FR3114651A1 - Procédé d'analyse d'un échantillon biologique avec détermination de la répartition spatiale de biomasse le long de l'axe optique - Google Patents
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Abstract
Un procédé d'analyse d'un échantillon biologique comprenant des agents biologiques et disposé dans un réceptacle d'analyse dans un champ de vue d'un système d'imagerie holographique définissant un plan focal d'acquisition, avec pour chacun d'une pluralité d'instants de mesure : l'acquisition (S02a) d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives du plan focal d'acquisition, et la détermination (S02b) à partir de chaque image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d'agents biologiques à la position du plan focal d'acquisition, le procédé comprenant la construction (S03) d'un indicateur de répartition à partir de valeurs du paramètre de biomasse d'un même instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d'acquisition,, et la fourniture, parmi les résultats d'analyse (S05), d'une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure. Figure pour l'abrégé : figure 3
Description
La présente invention se rapporte au domaine de l'analyse d'échantillons biologiques par imagerie, et plus particulièrement concerne le suivi au cours du temps de la répartition spatiale de biomasse le long de l'axe optique.
Arrière-plan technologique
L'analyse d'échantillons biologiques par imagerie fait appel à un instrument d'analyse optique dans lequel sont introduits les échantillons biologiques à analyser. Un échantillon biologique est constitué par une suspension d'agents biologiques. Les agents biologiques sont par exemple des micro-organismes (bactéries, levures, moisissures, etc.). L'analyse d'un agent biologique dans l'échantillon biologique peut comprendre l'identification dudit agent biologique ou la détermination d'une caractéristique de cet agent biologique, comme par exemple la concentration minimale inhibitrice d'un antibiotique qui serait efficace à l'encontre dudit agent biologique ou encore la capacité à former un biofilm.
L'échantillon biologique, appelé inoculum dans son état initial est disposé dans un réceptacle, ou puits, au moins partiellement transparent à travers lequel l'instrument d'analyse peut procéder à des mesures de propriétés optiques de l'échantillon biologique. Le puits contient un milieu nutritif et également un ou plusieurs réactifs, tels qu'un substrat enzymatique ou des antibiotiques, destinés à interagir avec des agents biologiques présents dans l'échantillon biologique. Généralement, une pluralité de puits sont prévus pour recevoir chacun de l'inoculum, chacun des puits étant muni de réactifs différents ou d'un même réactif à des concentrations différentes. En fonction de la nature des agents biologiques présents dans l'inoculum, ceux-ci réagissent avec certains réactifs, et pas avec d'autres réactifs, ou à certaines concentrations et pas à d'autres. Par exemple, dans le cadre d'un antibiogramme pour tester les sensibilités aux antibiotiques, les réactifs sont constitués de différents antibiotiques à différentes concentrations, et les agents biologiques vont se multiplier dans les puits contenant les antibiotiques auxquels ils ne sont pas sensibles ou dans lesquels la concentration en antibiotiques est insuffisante, ou verront au contraire leur développement plus ou moins entravés dans les puits contenant les antibiotiques auxquels ils sont sensibles à des concentrations suffisantes.
Ces différences d'interactions entre les agents biologiques et les réactifs se traduisent donc par des évolutions différentes de la biomasse dans les puits. La biomasse, c'est-à-dire la quantité de matière biologique présente dans chaque puits, influe directement les propriétés optiques de l'échantillon biologique présent dans chaque puits, puisque les agents biologiques présentent eux-mêmes des propriétés optiques différentes de la solution dans laquelle ils sont en suspension.
En particulier, la transmittance de l'échantillon biologique est affectée par l'évolution de la concentration en agents biologiques. Pour cette raison, il avait été développé des procédés d'analyse d'échantillons biologiques basé sur la détermination de l'évolution au cours du temps, lors d'une phase d'incubation, de la transmittance globale (ou absorbance, ce qui est équivalent) d'un puits rempli de l'échantillon biologique, afin d'en déterminer une mesure de turbidité, exprimée typiquement en McFarland (McF). Cette mesure de turbidité est directement représentative de la biomasse en agents biologiques dans l'échantillon biologique. Pour ce faire, une diode émettrice éclaire l'échantillon avec un faisceau lumineux d'intensité connue, et une photodiode ponctuelle disposée à l'opposé de la diode émettrice par rapport à l'échantillon permet de déterminer l'intensité lumineuse reçue après que le faisceau lumineux ait traversé l'échantillon biologique. Toutefois, une telle mesure en transmittance présente une sensibilité assez faible, de sorte qu'il n'est pas possible de mesurer une turbidité inférieure à 0,05 McF, voire inférieure à 0,1 McF. De plus, la biomasse ne permet pas toujours de déterminer la concentration d'agents biologiques : en cas d'augmentation du volume des agents biologiques, par exemple par élongation pour des bactéries, la biomasse augmente pour un même nombre d'agents biologiques.
En outre, il s'agit d'une mesure globale, qui ne tient pas compte de la répartition spatiale des agents biologiques à l'intérieur du réceptacle d'analyse, et en particulier le long de l'axe optique (couramment désigné par la coordonnée z). Or, cette répartition peut être fortement hétérogène. Par exemple, certains agents biologiques se développent préférentiellement dans certaines zones du réceptacle, et la mise en évidence de cette hétérogénéité peut alors aider à identifier les agents biologiques et/ou à déterminer certaines de leurs propriétés lors de l'analyse de l'échantillon biologique. De plus, il est courant que les réactifs soient disposés sur une paroi du réceptacle d'analyse. La répartition spatiale de la croissance de la biomasse d'agents biologiques est alors affectée au moins transitoirement par l'hétérogénéité spatiale des réactifs, mais une mesure globale ne permet pas d'en rendre compte. Surtout, hétérogénéité peut indiquer qu'un agent biologique est susceptible de former un biofilm, auquel cas des mesures particulières peuvent être prises, par exemple en adaptant un traitement médical à la présence d'un biofilm.
Présentation de l'invention
L'invention vise donc à permettre, lors de l'analyse d'un échantillon biologique, de disposer pour celle-ci de l'évolution au cours du temps de la répartition spatiale de biomasse d'agents biologiques le long d'un axe optique, par exemple afin de mettre en évidence des caractéristiques des agents biologiques comme la capacité de former un biofilm.
A cet effet, l'invention propose un procédé d'analyse d'un échantillon biologique au moyen d'un instrument d'analyse, l'échantillon biologique comprenant des agents biologiques et étant disposé dans un réceptacle d'analyse dans un champ de vue d'un système d'imagerie holographique, ledit système d'imagerie holographique définissant un axe optique et un plan focal d'acquisition, le procédé comprenant, pour chaque instant de mesure d'une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure :
- l'acquisition d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives sur l'axe optique du plan focal d'acquisition,
- la détermination à partir de chaque image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d'agents biologiques à la position du plan focal d'acquisition de ladite image holographique,
le procédé comprenant la construction d'un indicateur de répartition à partir de valeurs du paramètre de biomasse d'un instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d'acquisition, ledit indicateur de répartition étant représentatif de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique audit instant de mesure, et la fourniture, parmi les résultats d'analyse, d'une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure.
- l'acquisition d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives sur l'axe optique du plan focal d'acquisition,
- la détermination à partir de chaque image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d'agents biologiques à la position du plan focal d'acquisition de ladite image holographique,
le procédé comprenant la construction d'un indicateur de répartition à partir de valeurs du paramètre de biomasse d'un instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d'acquisition, ledit indicateur de répartition étant représentatif de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique audit instant de mesure, et la fourniture, parmi les résultats d'analyse, d'une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure.
L'invention est avantageusement complétée par les différentes caractéristiques suivantes prises seules ou selon leurs différentes combinaisons possibles :
- l'indicateur de répartition est obtenu en organisant spatialement des valeurs du paramètres de biomasse en fonction des positions respectives du plan focal d'acquisition ou l'indicateur de répartition est obtenu par un calcul portant sur des valeurs de paramètres de biomasse à différentes positions du plan focal d'acquisition ;
- la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques est une représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques qui est dérivée de plusieurs indicateurs de répartition à une pluralité d'instants de mesure ;
- le procédé comprend la construction de la représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs ;
- le paramètre de biomasse d'une image holographique est dérivé d'une statistique portant sur les niveaux de gris des pixels de ladite image holographique ;
- le paramètre de biomasse est une moyenne des valeurs absolues des niveaux de gris de chaque pixel de l'image holographique ;
- la détermination du paramètre de biomasse d'une image holographique comprend une normalisation préalable de l'image holographique, comprenant :
- la détermination d'une image de fond par application d'un filtre de lissage sur l'image holographique acquise,
- la division pixel à pixel des niveaux de gris de l'image holographique acquise par les niveaux de gris de l'image de fond ;
- les différentes positions respectives sur l'axe optique des plans focaux d'acquisition sont au moins au nombre de 10 dans le réceptacle d'analyse, et de préférence au moins 20 ;
- le réceptacle d'analyse comprend deux faces transparentes opposées situées à différentes positions sur l'axe optique, et les différentes positions respectives sur l'axe optique des plans focaux d'acquisition s'étendent d'une face transparente à l'autre face transparente ;
- le système d'imagerie holographique définit une profondeur de champ d'au moins 100 µm de profondeur dans la direction de l'axe optique autour de chaque plan focal d'acquisition ;
- l'image holographique est un hologramme ou une image reconstruite à partir d'un hologramme.
- l'indicateur de répartition est obtenu en organisant spatialement des valeurs du paramètres de biomasse en fonction des positions respectives du plan focal d'acquisition ou l'indicateur de répartition est obtenu par un calcul portant sur des valeurs de paramètres de biomasse à différentes positions du plan focal d'acquisition ;
- la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques est une représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques qui est dérivée de plusieurs indicateurs de répartition à une pluralité d'instants de mesure ;
- le procédé comprend la construction de la représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs ;
- le paramètre de biomasse d'une image holographique est dérivé d'une statistique portant sur les niveaux de gris des pixels de ladite image holographique ;
- le paramètre de biomasse est une moyenne des valeurs absolues des niveaux de gris de chaque pixel de l'image holographique ;
- la détermination du paramètre de biomasse d'une image holographique comprend une normalisation préalable de l'image holographique, comprenant :
- la détermination d'une image de fond par application d'un filtre de lissage sur l'image holographique acquise,
- la division pixel à pixel des niveaux de gris de l'image holographique acquise par les niveaux de gris de l'image de fond ;
- les différentes positions respectives sur l'axe optique des plans focaux d'acquisition sont au moins au nombre de 10 dans le réceptacle d'analyse, et de préférence au moins 20 ;
- le réceptacle d'analyse comprend deux faces transparentes opposées situées à différentes positions sur l'axe optique, et les différentes positions respectives sur l'axe optique des plans focaux d'acquisition s'étendent d'une face transparente à l'autre face transparente ;
- le système d'imagerie holographique définit une profondeur de champ d'au moins 100 µm de profondeur dans la direction de l'axe optique autour de chaque plan focal d'acquisition ;
- l'image holographique est un hologramme ou une image reconstruite à partir d'un hologramme.
L'invention concerne également un instrument d'analyse comprenant un système holographique avec un champ de vue configuré pour acquérir une image holographique et des moyens de traitement de données, l'instrument d'analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse dans le champ de vue du système holographique et pour mettre en œuvre les étapes du procédé selon l'invention.
Présentation des figures
D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels :
Description détaillée
Le procédé d'analyse d'un échantillon biologique est mené au moyen d'un instrument d'analyse comprenant un système d'imagerie holographique avec un champ de vue, l'instrument d'analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse dans le champ de vue du système d'imagerie holographique.
Lafigure 1montre un exemple de carte d'analyse 1 comportant une pluralité de réceptacles d'analyse 2 sous forme de puits pouvant être utilisée pour la mise en place d'un échantillon biologique à analyser. Les réceptacles d'analyse 2 sont ici organisés selon un réseau bidimensionnel sur un plan, chaque réceptacle 2 étant associé à des conditions d'analyse différentes, typiquement au moyen de réactifs différents présents dans les réceptacles d'analyse 2. Par exemple, dans le cadre d'un antibiogramme pour tester les sensibilités aux antibiotiques, les réactifs sont constitués de différents antibiotiques à différentes concentrations. L'utilisation d'une carte d'analyse 1 n'est pas requise, mais une telle carte d'analyse 1 permet de procéder pendant une même durée d'analyse à une pluralité de test de façon standardisée.
Chaque réceptacle d'analyse 2 est au moins partiellement transparent à au moins une longueur d'onde de lumière, visible ou non, et de préférence est au moins partiellement transparent pour le spectre visible. Cette transparence permet l'analyse de l'échantillon biologique qui y est contenu par des moyens optiques tels que le système d'imagerie holographique. De préférence, et comme visible sur lafigure 4, un réceptacle d'analyse 2 présente au moins deux faces transparentes 2a, 2b opposées, de sorte à présenter un axe transparent pour la propagation de la lumière. Ces deux faces transparentes opposées 2a, 2b sont par exemple distantes de moins de 10 mm, et de préférence de moins de 5 mm. Typiquement, les faces transparentes opposées 2a, 2b sont des films transparents définissant le réceptacle d'analyse 2. Il est courant que les réactifs soient fixés sur au moins une des faces transparentes. Les réactifs peuvent ainsi être introduits dans le réceptacle d'analyse 2 en les disposant sur le film destiné à former une face transparente 2a, 2b, avant que celui-ci soit appliqué sur la carte d'analyse 1.
Afin de permettre le remplissage des réceptacles d'analyse 2, une telle carte d'analyse 1 peut par exemple comporter un conduit 5 destiné à être plongé dans un volume 3 d'inoculum 3 préparé dans un tube 4. L'inoculum est préparé par un opérateur qui introduit des agents biologiques, par exemple prélevés d'une culture dans une boîte de Petri au moyen d'une tige ou d'un écouvillon, en suspension dans une solution saline, avec une dilution correspondant à une plage déterminée de turbidité, par exemple entre 0,5 et 0,63 McF pour des bactéries en tant qu'agents biologiques ou encore entre 1,8 et 2,2 McF pour des levures en tant qu'agents biologiques, la plage dépendant du type d'analyse effectuée et de l'instrument de mesure. Cette suspension préalable est ensuite diluée encore, par exemple avec un facteur 20, voire 100, pour analyser des bactéries Gram- ou avec un facteur 10, voire 100, pour analyser des bactéries Gram+. Cette dilution ultérieure peut notamment être automatisée, et donc être effectuée par l'instrument de mesure après la mise en place du tube 4 dans l'instrument d'analyse. Bien entendu d'autres plages déterminées de turbidité peuvent être utilisées, en fonction des protocoles utilisés. La dilution désirée peut être obtenue en une fois, ou comme dans l'exemple ci-dessus, en plusieurs fois.
Une extrémité du conduit 5 est alors plongée dans le volume 3 d'inoculum résultant de la préparation dans le tube 4, et l'ensemble est introduit dans l'instrument d'analyse. Bien entendu, tout ou partie de ces étapes de préparation peuvent être automatisées. L'inoculum voyage à travers le conduit 5, puis par un circuit de circulation fluidique ménagé dans la carte d'analyse 1, se répartit entre les réceptacles d'analyse 5. Ce déplacement de l'inoculum dans le conduit 5 et la carte d'analyse 1 peut être causé par capillarité et/ou par une dépressurisation de l'air présent à l'extrémité ouverte du tube 4. Par exemple avec la dépressurisation, l'air présent dans la carte d'analyse 1, qui est à pression atmosphérique, sort de la carte d'analyse 1 par le tube 5 à travers l'inoculum 3 et laisse sa place à l'inoculum 3 qui remonte ainsi par le tube 5 dans la carte d'analyse 1. A l'inverse, il est possible de procéder à une application d'une pression d'air s'exerçant sur l'inoculum par l'intermédiaire de l'extrémité ouverte du tube 4 pour provoquer la remontée du tube 5 par l'inoculum 3. L'échantillon biologique constitué par l'inoculum est alors en place dans un réceptacle d'analyse 2.
L'instrument d'analyse comprend un système d'imagerie holographique avec un champ de vue configuré pour acquérir une image holographique de ce champ de vue. L'acquisition d'une image holographique permet une profondeur de champ importante, et donc une très bonne sensibilité de détection des agents biologiques. Lors de l'acquisition d'une image holographique, le système d'imagerie holographique est placé face à un réceptacle d'analyse 2. A titre d'exemple non limitatif, lafigure 2représente schématiquement un système d'imagerie holographique 10 en ligne disposé de sorte que le champ de vue 11 dudit système d'imagerie holographique 10 se trouve contenu dans le volume d'échantillon biologique contenu dans un réceptacle d'analyse 2. La carte d'analyse 1, et donc les réceptacles d'analyse 2 qu'elle comprend, est placée dans un plan objet du système d'imagerie holographique 10. Le système d'imagerie holographique 10 définit un axe d'imagerie 16, simplifié ici par une droite correspondant à l'axe optique mais qui peut consister en un ensemble de droites successives définissant le trajet lumineux, en fonction de la configuration des composants optiques du système d'imagerie holographique 10.
D'un côté du réceptacle d'analyse 2, ici sur l'axe optique 16, se trouve une source lumineuse 4 configurée pour illuminer le réceptacle d'analyse 2 dans le champ de vue (ou « field-of-view ») du système d'imagerie holographique 10 au moyen d'un faisceau d'illumination de lumière suffisamment cohérente. La source lumineuse 14 peut produire la lumière d'illumination, ou être simplement la terminaison d'une fibre optique acheminant cette lumière d'illumination, éventuellement pourvue d'un diaphragme ou iris. Le faisceau d'illumination présente les caractéristiques conventionnelles pour l'imagerie holographique, sans contraintes additionnelle particulière. Le faisceau d'illumination peut ainsi être monochromatique (par exemple avec une longueur d'onde autour de 640-670 nm) ou possiblement être composé de plusieurs longueurs d'onde, par exemple utilisées l'une après l'autre.
De l'autre côté du réceptacle d'analyse 2, ici sur l'axe optique 16, se trouve un capteur d'image 12, qui est un capteur numérique comme par exemple un capteur CMOS ou CCD. Le capteur d'image 12 est placé sur un plan image du système d'imagerie holographique 10, et est configuré pour acquérir un hologramme, c'est-à-dire une distribution spatiale d'intensité des interférences causées par des interactions entre l'inoculum placé dans le champ de vue 11 le faisceau d'illumination.
Le système d'imagerie holographique 10 est ici muni d'un ensemble d'organes optiques 18 disposés entre le réceptacle d'analyse 2 et le capteur d’image numérique 12 comme par exemple un objectif de microscope 18a et une lentille de tube 18b dans l'exemple illustré. Un organe optique tel que l'objectif de microscope 18a est cependant optionnel, l'invention n'étant pas limitée à la microscopie holographique avec lentille. L'arrangement décrit ici est bien entendu un exemple non limitatif. Tout système d'imagerie holographique 10 peut être utilisé, avec différents organes optiques (avec ou sans objectif de microscope, etc.). Ainsi, dès lors qu'un système d'imagerie holographique 10 peut acquérir une image dans laquelle apparaissent les motifs d’interférence générées par l'échantillon biologique, ce système d'imagerie holographique convient à la mise en œuvre du procédé. De préférence toutefois, le système d'imagerie holographique 10 est configuré pour définir une profondeur de champ d'au moins 100 µm de profondeur dans la direction de l'axe optique 16 autour de chaque plan focal d'acquisition 20, et de préférence au moins 150 µm, et de préférence encore au moins 250 µm. Typiquement, le réceptacle d'analyse 2 comprend deux faces transparentes 2a, 2b opposées organisées le long de l'axe optique 16, et la profondeur de champ s'étend sur au moins 100 µm entre les deux faces transparentes opposées du réceptacle d'analyse, et de préférence sur au moins 150 µm, et de préférence encore sur au moins 250 µm, voire au moins 300 µm. Le champ de vue 11 s'entend comme étant l'espace dans lequel la présence d'agents biologiques peut être déterminée à partir d'un hologramme imageant ledit champ de vue 11.
L'instrument de mesure comprend également des composants permettant de traiter des données, tel qu'un processeur, une mémoire, des bus de communication, etc. Dans la mesure où ces autres composants ne sont spécifiques que par le procédé qu'ils mettent en œuvre et par les instructions qu'ils contiennent, ils ne seront pas détaillés dans la suite.
Lafigure 3est un diagramme illustrant des étapes du procédé d'analyse, qui font suite à une mise en place (étape S1) préalable de l'échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse 2 dans le champ de vue 11 d'un système d'imagerie holographique 10, détaillée plus haut. Le procédé comprend une pluralité de cycles (étapes S02) constitués d'étapes mises en œuvre de manière répétée pour une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure :
- l'acquisition d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives sur l'axe optique 16 du plan focal d'acquisition,
- l'acquisition d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives sur l'axe optique 16 du plan focal d'acquisition,
- la détermination à partir de chaque image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d'agents biologiques à ladite position du plan focal d'acquisition.
Ces cycles sont typiquement répétés selon une période allant de une minute à 30 minutes, en fonction de la rapidité de l'instrument d'analyse, du nombre d'échantillons biologiques traités en parallèle, et par exemple en fonction du nombre de réceptacles d'analyse 2 dans une carte d'analyse 1. La durée de mesure s'étend sur plusieurs heures, et typiquement plus de 10 heures, résultants en plusieurs dizaines voire plusieurs centaines d'instants de mesure.
Bien entendu, l'acquisition d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives sur l'axe optique 16 du plan focal d'acquisition implique un déplacement du plan focal d'acquisition (étape S02c) préalablement à chaque acquisition d'une image holographique par le capteur d'image 12 (étape S02a). Ces différentes positions du plan focal d'acquisition peuvent être obtenues par exemple en déplaçant l'ensemble formé par le capteur d'image 12 et les organes optiques 18a, 18b, par exemple via un rail motorisé ou une platine motorisée. Il est également possible d'obtenir ces différentes positions du plan focal d'acquisition 20 par la modification d'un organe optique du système d'imagerie holographique 10 déplaçant le plan focal d'acquisition, en modifiant une focalisation de rayons lumineux incident au capteur d'image 12 de manière à déplacer le plan focal d'acquisition du capteur d'image 12.
Les différentes positions respectives sur l'axe optique 16 des plans focaux d'acquisition sont au moins au nombre de 2 dans le réceptacle d'analyse, de préférence au moins 5, et de préférence encore au moins 15, bien que seulement six d'entre elles soient illustrées sur la figure 4, à des fins de simplification. Un plus grand nombre de plans d'acquisition permet d'affiner l'analyse de l'hétérogénéité de la répartition spatiale des agents biologiques le long de l'axe optique 16. Il est à noter que les plans focaux d'acquisition s'étendent de préférence de façon sensiblement perpendiculaire à l'axe optique 16, de sorte que les différentes positions respectives sur l'axe optique 16 correspondent à autant de profondeurs différentes dans le réceptacle d'analyse 2.
Comme précédemment mentionné, le réceptacle d'analyse 2 comprend typiquement deux faces transparentes 2a, 2b opposées situées à différentes positions sur l'axe optique 16, et différentes positions respectives 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f sur l'axe optique 16 des plans focaux d'acquisition 20 s'étendent d'une face transparente 2a, 2b à l'autre face transparente 2a, 2b. De préférence, différentes positions respectives 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f sont régulièrement espacées le long de l'axe optique 16 entre les deux faces transparentes 2a, 2b opposées. Les zones à proximité des deux faces transparentes 2a, 2b constituent des zones privilégiées d'analyse de la répartition spatiale des agents biologiques. Outre le fait que les réactifs peuvent être présents sur au moins une de ces faces transparentes 2a, 2b, ces faces constituent également des supports mécaniques sur lesquels les agents biologiques peuvent développer un biofilm, caractéristique particulièrement intéressante à détecter. Afin de s'assurer qu'une zone à proximité immédiate d'une des deux faces transparentes 2a, 2b soit correctement imagée, il est possible de prévoir qu'au moins une position d'un plan focal d'acquisition sur l'axe optique 16 ne soit pas située entre les deux faces transparentes 2a, 2b, et plus précisément qu'au moins deux positions de plans focaux d'acquisition sur l'axe optique 16 soient de part et d'autre d'une face transparente 2a, 2b. Idéalement, une position d'un plan focal d'acquisition sur l'axe optique 16 correspond à la position d'une face transparente 2a, 2b.
Lors de l'acquisition d'une image holographique, l'imageur holographique 10 acquiert un hologramme, ce qui présente l'avantage d'offrir une grande profondeur de champ, et donc une grande sensibilité de détection des agents biologiques dans l'échantillon biologique. Lors de l'acquisition d'une image holographique, le système d'imagerie holographique acquiert un hologramme. Lors de l'acquisition d'un hologramme, la source lumineuse 14 émet un faisceau d'illumination de référence, qui peut être traduite par une onde plane de référence se propageant dans la direction Z le long de l'axe d'imagerie 16. Les agents biologiques présents dans le champ de vue 11 à l'intérieur du réceptacle d'analyse 2, par leurs propriétés de diffraction, diffusent la lumière de référence incidente. L'onde diffusée par les agents biologiques et l'onde de référence interfèrent sur le capteur d'image 12 pour former l'hologramme. Puisqu'un capteur d'image 12 numérique n'est sensible qu'à l'intensité du champ électromagnétique, l'hologramme correspond à la distribution spatiale d'intensité du champ total correspondant à l'addition de l'onde diffusée et de l'onde de référence, qui est traduite par une valeur de niveau de gris pour chaque pixel. L'image holographique exploitée peut être l'hologramme ou peut être une image reconstruite par calcul de rétropropagation à partir de l'hologramme, en utilisant un algorithme de propagation par exemple basé sur la théorie de la diffraction de Rayleigh Sommerfeld. Utiliser l'hologramme sans reconstruction permet de bénéficier d'une grande sensibilité de détection, car chaque agent biologique apparaît dans l'hologramme entouré d'anneaux correspondant aux figures d'interférences causées par la présence desdits agents biologiques, facilitant d'autant la détection de la présence de ces agents biologiques. En outre, la non-reconstruction permet un gain de temps et de ressource de calcul. Toutefois, utiliser une image reconstruite présente d'autres avantages, comme celui de permettre de localiser précisément, possiblement en trois dimensions, les agents biologiques apparaissant dans l'image reconstruite. De même que l'hologramme, une telle image reconstruite peut être définie par des niveaux de gris pour chaque pixel.
De préférence, le paramètre de biomasse d'une image holographique est dérivé d'une statistique portant sur les niveaux de gris des pixels de ladite image holographique, et de préférence encore, le paramètre de biomasse est une moyenne des valeurs absolues des niveaux de gris de chaque pixel de l'image holographique. D'autres paramètres de biomasse peuvent cependant être utilisés, comme par exemple un comptage des agents biologiques apparaissant dans l'image holographique, ou bien encore la proportion de l'image holographique dans laquelle apparaissent ou non des agents biologiques.
De préférence, la détermination du paramètre de biomasse d'une image holographique comprend une normalisation préalable de l'image holographique, comprenant :
- la détermination d'une image de fond par application d'un filtre de lissage, de préférence un filtre gaussien, sur l'image holographique acquise,
- la division pixel à pixel des niveaux de gris de l'image holographique acquise par les niveaux de gris de l'image de fond.
- la détermination d'une image de fond par application d'un filtre de lissage, de préférence un filtre gaussien, sur l'image holographique acquise,
- la division pixel à pixel des niveaux de gris de l'image holographique acquise par les niveaux de gris de l'image de fond.
Les paramètre du filtre de lissage, par exemple l'écart-type pour un filtre gaussien, sont choisies pour créer un filtre passe-bas avec une fréquence de coupure suffisamment basse pour que l'image filtrée ne soit représentative que de l'arrière-plan de l'image holographique, d'où la dénomination image de fond, sans par exemple que ne soient discernables les agents biologiques dans cette image filtrée. La normalisation de l'image peut en outre comprendre une soustraction d'une constante opérée sur les niveaux de gris de l'image holographique résultant de la division. On peut alors obtenir une image holographique normalisée avec des valeurs de niveaux de gris négatifs. Ce sont donc alors les valeurs absolues des niveaux de gris qui sont prises en compte pour déterminer les valeurs du paramètre de biomasse.
A la suite d'un cycle de mesure, qui permet d'obtenir une pluralité de valeurs du paramètre de biomasse à un même instant de mesure pour différentes positions du plan focal d'acquisition, un indicateur de répartition est construit (étape S03) à partir de valeurs du paramètre de biomasse d'un même instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d'acquisition. L'indicateur de répartition est représentatif de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique à cet instant de mesure. Par exemple, l'indicateur de répartition peut être étant obtenu en organisant spatialement les paramètres de biomasse en fonction des positions respectives de leurs plans focaux d'acquisition. Typiquement, l'indicateur de répartition prend la forme d'une concaténation des valeurs du paramètre de biomasse, et de préférence prend la forme d'une concaténation spatiale, dans laquelle les valeurs du paramètre de biomasse sont spatialement concaténées. L'indicateur de répartition peut donc être interprété comme un vecteur dont les composantes rendent compte de la quantité d'agents biologiques à différentes positions. Typiquement, les différentes valeurs du paramètre de biomasse sont organisées selon la même organisation spatiale que les positions respectives des plans focaux d'acquisition des images holographiques dont ils proviennent. Il est également possible que l'indicateur de répartition corresponde à une seule valeur, qui rend compte de l'homogénéité ou de l'hétérogénéité de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique à un instant de mesure. L'indicateur de répartition peut ainsi être obtenu par un calcul portant sur des valeurs de paramètres de biomasse à différents plans focaux d'acquisition, et en particulier par des différences entre ces valeurs. Par exemple, un indicateur de répartition peut correspondre à une différence entre au moins une valeur du paramètre de biomasse avec un plan focal d'acquisition proche du milieu du puits (sur l'axe optique), et au moins une valeur du paramètre de biomasse avec un plan focal d'acquisition proche d'une face transparente 2a, 2b. D'autres calculs sont possibles, comme par exemple un écart-type, une variance, ou autre.
Ainsi, en reprenant l'exemple de lafigure 4, une première image holographique est acquise avec un plan focal d'acquisition 20 à une première position 20a, puis une deuxième image holographique est acquise avec un plan focal d'acquisition 20 à une deuxième position 20b, puis une troisième image holographique est acquise avec un plan focal d'acquisition 20 à une troisième position 20c, etc., jusqu'à ce qu'une image holographique ait été acquise pour chaque position 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f du plan focal d'acquisition 20 le long de l'axe optique. Une valeur du paramètre de biomasse est déterminée pour chaque image holographique, et donc est associée à chaque position 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f : une première valeur pour la première position 20a, une deuxième valeur pour la deuxième position 20b, une troisième valeur pour la troisième position 20c, etc. Pour construire l'indicateur de répartition, la première valeur est donc placée adjacente à la deuxième valeur, elle-même placée adjacente à la troisième valeur, elle-même placée adjacente à la quatrième valeur etc. La deuxième valeur se trouve donc entre la première valeur et la troisième valeur, tout comme la deuxième position 20b est entre la première position 20a et la troisième position 20c. L'organisation spatiale des positions respectives des plans focaux d'acquisition est donc reprise.
Chaque cycle de mesure permet donc d'obtenir un indicateur de répartition représentatif de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique 16 à l'instant de mesure dans lequel s'inscrit le cycle. Les cycles de mesure sont typiquement répétés selon une période allant d'une minute à 30 minutes, en fonction de la rapidité de l'instrument d'analyse, du nombre d'échantillon biologiques traités en parallèle, et par exemple en fonction du nombre de réceptacles d'analyse 2 dans une carte d'analyse 1, mais également en fonction de la vitesse des interactions entre les agents biologiques et les réactifs. La durée d'analyse s'étend typiquement sur plusieurs heures, et le procédé comprend ainsi typiquement plus de 10 cycles, et de préférence plus de 20 cycles de mesure au cours de cette durée de mesure.
A la suite de ces cycles de mesure, correspondant à une pluralité d'instants de mesure, on dispose donc une pluralité d'indicateurs de répartition représentatifs de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique 16 à une pluralité d'instants de mesure. Le procédé comprend ensuite de préférence la construction (S04) d'une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques, qui est dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure. De préférence, la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques est une représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques qui est dérivée de plusieurs indicateurs de répartition à une pluralité d'instants de mesure. Cette représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques peut être construite en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs. En effet, chaque indicateur de répartition correspond à un instant de mesure particulier. La combinaison des indicateurs de répartition permet donc de suivre l'évolution temporelle de la répartition spatiale de la biomasse d'agents biologiques le long de l'axe optique 16. De préférence, il s'agit d'une concaténation d'indicateurs de répartition, organisés chronologiquement.
Lafigure 5montre un exemple de représentation de cette évolution temporelle. L'échantillon biologique imagé est une suspension dans une solution saline dePseudomonas aeruginosaen tant qu'agents biologiques. A chaque instant de mesure, 27 images holographiques ont été acquises à 27 positions de plans focaux d'acquisition le long de l'axe optique, correspond à 27 profondeurs différentes. Les instants de mesure sont espacés de 15 minutes. Ainsi, sur la figure 5, l'axe des ordonnées est celui des positions en Z le long de l'axe optique, correspondant à la profondeur, et l'axe des abscisses est celui du temps, en minutes. Le bas de la figure correspond donc à une face transparente 2a, 2b du réceptacle d'analyse 2, et le haut de la figure correspond à l'autre face transparente 2a, 2b, tandis que la gauche de la figure correspond au début de la durée de mesure et la droite de la figure correspond à la fin de la durée de mesure.
Cette figure correspond à une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques sous forme graphique, dérivée des indicateurs de répartition à plusieurs instants de mesure, qui a été obtenue en traduisant les valeurs du paramètre de biomasse par différentes nuances de gris. On constate une augmentation de la biomasse de bactéries avec le temps (de gauche à droite), mais également que la répartition en profondeur de la biomasse n'est pas uniforme, et évolue avec le temps : la croissance des bactéries intervient d'abord des une zone 21 proche d'une face, puis se diffuse dans le centre 22 du réceptacle d'analyse 2. De fait, les bactériesPseudomonas aeruginosase développent sous forme d'agrégats structurés appelés biofilms, qui s'étendent d'abord sur les surfaces du réceptacle d'analyse 2. Ainsi, la répartition spatiale des agents biologiques dans le réceptacle d'analyse est une information importante, pouvant par exemple constituer un indicateur supplémentaire pour identifier les agents biologiques de l'échantillon, ou pour évaluer les interactions avec des réactifs disposés sur une face du réceptacle d'analyse 2, ou bien encore pour révéler la capacité de l'agent biologique à former un biofilm.
Par conséquent, le procédé comprend la fourniture, parmi les résultats d'analyse (étape S05), de la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure, par exemple pour informer sur la répartition spatiale des agents biologiques à un instant de mesure. Cette représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques peut par exemple être fournie sous forme graphique, comme une image ou une courbe ou un tableau. Elle peut être fournie sous la forme de valeurs numériques, par exemple correspondant à un ou plusieurs indicateurs de répartition. Il est d'ailleurs possible que la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques soit simplement un des indicateurs de répartition, auquel cas aucune étape de construction peut n'être nécessaire, sauf par exemple s'il est souhaité fournir graphiquement cette représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques. Ainsi, même avec un seul indicateur de répartition constitué de valeurs du paramètre de biomasse, il est possible de construire une courbe montrant la répartition de la biomasse d'agents biologiques le long de l'axe optique.
Une représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques peut par exemple être obtenue en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs. L'image de lafigure 5est un exemple d'une telle représentation sous forme graphique. Toutefois, cette représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques peut prendre d'autre forme, comme par exemple une courbe ou un tableau ou même une valeur numérique, comme évoqué précédemment. A titre d'exemple, lorsque les indicateurs de répartition sont des valeurs numériques, la représentation peut être un tableau ou une liste organisant chronologiquement lesdites valeurs numériques des indicateurs de répartitions, ou le représentant sous forme de courbes. La représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques peut également résulter de calcul portant sur des valeurs d'indicateurs de répartition, comme par exemple des différences entre ces valeurs.
La représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques est ici entendue comme permettant sa communication à un opérateur, et son interprétation par celui-ci. La représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques peut par exemple être affichée par un écran d'affichage, mise sous un format permettant son affichage, ou peut être transmise à une imprimante pour être imprimée.
L'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux figures annexées. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers caractéristiques techniques ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.
Claims (12)
- Procédé d'analyse d'un échantillon biologique au moyen d'un instrument d'analyse, l'échantillon biologique comprenant des agents biologiques et étant disposé dans un réceptacle d'analyse (2) dans un champ de vue (11) d'un système d'imagerie holographique (10), ledit système d'imagerie holographique (10) définissant un axe optique (16) et un plan focal d'acquisition (20), le procédé comprenant, pour chaque instant de mesure d'une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure :
- l'acquisition (S02a) d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives (20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f) sur l'axe optique (16) du plan focal d'acquisition (20),
- la détermination (S02b) à partir de chaque image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d'agents biologiques à la position du plan focal d'acquisition de ladite image holographique,
le procédé comprenant la construction (S03) d'un indicateur de répartition à partir de valeurs du paramètre de biomasse d'un même instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d'acquisition, , ledit indicateur de répartition étant représentatif de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique à un instant de mesure, et la fourniture, parmi les résultats d'analyse (S05), d'une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure. - Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'indicateur de répartition est obtenu en organisant spatialement des valeurs du paramètres de biomasse en fonction des positions respectives du plan focal d'acquisition ou l'indicateur de répartition est obtenu par un calcul portant sur des valeurs de paramètres de biomasse à différentes positions du plan focal d'acquisition.
- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques est une représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques qui est dérivée de plusieurs indicateurs de répartition à une pluralité d'instants de mesure.
- Procédé d'analyse selon la revendication 3, comprenant la construction (S04) de la représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs.
- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le paramètre de biomasse d'une image holographique est dérivé d'une statistique portant sur les niveaux de gris des pixels de ladite image holographique.
- Procédé d'analyse selon la revendication précédente, dans lequel le paramètre de biomasse est une moyenne des valeurs absolues des niveaux de gris de chaque pixel de l'image holographique.
- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détermination du paramètre de biomasse d'une image holographique comprend une normalisation préalable de l'image holographique, comprenant :
- la détermination d'une image de fond par application d'un filtre de lissage sur l'image holographique acquise,
- la division pixel à pixel des niveaux de gris de l'image holographique acquise par les niveaux de gris de l'image de fond. - Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les différentes positions respectives sur l'axe optique (16) des plans focaux d'acquisition sont au moins au nombre de 10 dans le réceptacle d'analyse, et de préférence au moins 20.
- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le réceptacle d'analyse comprend deux faces transparentes (2a, 2b) opposées situées à différentes positions sur l'axe optique (16), et les différentes positions respectives (20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f) sur l'axe optique (16) des plans focaux d'acquisition (20) s'étendent d'une face transparente à l'autre face transparente.
- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le système d'imagerie holographique définit une profondeur de champ d'au moins 100 µm de profondeur dans la direction de l'axe optique (16) autour de chaque plan focal d'acquisition.
- Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'image holographique est un hologramme ou une image reconstruite à partir d'un hologramme.
- Instrument d'analyse comprenant un système holographique (10) avec un champ de vue (11) configuré pour acquérir une image holographique et des moyens de traitement de données, l'instrument d'analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse (2) dans le champ de vue (11) du système holographique (10) et pour mettre en œuvre les étapes du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
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