JP2023543228A - 光軸に沿ったバイオマスの空間分布の決定を含む生体サンプルの分析方法 - Google Patents

Abstract

生物剤を含むとともに、獲得焦点面を規定するホログラフィックイメージングシステムの視野内で分析レセプタクルに配置される、生体サンプルを分析する方法であって、複数の測定時間のそれぞれに対して、獲得焦点面の異なるそれぞれの位置における、生体サンプルの複数のホログラフィック画像を獲得すること（Ｓ０２ａ）と、獲得した各ホログラフィック画像から、獲得焦点面の位置における生物剤の量を表すバイオマスパラメータの値を決定すること（Ｓ０２ｂ）と、を含み、獲得焦点面の複数の位置に対する同じ測定時間におけるバイオマスパラメータの値から、分布インジケータを構築すること（Ｓ０３）と、分析結果（Ｓ０５）の中から、ある測定時間における少なくとも１つの分布インジケータから導き出される生物剤のバイオマスの分布の表現を提供することと、を含む、方法。【選択図】図３

Description

本発明は、イメージングによる生体サンプルの分析の分野に関し、より詳細には、光軸に沿ったバイオマスの空間分布の時間に伴うモニタリングに関する。

イメージングによる生体サンプルの分析は、分析すべき生体サンプルが導入される光学分析機器を利用する。生体サンプルは生物剤の懸濁によって形成される。生物剤は、例えば、微生物（バクテリア、酵母、かびなど）である。生体サンプルの分析は、生体サンプルに適用されるインビトロ分析である。生体サンプル中の生物剤の分析は、上記生物剤の同定、あるいはこの生物剤の特性の決定、例えば、上記生物剤に対して有効であろう抗生物質の最小発育阻止濃度、またはバイオフィルムを形成する能力の決定を含んでもよい。

生体サンプルは、初期状態では種菌と呼ばれ、少なくとも部分的に透明なレセプタクル、即ちウェル内に配置され、分析機器は、ウェルを通して生体サンプルの光学的性質の測定を実施することができる。ウェルは、栄養培地を収容し、酵素基質または抗生物質など、生体サンプル中に存在する生物剤と相互作用するように設計された、１つもしくは複数の試薬も収容する。一般に、種菌をそれぞれ受け入れる複数のウェルが設けられ、ウェルはそれぞれ、異なる試薬または異なる濃度の同じ試薬を収容する。種菌中に存在する生物剤の性質に応じて、種菌は、特定の試薬と反応するが他の試薬とは反応しないか、または特定の濃度で反応するが他の濃度では反応しない。例えば、抗生物質の感受性を試験するアンチバイオグラムの枠組みでは、試薬は、様々な濃度の様々な抗生物質で構成され、生物剤は、生物剤が感受性を持たないかまたは抗生物質の濃度が不十分な抗生物質を収容したウェル内で増殖するか、あるいは反対に、十分な濃度で生物剤が感受性を持つ抗生物質を収容したウェル内である程度妨げられる生物剤の発育を認める。

したがって、生物剤と試薬との間の相互作用における上述の差は、ウェル内におけるバイオマスの異なる発育をもたらす。生物剤自体、生物剤が懸濁している溶液とは異なる光学的性質を示すので、バイオマス、換言すれば各ウェル内に存在する生体物質の量は、各ウェル内に存在する生体サンプルの光学的性質に直接影響する。

特に、生体サンプルの透過率は生物剤の濃度の変動によって影響を受ける。この理由により、一般的にはマックファーランド（ＭｃＦ）で表される濁り度の測定値を決定するために、生体サンプルが充填されたウェルの総透過率（または等価である吸光度）の潜伏段階中における時間に伴う変動の決定に基づいて、生体サンプルを分析する方法が開発されてきた。この濁り度の測定は、生体サンプル中の生物剤のバイオマスを直接表す。この目的のため、発光ダイオードが、強度が分かっている光線でサンプルを照明し、サンプルに対して発光ダイオードの反対側に配置された単一のフォトダイオードによって、光線が生体サンプルを通過した後に受光した光強度を決定することが可能になる。しかしながら、かかる透過率の測定は感受性が非常に低いので、０．０５ＭｃＦ未満またはさらには０．１ＭｃＦ未満の濁り度を測定することができない。さらに、バイオマスは、生物剤の濃度の決定を常に可能にするわけではなく、例えばバクテリアの延長によって生物剤の体積が増加した場合、バイオマスは同じ数の生物剤に対して増加する。

さらに、測定は大域的測定であり、特に光軸（一般に座標ｚによって示される）に沿った、分析レセプタクル内における生物剤の空間分布は考慮に入れていない。実際には、空間分布は非常に不均一なことがある。例えば、特定の生物剤がレセプタクルの特定のエリアにおいて優先的に発育するため、上記した不均一性の決定が、生体サンプルの分析中に、生物剤を同定することおよび／または生物剤の性質の一部を決定することの助けとなることがある。加えて、試薬を分析レセプタクルの壁に配置するのが一般的である。したがって、生物剤のバイオマスの成長の空間分布は、少なくとも過渡的な形で、試薬の空間的不均一性の影響を受けるが、大域的測定ではこれを決定することは不可能である。特に、不均一性は、生物剤がバイオフィルムを形成する可能性が高いことを示す場合があり、その場合、例えばバイオフィルムの存在に対して医療処置を適応させることによって、特定の措置が講じられることがある。

したがって、本発明は、生体サンプルの分析中、例えば、バイオフィルムを形成する能力など、生物剤の特性を明らかにするために、光軸に沿った生物剤のバイオマスの空間分布における時間に伴う変動を、生体サンプルに提供することを目的とする。

この目的のため、本発明は、分析機器を用いて生体サンプルを分析する方法であって、生体サンプルが、生物剤を含むとともに、ホログラフィックイメージングシステムの視野内で分析レセプタクル内に配置され、ホログラフィックイメージングシステムが、光軸および獲得焦点面を規定する、方法を提供し、方法は、測定期間の複数の測定時間からの各測定時間に対して、
獲得焦点面の光軸上の様々なそれぞれの位置における、生体サンプルの複数のホログラフィック画像を獲得することと、
獲得した各ホログラフィック画像に基づいて、上記ホログラフィック画像の獲得焦点面の位置における生物剤の量を表すバイオマスパラメータの値を決定することと、を含み、
方法は、獲得焦点面の複数の位置に対する１つの測定時間からのバイオマスパラメータの値を使用して、分布インジケータを構築することであって、上記分布インジケータが、上記測定時間における光軸に沿った分析レセプタクル内の生物剤の量の空間分布を表す、分布インジケータを構築することと、分析結果の中から、１つの測定時間における少なくとも１つの分布インジケータから導き出される生物剤のバイオマスの分布の表現を提供することと、を含む。

本発明は、有利には、単独で、または様々な可能な組み合わせにしたがって取り入れられる、以下の様々な特徴によって完成される。
分布インジケータは、獲得焦点面のそれぞれの位置にしたがって、バイオマスパラメータの値を空間的に組織化することによって得られ、または分布インジケータは、獲得焦点面の様々な位置におけるバイオマスパラメータの値に適用される計算によって得られる。
生物剤のバイオマスの分布の表現は、複数の測定時間における複数の分布インジケータから導き出される、生物剤のバイオマスの分布における時間変動の表現である。
方法は、生物剤のそれぞれの測定時間による分布インジケータを空間的に組織化することによって、生物剤のバイオマスの分布における時間変動の表現を構築することを含む。
ホログラフィック画像のバイオマスパラメータは、上記ホログラフィック画像のピクセルのグレーレベルに関する統計から導き出される。
バイオマスパラメータは、ホログラフィック画像の各ピクセルにおけるグレーレベルの絶対値の平均である。
ホログラフィック画像のバイオマスパラメータを決定することは、ホログラフィック画像を事前に正規化することを含み、正規化は、
獲得したホログラフィック画像に平滑化フィルタを適用することによって、背景画像を決定することと、
背景画像のグレーレベルによって、獲得したホログラフィック画像のグレーレベルをピクセル毎に分割することと、を含む。
獲得焦点面の光軸上における様々なそれぞれの位置の数は、分析レセプタクル内では少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０である。
分析レセプタクルは、光軸上の様々な位置に載置された２つの向かい合った透明面を備え、獲得焦点面の光軸上の様々なそれぞれの位置は、一方の透明面から他方の透明面まで延在する。
光軸上における獲得焦点面の少なくとも１つの位置は、２つの透明面の間には載置されず、ならびに／あるいは光軸上における獲得焦点面の位置は、透明面の位置に対応する。
ホログラフィックイメージングシステムは、各獲得焦点面を中心にした光軸の方向で少なくとも１００μｍの被写界深度を規定する。
ホログラフィック画像は、ホログラム、またはホログラムから再構築された画像である。

本発明はまた、ホログラフィック画像を獲得するように構成された視野を有するホログラフィックシステムと、データ処理手段とを備える分析機器に関し、分析機器は、ホログラフィックシステムの視野内で分析レセプタクルに生体サンプルを受け入れ、本発明による方法のステップを実施するように構成される。

本発明の他の特徴、目的、および利点は、単なる例示であって非限定的であり、添付図面に関連して読まれるべきである、以下の説明から明白となるであろう。

本発明の１つの可能な実施形態による、分析されるべき生体サンプルを設置するのに使用されてもよい、ウェルの形態の複数のレセプタクルを備える分析チャートの一例を示す図である。 本発明の１つの可能な実施形態による、分析機器に使用されてもよいホログラフィックイメージングシステムの一例を示す概略図である。 本発明の１つの可能な実施形態による、分析方法のステップを示す図である。 光軸を含む面を横切る分析レセプタクルの断面を示す概略図である。 光軸に沿った生物剤のバイオマスの空間分布の時間に伴う変動を示すグラフィック表現の一例の図である。

生体サンプルを分析する方法は、視野を有するホログラフィックイメージングシステムを備える分析機器を用いて実施され、分析機器は、ホログラフィックイメージングシステムの視野内で分析レセプタクルに生体サンプルを受け入れるように構成される。

図１は、分析されるべき生体サンプルを設置するのに使用することができる、ウェルの形態の複数の分析レセプタクル２を備える分析チャート１の一例を示している。分析レセプタクル２は、本明細書では、ある面上の二次元アレイによって組織化され、各レセプタクル２は、一般的には分析レセプタクル２内に存在する異なる試薬によって、異なる分析条件と関連付けられる。例えば、抗生物質に対する感受性を試験するアンチバイオグラムの枠組みでは、試薬は、様々な濃度の様々な抗生物質で構成される。分析チャート１を使用することは要件ではないが、かかる分析チャート１によって、標準化された形で同じ分析時間で複数の試験を実施することが可能になる。

各分析レセプタクル２は、少なくとも１つの可視光波長で少なくとも部分的に透明であり、あるいは好ましくは、可視スペクトルに対して少なくとも部分的に透明である。この透過性によって、ホログラフィックイメージングシステムなどの光学手段によって、内部に収容された生体サンプルを分析することが可能になる。好ましくは、図４で分かるように、分析レセプタクル２は、光が伝播する透明軸を表すように、少なくとも２つの向かい合った透明面２ａ、２ｂを有する。これら２つの向かい合った透明面２ａ、２ｂは、例えば、１０ｍｍ未満、好ましくは５ｍｍ未満分離される。一般的に、向かい合った透明面２ａ、２ｂは、光軸１６に沿って、０．１ｍｍ超過、好ましくは０．５ｍｍ超過、より好ましくは１ｍｍ超過分離される。一般的に、向かい合った透明面２ａ、２ｂは、分析レセプタクル２を規定する透明フィルムである。試薬は透明面の少なくとも１つに固着させることが一般的である。したがって、試薬は、透明面２ａ、２ｂが分析チャート１に適用される前に、透明面を形成することが意図されるフィルム上に堆積させることによって、分析レセプタクル２に導入されてもよい。

分析レセプタクル２の充填を可能にするために、かかる分析チャート１は、例えば、チューブ４内に準備された種菌３の体積３に浸漬させるように設計された導管５を備えてもよい。種菌は、生物剤を導入するオペレータによって準備され、例えば、スワブを用いてペトリ皿の培養物からサンプリングされ、例えば、生物剤としてのバクテリアの場合は０．５～０．６３ＭｃＦ、生物剤としての酵母の場合は１．８～２．２ＭｃＦである、実施される分析のタイプおよび測定機器に応じた所与の範囲の濁り度に対応する希釈度で、生理食塩水中に懸濁される。この最初の懸濁液はその後さらに、例えば、グラム陰性菌を分析する場合は２０倍もしくはさらには１００倍に、またはグラム陽性菌を分析する場合は１０倍もしくはさらには１００倍に希釈される。後に行われるこの希釈は、特に自動化されてもよく、したがって、チューブ４を分析機器内に設置した後で、測定機器によって実施されてもよい。言うまでもなく、使用されるプロトコルに応じて、他の所与の範囲の濁り度が使用されてもよい。所望の希釈度は、１回で、または上記例のように複数回で得られてもよい。

次に、導管５の一端が、チューブ４の準備によって得られた種菌の体積３に浸漬され、全体が分析機器に導入される。当然ながら、これらの準備ステップのすべてまたは一部が自動化されてもよい。種菌は、導管５を通り、次に分析チャート１内に配置された流体循環回路を介し、分析レセプタクル５間に分配される。導管５および分析チャート１内におけるこの種菌の移動は、毛管現象によって、ならびに／あるいはチューブ４の開放端に存在する空気の減圧によって駆動されてもよい。例えば、減圧によって、大気圧である分析チャート１内に存在する空気は、チューブ５を介して種菌３を通って分析チャート１から出て、種菌３のためのスペースを空け、したがって種菌３がチューブ５を上って分析チャート１内に戻る。反対に、種菌３がチューブ５を上って戻るようにするために、チューブ４の開放端を介して種菌に空気圧を加えることが可能である。それにより、種菌によって形成される生体サンプルが、分析レセプタクル２内に置かれる。

分析機器は、視野のホログラフィック画像を獲得するように構成された、視野を有するホログラフィックイメージングシステムを備える。ホログラフィック画像を獲得することによって深い被写界深度が可能になり、したがって生物剤を検出する非常に良好な感受性が可能になる。ホログラフィック画像を獲得するため、ホログラフィックイメージングシステムは分析レセプタクル２に対向して位置する。非現定例として、図２は、上記ホログラフィックイメージングシステム１０の視野１１が、分析レセプタクル２に収容された生体サンプルの体積内に含まれるように配置された、インラインのホログラフィックイメージングシステム１０を概略的に示している。分析チャート１、またしたがって分析チャート１が備える分析レセプタクル２は、ホログラフィックイメージングシステム１０の物体平面に位置する。ホログラフィックイメージングシステム１０はイメージング軸１６を規定し、イメージング軸１６は、本明細書では光軸に対応する線によって単純化されるが、ホログラフィックイメージングシステム１０の光学構成部品の構成に応じて、光路を規定する一連の連続する線から成ってもよい。

本明細書では光軸１６上における、分析レセプタクル２の一方の側には、十分にコヒーレントな光の照明ビームを用いて、ホログラフィックイメージングシステム１０の視野内の分析レセプタクル２を照明するように構成された、光源４が位置する。光源１４は、照明光を生成してもよく、または単に、場合によっては絞りを備えた、この照明光を伝達する光ファイバーの終端であってもよい。照明ビームは、特定の追加の限定を何ら有さず、ホログラフィックイメージングに対する従来の特性を示す。したがって、照明ビームは、単色光（例えば、約６４０～６７０ｎｍの波長を有する）であってもよく、または場合によっては、例えば順次使用される、複数の波長で構成されてもよい。

本明細書では光軸１６上における、分析レセプタクル２の他方の側には、例えばＣＭＯＳまたはＣＣＤセンサなどのデジタルセンサである、イメージセンサ１２が位置する。イメージセンサ１２は、ホログラフィックイメージングシステム１０の画像面上に位置し、ホログラムを、換言すれば、視野１１内に位置する種菌と照明ビームとの間の相互作用によって引き起こされる干渉の強度の空間分布を獲得するように構成される。

ホログラフィックイメージングシステム１０は、本明細書では、例えば図示される例では、顕微鏡対物レンズ１８ａおよび結像レンズ１８ｂなど、分析レセプタクル２とデジタルイメージセンサ１２との間に配置された、光学素子１８のアセンブリを具備する。しかしながら、顕微鏡対物レンズ１８ａなどの光学素子は任意であり、本発明は、レンズを有するホログラフィック顕微鏡に限定されない。本明細書に記載する構成は、当然ながら１つの非現定例である。様々な光学素子を有する（顕微鏡対物レンズを有するまたは有さないなど）、任意のホログラフィックイメージングシステム１０が使用されてもよい。したがって、ホログラフィックイメージングシステム１０が、生体サンプルによって発生する干渉パターンが現れる画像を獲得することができる限り、このホログラフィックイメージングシステムは、本方法を実施するのに適している。しかしながら、好ましくは、ホログラフィックイメージングシステム１０は、各獲得焦点面２０を中心にした光軸１６の方向で少なくとも１００μｍ、好ましくは少なくとも１５０μｍ、より好ましくは少なくとも２５０μｍの被写界深度を規定するように構成される。一般的に、分析レセプタクル２は、光軸１６に沿って配置された２つの向かい合った透明面２ａ、２ｂを備え、被写界深度は、分析レセプタクルの２つの向かい合った透明面の間で少なくとも１００μｍ超過、好ましくは少なくとも１５０μｍ超過、より好ましくは少なくとも２５０μｍ超過、さらには少なくとも３００μｍ延在する。視野１１は、ホログラムイメージングの上記視野１１から、生物剤が存在することが決定されてもよい、空間として延在する。

測定機器はまた、プロセッサ、メモリ、通信バスなど、データの処理を可能にする構成要素を備える。これらの他の構成要素が、実施する方法および包含する命令にのみ特異的であるものと仮定して、以下では詳述しない。

図３は、上記に詳述した、ホログラフィックイメージングシステム１０の視野１１における分析レセプタクル２内に生体サンプルを最初に設置すること（ステップＳ１）に続く、分析方法のステップを示す図である。方法は、測定期間の複数の測定時間にわたって繰り返す形で実施されるステップで構成される、次の複数のサイクル（ステップＳ０２）を含む。
獲得焦点面の光軸１６上の様々なそれぞれの位置における、生体サンプルの複数のホログラフィック画像を獲得するステップ、
獲得した各ホログラフィック画像から、獲得焦点面の上記位置における生物剤の量を表すバイオマスパラメータの値を決定するステップ。

上記サイクルは、一般的に、分析機器の速度、並行して処理される生体サンプルの数に応じて、また例えば、分析チャート１内の分析レセプタクル２の数に応じて、１分～３０分間続く期間にしたがって繰り返される。測定期間は、数時間、一般的には１０時間超過に及ぶため、測定回数は数十またはさらには数百回になる。

言うまでもなく、獲得焦点面の光軸１６上の様々なそれぞれの位置において生体サンプルの複数のホログラフィック画像を獲得することは、イメージセンサ１２によってホログラフィック画像をそれぞれ獲得する（ステップＳ０２ａ）前に、獲得焦点面を移動させること（ステップＳ０２ｃ）を示唆する。獲得焦点面のこれらの様々な位置は、例えば、イメージセンサ１２および光学素子１８ａ、１８ｂによって形成されるアセンブリ全体を、例えば電動レールまたは電動ターンテーブルを介して、移動させることによって得られてもよい。また、獲得焦点面２０のこれらの様々な位置は、イメージセンサ１２の獲得焦点面を変位させるような形で、イメージセンサ１２に入射する光照射の集光を修正することにより、ホログラフィックイメージングシステム１０の光学素子を修正して獲得焦点面を移動させることによって得ることが可能である。

獲得焦点面の光軸１６上における様々なそれぞれの位置の数は、分析レセプタクルにおいて少なくとも２つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも１５であるが、単純にするため、図４では６つのみが示されている。獲得面をより多くすることによって、光軸１６に沿った生物剤の空間分布の不均一性の分析を改良することが可能になる。獲得焦点面は、好ましくは、光軸１６上の様々なそれぞれの位置が分析レセプタクル２内の多くの異なる深度に対応するように、光軸１６にほぼ垂直な形で延在することが注目されるべきである。

上述したように、分析レセプタクル２は、一般的に、光軸１６上の様々な位置に載置された２つの向かい合った透明面２ａ、２ｂを備え、獲得焦点面２０の光軸１６上の様々なそれぞれの位置２０ａ、２０ｂ，２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆは、一方の透明面２ａ、２ｂから他方の透明面２ａ、２ｂまで延在する。好ましくは、様々なそれぞれの位置２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆは、２つの向かい合った透明面２ａ、２ｂの間で光軸１６に沿って規則的に離される。好ましくは、獲得焦点面の様々なそれぞれの位置２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆは、獲得した各画像が異なる生物剤を表すような形で間隔を空けられる。一般的に、光軸１６上における獲得焦点面の様々なそれぞれの位置２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆは、光軸１６に沿って、０．１ｍｍ超過、好ましくは０．５ｍｍ以上、好ましくは０．８ｍｍ以上の深度にわたって延在する。好ましくは、光軸１６上における獲得焦点面の連続位置２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆは、少なくとも５０μｍ、好ましくは少なくとも１００μｍ、より好ましくは少なくとも１５０μｍ間隔を空けられる。

２つの透明面２ａ、２ｂに近い領域は、生物剤の空間分布を分析するのに好ましい領域を構築する。試薬がこれらの透明面２ａ、２ｂのうち少なくとも１つに存在することがあるという事実は別として、これらの面は、生物剤が、検出すべき特に興味深い特徴である、バイオフィルムを発育させることができる機械的基質も形成する。２つの透明面２ａ、２ｂの一方に隣接した領域が適正にイメージングされることを担保するために、光軸１６上における獲得焦点面の少なくとも１つの位置が、２つの透明面２ａ、２ｂの間に載置されないように配置すること、より正確には、光軸１６上における獲得焦点面の少なくとも２つの位置が、他方の透明面２ａ、２ｂのどちらかの側にあるように配置することが可能である。理想的には、光軸１６上における獲得焦点面の１つの位置が、透明面２ａ、２ｂの位置に対応する。

ホログラフィック画像の獲得中、ホログラフィック画像装置１０がホログラムを獲得し、そのことによって深い被写界深度の利点が、またしたがって生体サンプル中の生物剤の検出に関する高い感受性の利点が提供される。ホログラフィック画像の獲得中、ホログラフィックイメージングシステムがホログラムを獲得する。ホログラムの獲得中、光源１４が、イメージング軸１６に沿った方向Ｚで伝播する参照平面波に対応してもよい、参照照明ビームを放射する。分析レセプタクル２内部の視野１１内に存在する生物剤は、生物剤の回折特性によって、入射参照光を散乱させる。生物剤によって散乱する波および参照波は、イメージセンサ１２上で干渉して、ホログラムを形成する。デジタルイメージセンサ１２は電磁界の強度にのみ感受性を有するので、ホログラムは、散乱波および参照波の追加に対応する視野全体の空間強度分布に対応し、この分布は各ピクセルのグレーレベルの値に対応する。使用されるホログラフィック画像は、ホログラムであってもよく、または例えば、レイリー・ゾンマーフェルトの回折原理に基づいた伝播アルゴリズムを使用して、ホログラムに基づいた逆伝播計算によって再構築された画像であってもよい。再構築せずにホログラムを使用することによって、各生物剤が、上記生物剤の存在によって生じる干渉図に対応するリングに取り囲まれてホログラムに現れるので、高い検出感度を得ることが可能になり、したがって上記生物剤の存在を検出することが容易になる。さらに、再構築しないことによって、時間および処理リソースにおける利得が可能になる。しかしながら、再構築された画像を使用することで、再構築された画像に現れる生物剤を、潜在的には三次元で、正確に局在化することが可能になるなど、他の利点が提供される。ホログラムの場合、かかる再構築された画像は各ピクセルに対してグレーレベルによって規定されてもよい。

好ましくは、ホログラフィック画像のバイオマスパラメータは、上記ホログラフィック画像のピクセルのグレーレベルに関連する統計から導き出され、より好ましくは、バイオマスパラメータは、ホログラフィック画像の各ピクセルのグレーレベルにおける絶対値の平均である。しかしながら、ホログラフィック画像に現れる生物剤の計数、あるいは生物剤が現れるかまたは現れないホログラフィック画像の比率など、他のバイオマスパラメータが使用されてもよい。

好ましくは、ホログラフィック画像のバイオマスパラメータを決定することは、ホログラフィック画像を事前に正規化することを含み、正規化は、
獲得したホログラフィック画像に平滑化フィルタを、好ましくはガウシアンフィルタを適用することによって、背景画像を決定することと、
背景画像のグレーレベルによって、獲得したホログラフィック画像のグレーレベルをピクセル毎に分割することと、を含む。

平滑化フィルタのパラメータ、例えばガウシアンフィルタの標準偏差は、フィルタ処理された画像が、例えばこのフィルタ処理された画像中に認識できる生物剤を有さない、ホログラフィック画像の背景のみを、したがって背景画像という名前を表すような、十分に低いカットオフ周波数を有するローパスフィルタを作成するように選ばれる。画像の正規化は、さらに、分割によってもたらされるホログラフィック画像のグレーレベルに適用される定数を減算することを含んでもよい。それにより、正規化されたホログラフィック画像は、負の値のグレーレベルで得られる。したがって、バイオマスパラメータの値を決定する際に考慮に入れられるグレーレベルの絶対値である。

バイオマスパラメータの複数の値を獲得焦点面の様々な位置に対して同じ測定時間に得ることを可能にする、測定サイクルにしたがって、獲得焦点面のいくつかの位置に対する同じ測定時間からのバイオマスパラメータの値に基づいて、分布インジケータが構築される（ステップＳ０３）。分布インジケータは、この測定時間における光軸に沿った生物剤の量の空間分布を表す。例えば、分布インジケータは、獲得焦点面のそれぞれの位置にしたがって、バイオマスパラメータを空間的に組織化することによって得られてもよい。一般的に、分布インジケータは、バイオマスパラメータの値の濃度の形態を取り、好ましくは、バイオマスパラメータの値が空間的に集結される、空間濃度の形態を取る。したがって、分布インジケータは、成分が様々な位置における生物剤の量に対応する、ベクトルとして解釈されてもよい。一般的に、バイオマスパラメータの様々な値は、それらの値が由来するホログラフィック画像の獲得焦点面のそれぞれの位置と同じ空間的組織化にしたがって組織化される。また、分布インジケータは、１つの測定時間における光軸に沿った生物剤の量の空間分布における均一性または不均一性に対応する、単一の値に対応することが可能である。そのため、分布インジケータは、様々な獲得焦点面におけるバイオマスパラメータの値に適用される計算によって、また特に、バイオマスパラメータの値の間の差によって得られてもよい。例えば、分布インジケータは、獲得焦点面が（光軸上において）ウェルの中央に近いバイオマスパラメータの少なくとも１つの値と、獲得焦点面が透明面２ａ、２ｂに近いバイオマスパラメータの少なくとも１つの値との間の差に対応してもよい。例えば、標準偏差、分散、またはその他など、他の計算が可能である。

したがって、再び図４の例を取ると、第１のホログラフィック画像が第１の位置２０ａで獲得焦点面２０を用いて獲得され、第２のホログラフィック画像が第２の位置２０ｂで獲得焦点面２０を用いて獲得され、次に第３のホログラフィック画像が第３の位置２０ｃで獲得焦点面２０を用いて獲得されるなど、光軸に沿った獲得焦点面２０の各位置２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆに対してホログラフィック画像が獲得されるまで行われている。バイオマスパラメータの値は、各ホログラフィック画像に対して決定され、したがって、第１の位置２０ａに対する第１の値、第２の位置２０ｂに対する第２の値、第３の位置２０ｃに対する第３の値など、各位置２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆと関連付けられる。したがって、分布インジケータを構築するために、第１の値は第２の値に隣接して位置し、第２の値は第３の値に隣接して位置し、第３の値は第４の値に隣接して位置するなどである。したがって、第２の位置２０ｂが第１の位置２０ａと第３の位置２０ｃとの間にあるのと同じく、第２の値は第１の値と第３の値との間にある。したがって、獲得焦点面のそれぞれの位置の空間的組織化が回復される。

したがって、各測定サイクルによって、サイクルが生じる測定時間における光軸１６に沿った生物剤の量の空間分布を表す、分布インジケータを得ることが可能になる。測定サイクルは、一般的に、分析機器の速度、並行して処理される生体サンプルの数に応じて、また例えば、分析チャート１内の分析レセプタクル２の数に応じて、ただし生物剤と試薬との間の相互作用の速度の関数としても、１分～３０分間続く期間で繰り返される。分析の持続時間は、一般的に数時間にわたって続き、したがって方法は、一般的に、この測定期間の間、１０サイクル超過、好ましくは２０測定サイクル超過を含む。

上記測定サイクルに続いて、したがって、複数の測定時間に対応して、複数の測定時間における光軸１６に沿った生物剤の量の空間分布を表す複数の分布インジケータが得られる。好ましくは、方法は続いて、１つの測定時間における少なくとも１つの分布インジケータから導き出される、生物剤のバイオマスの分布の表現を構築すること（Ｓ０４）を含む。好ましくは、生物剤のバイオマスの分布の表現は、複数の測定時間における複数の分布インジケータから導き出される、生物剤のバイオマスの分布における時間変動の表現である。生物剤のバイオマスの分布のこの表現は、分布インジケータをそれぞれの測定時間にしたがって空間的に組織化することによって構築されてもよい。これは、各分布インジケータが特定の測定時間に対応することによるものである。したがって、分布インジケータの組み合わせによって、光軸１６に沿った生物剤のバイオマスの空間分布の時間変動をモニタリングすることが可能になる。好ましくは、これは、時系列的に組織化された分布インジケータの連結である。

図５は、上記時間変動の表現の一例を示している。イメージングされた生体サンプルは、生物剤としての緑膿菌の生理食塩水中における懸濁である。各測定時間に、２７の異なる深度に対応する、光軸に沿った２７の獲得位置焦点面で２７のホログラフィック画像が獲得されている。測定時間は１５分の間隔が空いている。したがって、図５では、縦軸は、深度に対応する光軸に沿ったＺ位置であり、横軸は分単位の時間である。したがって、図の下部は分析レセプタクル２の透明面２ａ、２ｂに対応し、図の上部は他方の透明面２ａ、２ｂに対応し、図の左側は測定期間の始まりに対応し、図の右側は測定期間の終わりに対応する。

この図は、バイオマスパラメータの値を様々なグレーレベルに変換することによって得られている、いくつかの測定時間における分布インジケータから導き出された、グラフィック形態での生物剤のバイオマスの分布の表現に対応する。時間に伴う（左から右への）バクテリアのバイオマスの増加が観察されるが、バイオマスの深度の分布が均一ではなく、時間に伴って変動することも観察され、バクテリアの成長は最初に、面に近い領域２１で起こり、次に分析レセプタクル２の中央２２へと拡散している。実際には、バクテリアである緑膿菌は、バイオフィルムと呼ばれる構造化されたクラスタの形態で発育し、最初に分析レセプタクル２の表面上に延びる。したがって、分析レセプタクル内における生物剤の空間分布は重要な情報であり、例えば、サンプルの生物剤を同定するための、または分析レセプタクル２の１つの面上に配置された試薬との相互作用を評価するための、あるいは生物剤がバイオフィルムを形成する能力を明らかにするための、追加のインジケータを構築してもよい。

結果として、方法は、分析結果（ステップＳ０５）の中から、例えば、１つの測定時間における生物剤の空間分布の情報を提供するため、１つの測定時間における少なくとも１つの分布インジケータから導き出された、生物剤のバイオマスの分布の表現を供給することを含む。生物剤のバイオマスの分布のこの表現は、例えば、画像または曲線またはテーブルなど、グラフィック形態で供給されてもよい。例えば、１つまたは複数の分布インジケータに対応する、数値の形態で供給されてもよい。さらに、生物剤のバイオマスの分布の表現は、単に分布インジケータの１つであることが可能であり、その場合、例えば、生物剤のバイオマスの分布のこの表現をグラフィックで供給するのが望ましい場合を除いて、構築ステップは不要であってもよい。そのため、１つの分布インジケータのみがバイオマスパラメータの値を構成する場合であっても、光軸に沿った生物剤のバイオマスの分布を示す曲線を構築することが可能である。

生物剤のバイオマスの分布における時間変動の表現は、例えば、分布インジケータをそれぞれの測定時間にしたがって空間的に組織化することによって得られてもよい。図５の画像は、グラフィック形態でのかかる表現の一例である。しかしながら、生物剤のバイオマスの分布のこの表現は、例えば、上述したように、曲線またはテーブルまたはさらには数値など、他の形態を取ってもよい。例として、分布インジケータが数値の場合、表現は、分布インジケータの上記数値を時系列的に組織化する、または曲線の形態で表す、テーブルもしくはリストであってもよい。生物剤のバイオマスの分布の表現はまた、例えば分布インジケータの値の間の差など、分布インジケータの値に関する計算からもたらされてもよい。

本明細書では、生物剤のバイオマスの分布の表現は、表現をオペレータに通信し、オペレータによって解釈することを可能にするものと理解される。生物剤のバイオマスの分布の表現は、例えば、表示を可能にするフォーマットで表示画面に表示されてもよく、または印刷するためにプリンタに送信されてもよい。

本発明は、記載され添付図面に示される実施形態に限定されない。特に様々な技術的特徴の構成の観点から、または等価の技術の置換えによって、ただし本発明の保護の分野から逸脱することなく、修正が依然として可能である。

Claims (12)

1. 分析機器を用いて生体サンプルを分析する方法であって、前記生体サンプルが、生物剤を含むとともに、ホログラフィックイメージングシステム（１０）の視野（１１）内で分析レセプタクル（２）内に配置され、前記ホログラフィックイメージングシステム（１０）が、光軸（１６）および獲得焦点面（２０）を規定する、方法において、前記方法が、測定期間の複数の測定時間からの各測定時間に対して、
   前記獲得焦点面（２０）の前記光軸（１６）上の様々なそれぞれの位置（２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆ）における、前記生体サンプルの複数のホログラフィック画像を獲得すること（Ｓ０２ａ）と、
   獲得した各ホログラフィック画像から、前記ホログラフィック画像の前記獲得焦点面の位置における生物剤の量を表すバイオマスパラメータの値を決定すること（Ｓ０２ｂ）と、を含み、
   前記方法が、前記獲得焦点面の複数の位置に対する同じ測定時間からの前記バイオマスパラメータの値を使用して、分布インジケータを構築することであって、前記分布インジケータが、前記測定時間における前記光軸に沿った前記分析レセプタクル内の生物剤の量の空間分布を表す、前記分布インジケータを構築すること（Ｓ０３）と、分析結果の中から、１つの測定時間における少なくとも１つの分布インジケータから導き出される生物剤のバイオマスの分布の表現を提供すること（Ｓ０５）と
   を含む、方法。
2. 前記分布インジケータが、前記獲得焦点面の前記それぞれの位置にしたがって、前記バイオマスパラメータの値を空間的に組織化することによって得られ、または前記分布インジケータが、前記獲得焦点面の様々な位置におけるバイオマスパラメータの値に適用される計算によって得られる、請求項１に記載の方法。
3. 前記生物剤のバイオマスの分布の前記表現が、複数の測定時間における複数の分布インジケータから導き出される、前記生物剤のバイオマスの分布における時間変動の表現である、請求項１または２に記載の分析方法。
4. 前記生物剤のバイオマスのそれぞれの測定時間にしたがって分布インジケータを空間的に組織化することによって、前記生物剤のバイオマスの分布における時間変動の前記表現を構築すること（Ｓ０４）を含む、請求項３に記載の分析方法。
5. ホログラフィック画像の前記バイオマスパラメータが、前記ホログラフィック画像のピクセルのグレーレベルに関連する統計から導き出され、ならびに／あるいは前記バイオマスパラメータが、前記ホログラフィック画像の各ピクセルの前記グレーレベルにおける絶対値の平均である、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
6. ホログラフィック画像の前記バイオマスパラメータを決定することが、前記ホログラフィック画像を事前に正規化することを含み、
   前記獲得したホログラフィック画像に平滑化フィルタを適用することによって、背景画像を決定することと、
   前記背景画像のグレーレベルによって、前記獲得したホログラフィック画像のグレーレベルをピクセル毎に分割することと、
   を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
7. 前記獲得焦点面の前記光軸（１６）上における様々なそれぞれの位置の数が、前記分析レセプタクル内では少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０である、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
8. 前記分析レセプタクルが、前記光軸（１６）上の様々な位置に載置された２つの向かい合った透明面（２ａ、２ｂ）を備え、前記獲得焦点面（２０）の前記光軸（１６）上の様々なそれぞれの位置（２０ａ、２０ｂ，２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆ）が、一方の透明面から他方の透明面まで延在する、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
9. 前記光軸（１６）上における獲得焦点面の少なくとも１つの位置が、前記２つの透明面（２ａ、２ｂ）の間には載置されず、ならびに／あるいは前記光軸（１６）上における獲得焦点面の位置が透明面（２ａ、２ｂ）の位置に対応する、請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法。
10. 前記ホログラフィックイメージングシステムが、各獲得焦点面を中心にした前記光軸（１６）の方向で少なくとも１００μｍの被写界深度を規定する、請求項１から９のいずれか一項に記載の分析方法。
11. 前記ホログラフィック画像が、ホログラム、またはホログラムから再構築された画像である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の分析方法。
12. ホログラフィック画像を獲得するように構成された視野（１１）を有するホログラフィックシステム（１０）と、データ処理手段とを備える分析機器であって、前記ホログラフィックシステム（１０）の前記視野（１１）内で分析レセプタクル（２）に生体サンプルを受け入れ、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法のステップを実施するように構成された、分析機器。

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