出，这些分布指标通过将生物量参数值转换为不同灰度而获得。可以看出，细菌的生物量随时间增加(从左到右)，但生物量的深度分布不均匀并且随时间变化：细菌的生长首先发生在靠近侧面的区域21，然后扩散到分析容器2的中心22。事实上，细菌铜绿假单胞菌以称为生物膜的结构化簇的形式生长，其最初在分析容器2的表面上延伸。因此，生物剂在分析容器内的空间分布是重要信息，其可以例如构成用于识别样本的生物剂的附加指标，或用于评估与布置在分析容器2的一个面上的试剂的相互作用，或用于揭示生物剂形成生物膜的能力。

因此，该方法包括从分析结果中提供生物剂生物量分布的表示，该生物剂生物量分布的表示是由测量时间的至少一个分布指标得出，例如以提供关于在测量时间生物剂的空间分布的信息(步骤S05)。这种生物剂生物量分布的表示可以例如以图形的形式提供，例如图像、曲线或表格。它可以以数值的形式提供，例如对应于一个或多个分布指标。此外，生物剂生物量分布的表示可以仅仅作为分布指标之一，在这种情况下，可能不需要构建步骤，除非例如需要提供以图形方式显示的这种生物剂生物量分布的表示。因此，即使只有一个由生物量参数值组成的分布指标，也可以构建显示生物剂生物量沿光轴分布的曲线。

例如，可以通过根据它们各自的测量时间对分布指标进行空间组织，来获得生物剂生物量分布的时间变化的表示。图5中的图像是这种图形形式表示的示例。然而，这种生物剂生物量分布的表示可以采取其他形式，如上面提到的曲线或表格甚至是数值。例如，当分布指标是数值时，该表示可以是按时间顺序对分布指标的所述数值进行组织的表格或列表，或者以曲线的形式表示。生物剂生物量分布的表示也可以由与分布指标值相关的计算得出，如这些值之间的差值。

在此，生物剂生物量分布的表示被理解为允许向操作者传达并由操作者解释。生物剂生物量分布的表示可以例如以允许其显示的格式显示在显示屏幕上，或者可以传输到打印机进行打印。

本发明不限于附图中描述和表示的实施方式。在不脱离本发明的保护范围的情况下，特别是从各种技术特征的组成的角度或通过等效技术的替代，仍然可以进行修改。

Claims (12)

1.一种通过分析仪器来分析生物样本的方法，所述生物样本包括生物剂并且被放置在全息成像系统(10)的视场(11)内的分析容器(2)中，所述全息成像系统(10)定义光轴(16)和采集焦平面(20)，所述方法包括，针对测量期的多个测量时间的每个测量时间：

-在所述采集焦平面(20)的所述光轴(16)上的各自不同位置(20a、20b、20c、20d、20e、20f)处采集所述生物样本的多个全息图像(S02a)，

-从采集的每个全息图像中确定表示所述全息图像在所述采集焦平面的所述位置处的生物剂的量的生物量参数值(S02b)，

所述方法包括使用来自同一测量时间的针对所述采集焦平面的几个位置的生物量参数值来构建分布指标(S03)，所述分布指标表示在测量时间所述分析容器中的生物剂的量沿所述光轴的空间分布，以及所述方法包括从分析结果中提供生物剂生物量分布的表示(S05)，所述生物剂生物量分布的表示是由测量时间的至少一个分布指标得出。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过根据所述采集焦平面的各个位置对生物量参数值进行空间组织来获得所述分布指标，或者通过与所述采集焦平面的不同位置的生物量参数值相关的计算来获得所述分布指标。

3.根据前述权利要求中任一项所述的分析方法，其中，生物剂生物量分布的表示是生物剂生物量分布的时间变化的表示，所述生物剂生物量的表示是由多个测量时间的几个分布指标得出。

4.根据权利要求3所述的分析方法，包括通过根据它们各自的测量时间对分布指标进行空间组织来构建所述生物剂生物量分布的时间变化的表示(S04)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的分析方法，其中，全息图像的生物量参数是由所述全息图像的像素的灰度相关的统计得出，和/或生物量参数是所述全息图像的每个像素的灰度绝对值的平均值。

6.根据前述权利要求中任一项所述的分析方法，其中，全息图像的生物量参数的确定包括全息图像的预先归一化，包括：

-通过对采集的全息图像应用平滑滤波器来确定背景图像，

-将采集的全息图像的灰度逐像素除以所述背景图像的灰度。

7.根据前述权利要求中任一项所述的分析方法，其中，所述采集焦平面在所述光轴(16)上的各自不同位置在所述分析容器中的数量为至少10个，并且优选为至少20个。

8.根据前述权利要求中任一项所述的分析方法，其中，所述分析容器包括位于所述光轴(16)上不同位置的两个相对的透明面(2a、2b)，并且所述采集焦平面(20)在所述光轴(16)上的各自不同位置(20a、20b、20c、20d、20e、20f)从一个透明面延伸到另一个透明面。

9.根据前述权利要求中任一项所述的分析方法，其中，采集焦平面在所述光轴(16)上的至少一个位置不位于两个透明面(2a、2b)之间，和/或采集焦平面在所述光轴(16)上的位置对应于透明面(2a、2b)的位置。

10.根据前述权利要求中任一项所述的分析方法，其中，所述全息成像系统围绕每个采集焦平面在所述光轴(16)的方向上定义了深度为至少100μm的场深。

11.根据前述权利要求中任一项所述的分析方法，其中，所述全息图像是全息图或从全息图重建的图像。

12.一种分析仪器，包括全息系统(10)和数据处理装置，所述全息系统(10)具有视场(11)并且被配置为采集全息图像，所述分析仪器被配置为接收所述全息系统(10)的所述视场(11)中的分析容器(2)中的生物样本，并且用于实施根据前述权利要求中任一项所述的方法的步骤。

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