JP2023544535A - 初期コンプライアンス分析を含む生体サンプルの分析方法 - Google Patents

初期コンプライアンス分析を含む生体サンプルの分析方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、分析機器を使用して生体サンプルを分析する方法に関し、上記方法は、生体サンプルがホログラフィック画像装置の視野内で分析レセプタクル内に配置された後（Ｓ０１）に実施され、測定期間中の複数の測定時間について繰り返す形で実施される、生体サンプルのホログラフィック画像を獲得すること（Ｓ０２ａ）と、獲得したホログラフィック画像から、視野内における生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値を決定すること（Ｓ０２ｂ）と、を含むステップ（Ｓ０２）を含み、方法は、測定期間の最初の１時間以内の少なくとも１つの測定時間について、分布パラメータの値をコンプライアンス範囲と比較することを含む、初期コンプライアンスチェック（Ｓ０３）を含み、上記値が範囲外である場合、測定機器は非コンプライアンス警告を発行する（Ｓ０５）。【選択図】図３

Description

本発明は、イメージングによる生体サンプルの分析の分野に関し、より詳細には、生体サンプル中の生物剤の分析に関連する生体サンプルのコンプライアンスのチェックに関する。
イメージングによる生体サンプルの分析は、分析すべき生体サンプルが導入される光学分析機器を利用する。生体サンプルは、生物剤の懸濁または生物剤の懸濁の混合物から成る。生物剤は、例えば、微生物（バクテリア、酵母、かびなど）である。生体サンプル中の生物剤の分析は、上記生物剤を同定すること、または例えば、上記生物剤に対して有効であろう抗生物質の最小発育阻止濃度など、この生物剤の特性を決定することを含むことができる。
生体サンプルは種菌として知られ、初期状態では、少なくとも部分的に透明なレセプタクル、即ちウェル内に配置され、分析機器は、ウェルを通して生体サンプルの光学的性質の測定を実施することができる。ウェルは、栄養培地を収容し、酵素基質または抗生物質など、生体サンプル中に存在する生物剤と相互作用することが意図される、１つもしくは複数の試薬も収容する。一般に、各種菌を受け入れる複数のウェルが設けられ、ウェルはそれぞれ、１つもしくは複数の異なる試薬、および異なる濃度の同じ試薬を収容する。種菌中に存在する生物剤の性質に応じて、上記生物剤は、特定の試薬と反応するが他の試薬とは反応しないか、または特定の濃度で反応するが他の濃度では反応しない。例えば、抗生物質の感受性を試験するアンチバイオグラムの文脈では、試薬は、様々な濃度の様々な抗生物質で構成され、生物剤は、生物剤が感受性を持たないかまたは抗生物質の濃度が不十分な抗生物質を収容したウェル内で増殖するか、あるいは反対に、上記生物剤の発育は、十分な濃度で生物剤が感受性を持つ抗生物質を収容したウェル内である程度妨げられる。
したがって、生物剤と試薬との間の相互作用における上述の差は、ウェル内におけるバイオマスの異なる変化をもたらす。生物剤自体、生物剤が懸濁している溶液とは異なる光学的性質を有するので、バイオマス、言い換えれば各ウェル内に存在する生体物質の量は、各ウェル内に存在する生体サンプルの光学的性質に直接影響する。
特に、生体サンプルの透過率は生物剤の濃度の変化によって影響を受ける。この理由により、一般的にはマックファーランド（ＭｃＦ）で表される濁り度の測定値を決定するために、生体サンプルが充填されたウェルの総透過率（または等価である吸光度）の潜伏段階中における時間に伴う変化の決定に基づいて、生体サンプルを分析する方法が開発されてきた。この濁り度の測定は、生体サンプル中の生物剤のバイオマスを直接表す。このため、発光ダイオードが、強度が分かっている光線でサンプルを照明し、サンプルに対して発光ダイオードの反対側に位置する単離されたフォトダイオードによって、光線が生体サンプルを通過した後に受光した光強度を決定することが可能になる。しかしながら、かかる透過率の測定は感受性が非常に低いので、０．０５ＭｃＦ未満またはさらには０．１ＭｃＦ未満の濁り度を測定することができない。
種菌は、懸濁液状の生物剤を生理食塩水に導入するオペレータによって、または１０７から１０９ＵＦＣ／ｍｌの間のバクテリア濃度を得るように生体サンプル（例えば、陽性の尿または血液培養物）を希釈することによって準備される。生理食塩水懸濁液中での希釈は、分析を可能にするために、最初は特定の範囲に対応していなければならない。このコンプライアンス範囲は、後で再希釈される事前値を任意に有して、オペレータが種菌を準備することを意図した濁り度値として直接表すことができる。例として、いくつかのプロトコルに関して、事前懸濁液は、生物剤としてのバクテリアの場合は０．５から０．６３ＭｃＦの間、または生物剤としての酵母の場合は１．８から２．２ＭｃＦの間で校正しなければならない。透過率測定デバイスは、一般的に、事前懸濁液の濁り度が求められるコンプライアンス範囲内であることをチェックするのに使用される。この事前懸濁液はその後さらに、例えば、グラム陰性菌を分析する場合は２０倍に、またはグラム陽性菌を分析する場合は１０倍に希釈される。したがって、この例では、バクテリアの場合の種菌の初期コンプライアンスは、グラム陰性菌では０．０２５ＭｃＦから０．０３１５ＭｃＦの間、グラム陽性菌では０．０５ＭｃＦから０．０６３ＭｃＦの間のバイオマス濃度（濁り度として表される）を要する。より低い濃度は一般に、他のプロトコルで使用される。これによって、種菌における生物剤の濃度が、最初は透過率測定機器の検出限界よりも低くなる。
しかしながら、操作がオペレータによって実施されるため、エラーのリスクがあり、または少なくとも最初に種菌が予期される品質を有さなくなり、したがって、分析方法の要件に適応しなくなる。加えて、分析機器の部品が、例えば種菌をウェルに搬送するのに関与する機械的部品が誤動作する可能性が常にある。最初の種菌の品質と予期される品質との間のこの不適切姓は、直ぐに気づくものではない。実際には、利用可能な測定は総透過率のみであり、その感度が低いため、最初に測定背景ノイズから目立たせることは不可能である。濃度を増加させ、透過率を測定背景ノイズから目立たせるためには、例えば複数の細菌分裂サイクルに対応する、特定の培養時間、一般的に数時間が必要である。
種菌が適応しない場合、次の２つの主な事例がある。
生物剤の最初の濃度が低すぎて、（例えば、他の試薬を含まず栄養培地のみを収容した対照ウェル内で）数時間培養した後でも生物剤バイオマスの成長が検出されない場合。分析機器はエラーを報告し、オペレータは新しい種菌を準備し直さなければならない。
または、生物剤の最初の濃度が適応していない（低すぎるかまたは高すぎる）が、数時間培養した後で生物剤バイオマスの成長を検出するには十分に高濃度である場合。分析機器によってエラーは報告されないが、分析結果（例えば、抗生物質耐性試験の場合、「ＭＩＣ」として知られる最小発育阻止濃度）は誤ったものになる。
第１の事例では、エラー検出が遅いという性質によって引き起こされる時間の損失は、特に患者を治療するために分析結果が待たれている場合、非常に不利であり得る。第２の事例では、誤った結果は誤診につながる可能性があり、したがって患者にとって不適切な治療につながる可能性がある。
したがって、本発明は、時間の損失なしに最終分析結果の信頼性を確保する、分析方法および機器を提供することを目的とする。
この目的のため、本発明は、分析機器を用いて生体サンプルを分析する方法を提供し、方法は、生体サンプルが、ホログラフィック画像装置の視野内で、生体サンプル中に存在する生物剤と相互作用することが意図される少なくとも１つの試薬を含む、分析レセプタクル内に配置された後、測定期間中の複数の測定時間について繰り返す形で実施される、
生体サンプルの画像を獲得することと、
獲得した画像から、生体サンプル分析基準を決定することと、を含むステップと、
測定期間の終わりに生体サンプル分析基準から分析結果を得ることと、を含み、
方法は、測定期間の第１の半期および第２の半期内の、測定期間中の複数の測定時間について、
ホログラフィック画像装置によって生体サンプルのホログラフィック画像を獲得することと、
獲得したホログラフィック画像から、視野内の生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値を決定することであって、ホログラフィック画像の複数の区域それぞれについて、上記区域内に生物剤が存在するか否かを決定することを含み、分析結果が得られる元となる生体サンプル分析基準が、生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値である、分布パラメータの値を決定することを含み、
方法はまた、測定期間の第１の半期内の少なくとも１つの測定時間について、分布パラメータの値を、コンプライアンス範囲の限界を規定する少なくとも１つの閾値と比較することを含む、生体サンプルの初期コンプライアンスチェックを行うことを含み、分布パラメータの値がコンプライアンス範囲外である場合、測定機器は生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する。
本発明は、有利には、単独で、または様々な可能な組み合わせに従って取り入れられる、以下の様々な特徴によって完成される。
上記閾値は、コンプライアンス範囲の下限に対応する下限閾値であり、分布パラメータの値が下限閾値よりも低い場合、測定機器は生体サンプル非コンプライアンス警告を発行し、および／または上記閾値は、コンプライアンス範囲の上限に対応する上限閾値であり、分布パラメータの値が上限閾値よりも高い場合、測定機器は生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する。
生体サンプル初期コンプライアンスチェックが、測定期間の第１の１／４期内の少なくとも１つの測定時間について実施される。
生体サンプル初期コンプライアンスチェックが、測定期間の最初の１時間以内または測定期間の最初の３０分以内の少なくとも１つの測定時間について実施される。
分布パラメータは、ホログラフィック画像に現れる生物剤の数から導き出される。
ホログラフィック画像の区域は、生体サンプルの生物剤の一般的なサイズの５から２０倍の間の大きさである。
区域内に生物剤が存在するか否かは、区域のグレーレベルの値を閾値と比較することによって、または区域のパターンをデータベースの参照パターンと比較することによって決定される。
ホログラフィック画像は、ホログラム、またはホログラムから再構築された画像である。
分析レセプタクルは、少なくとも２つの向かい合った透明面を有し、ホログラフィック画像は、分析レセプタクルの２つの向かい合った透明面の間で少なくとも１００μｍの被写界深度にわたって視野が延在するように構成される。
本発明はまた、ホログラフィック画像を獲得するように構成された視野を有するホログラフィック画像装置と、データ処理手段と、を備える分析機器に関し、分析機器は、ホログラフィック画像装置の視野内で、生体サンプル中に存在する生物剤と相互作用することが意図される少なくとも１つの試薬を含む、分析レセプタクルに生体サンプルを受け入れるとともに、本発明のステップに従って、測定期間の第１の半期および第２の半期内の測定期間中の複数の測定時間について、
生体サンプルのホログラフィック画像を獲得することと、
獲得したホログラフィック画像から、視野内における生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値を決定することであって、分布パラメータの値の決定が、ホログラムの複数の区域それぞれについて、区域内に生物剤が存在するか否かを決定することを含み、測定期間の終わりに分析結果が得られる元となる生体サンプル分析基準が、生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値である、分布パラメータの値を決定することと、を実施するように構成され、
測定期間の第１の半期内の少なくとも１つの測定時間について、生体サンプル初期コンプライアンスチェックは、分布パラメータの値を少なくとも１つの下限閾値と比較することを含み、分布パラメータの値が下限閾値よりも低い場合、測定機器は生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、単なる例示であって非限定的であり、添付図面に関連して読まれるべきである、以下の説明から明白となるであろう。
本発明の１つの可能な実施形態による、分析されるべき生体サンプルを配置するのにカードを使用することができる、ウェルの形態の複数のレセプタクルを備える分析カードの一例を示す図である。 本発明の１つの可能な実施形態による、分析機器に使用することができるホログラフィック画像装置の一例を示す概略図である。 本発明の１つの可能な実施形態による、分析方法のステップを示す図である。
生体サンプルを分析する方法は、視野を有するホログラフィック画像装置を備える分析機器を用いて実施され、分析機器は、ホログラフィック画像装置の視野内で分析レセプタクルに生体サンプルを受け入れるように構成される。生体分析は、この場合、インビトロ分析である。
図１は、分析されるべき生体サンプルを配置するのに使用することができる、ウェルの形態の複数の分析レセプタクル２を備える分析カード１の一例を示している。分析レセプタクル２は、この場合、１つの面上に二次元ネットワークの形で組織化され、各レセプタクル２は、一般的には分析レセプタクル２内に存在する異なる試薬によって、異なる分析条件と関連付けられる。例えば、抗生物質に対する感受性を試験するアンチバイオグラムの文脈では、試薬は、様々な濃度の様々な抗生物質で構成される。分析カード１を使用することは要件ではないが、かかる分析カードによって、標準化された形で１つの同じ分析期間中に複数の試験を実施することが可能になる。
各分析レセプタクル２は、少なくとも１つの可視または非可視光波長に対して少なくとも部分的に透明であり、好ましくは、可視スペクトルに対して少なくとも部分的に透明である。この透過性によって、ホログラフィック画像装置などの光学手段によって、内部に収容された生体サンプルを分析することが可能になる。好ましくは、図１で分かるように、分析レセプタクル２は、光が伝播する透明軸を表すように、少なくとも２つの向かい合った透明面を有する。これら２つの向かい合った透明面は、例えば、５ｍｍ未満分離される。
分析レセプタクル２の充填を可能にするために、かかる分析カード１は、例えば、チューブ４内に準備された種菌の体積３に浸漬させるように意図されたパイプ５を備えることができる。上述したように、種菌は、生物剤を導入するオペレータによって準備され、例えば、ロッドまたはスワブを用いてペトリ皿の培養物からサンプリングし、例えば、生物剤としてのバクテリアの場合は０．５から０．６３ＭｃＦの間、あるいは生物剤としての酵母の場合は１．８から２．２ＭｃＦの間である、実施される分析のタイプおよび測定機器に応じた所与の範囲の濁り度に対応する希釈度で、生理食塩水中に懸濁される。この事前懸濁液はその後さらに、例えば、グラム陰性菌を分析する場合は２０倍もしくはさらには１００倍に、またはグラム陽性菌を分析する場合は１０倍もしくはさらには１００倍に希釈される。後に行われるこの希釈は、特に自動化することができ、したがって、チューブ４を分析機器内に配置した後で、測定機器によって実施することができる。当然ながら、使用されるプロトコルに応じて、他の所定の濁り度範囲を使用することができる。所望の希釈度は、１回で、または上記例のように複数回で得ることができる。
次に、パイプ５の一端が、チューブ４の準備によって得られた種菌の体積３に浸漬され、全体が分析機器に導入される。当然ながら、これらの準備ステップのすべてまたは一部を自動化することができる。種菌は、パイプ５を通り、次に分析カード１内に作られた流体循環回路を用いて分析レセプタクル５間に分配される。パイプ５および分析カード１内におけるこの種菌の移動は、毛管現象によって、および／またはチューブ４の開放端に存在する空気の減圧によってもたらすことができる。例えば、減圧によって、大気圧である分析カード１内に存在する空気は、導管５を介して種菌３を通って分析カード１から出て、種菌３の通り道を空け、したがって種菌３が導管５を上って分析カード１に入る。反対に、種菌３が導管５を上るようにするために、チューブ４の開放端を用いて種菌に空気圧を働かせることが可能である。それにより、種菌から成る生体サンプルが、分析レセプタクル２内に置かれる。
分析機器は、視野のホログラフィック画像を獲得するように構成された、この視野を有するホログラフィック画像装置を備える。ホログラフィック画像を獲得することによって相当な被写界深度が可能になり、したがって生物剤を検出する非常に良好な感受性が可能になる。ホログラフィック画像を獲得する間、ホログラフィック画像装置は分析レセプタクル２に対向して配置される。非現定例として、図２は、上記ホログラフィック画像装置１０の視野１１が、分析レセプタクル２に収容された生体サンプルの体積内に含まれるように配置された、オンラインホログラフィック画像装置１０を概略的に表している。分析カード１、またしたがって分析カード１が備える分析レセプタクル２は、ホログラフィック画像装置１０の物体平面に位置する。ホログラフィック画像装置１０はイメージング軸１６を規定し、イメージング軸１６は、本明細書では光軸に対応する直線によって単純化されるが、ホログラフィック画像装置１０の光学構成部品の構成に応じて、光路を規定する一連の連続する直線から成ることができる。
分析レセプタクル２の一方の側、この場合は光軸１６上の一方の側には、十分にコヒーレントな光の照明ビームを用いて、ホログラフィック画像装置１０の視野内の分析レセプタクル２を照明するように構成された、光源１４がある。光源１４は、照明光を生成することができ、または単に、任意にダイヤフラムまたは絞りを備えた、この照明光を伝達する光ファイバーの端部であることができる。照明ビームは、特定の追加の制約を何ら有さず、ホログラフィックイメージングに対する従来の特性を有する。したがって、照明ビームは、単色光（例えば、約６４０～６７０ｎｍの波長を有する）であることができ、または場合によっては、例えば順次使用される、複数の波長で構成することができる。
分析レセプタクル２の他方の側、この場合は光軸１６上の他方の側には、例えばＣＭＯＳまたはＣＣＤセンサなどのデジタルセンサである、イメージセンサ１２がある。イメージセンサ１２は、ホログラフィック画像装置１０の画像面上に位置し、ホログラムを、すなわち視野１１内に位置する種菌と照明ビームとの間の相互作用によって引き起こされる干渉の強度の空間分布を獲得するように構成される。
ホログラフィック画像装置１０は、この場合、例えば図示される例では、顕微鏡対物レンズ１８ａおよび結像レンズ１８ｂなど、分析レセプタクル２とデジタルイメージセンサ１２との間に配置された、一連の光学部材１８を備える。しかしながら、顕微鏡対物レンズ１８ａなどの光学部材は任意であり、本発明は、レンズを有するホログラフィック顕微鏡に限定されない。本明細書に記載する構成は、当然ながら非現定例である。様々な光学部材を有する（顕微鏡対物レンズを有するまたは有さないなど）、任意のホログラフィック画像装置１０を使用することができる。したがって、ホログラフィック画像装置１０が、生体サンプルによって発生する干渉パターンが現れる画像を獲得することができる限り、この画像装置は、本方法を実施するのに適している。しかしながら、好ましくは、ホログラフィック画像装置１０は、視野１１が、光軸１６に沿って分析レセプタクル２内で少なくとも１００μｍの被写界深度にわたって延在するように、好ましくは少なくとも１５０μｍにわたって、より好ましくは少なくとも２５０μｍにわたって延在するように構成される。一般的に、分析レセプタクル２は、光軸１６に沿って組織化された２つの向かい合った透明面を備え、被写界深度は、分析レセプタクルの２つの向かい合った透明面の間で少なくとも１００μｍにわたって延在し、好ましくは少なくとも１５０μｍにわたって、より好ましくは少なくとも２５０μｍにわたって延在する。視野１１は、ホログラムイメージングの上記視野１１から、生物剤が存在すると決定することができる空間であるものと理解される。
測定機器はまた、プロセッサ、メモリ、通信バスなど、データの処理を可能にする構成要素を備える。これらの他の構成要素が、実施する方法および包含する命令のみに基づくものである限り、以下では詳述しない。
図３は、上記に詳述した、ホログラフィック画像装置１０の視野１１内で分析レセプタクル２内に生体サンプルを事前に配置したこと（ステップＳ０１）に続く、分析方法のステップを示す図である。方法は、測定期間中の複数の測定時間について繰り返す形で実施されるステップから成る、次の複数のサイクル（ステップＳ０２）を含む。
生体サンプルの画像を獲得するステップ、
獲得した画像から生体サンプル分析基準を決定するステップ。
これらのサイクルは、一般的に、分析機器の速度、並行して処理される生体サンプルの数に応じて、また例えば、分析カード１内の分析レセプタクル２の数に応じて、１分から３０分の範囲の期間に従って繰り返される。測定期間は、数時間、一般的には１０時間超過に及ぶため、測定回数は数十回、またはさらには数百回になる。生体サンプル分析基準は、獲得した画像に対する測定から導き出される任意の基準であることができ、それによって、例えば、従来技術のように透過率によって濁り度測定値をモニタリングするなど、生体サンプルの分析を実施することが可能になる。
しかしながら、方法は、測定期間の第１の半期内の少なくとも１つの測定時間について、
ホログラフィック画像装置１０によって生体サンプルのホログラフィック画像を獲得すること（ステップＳ０２ａ）と、
獲得したホログラフィック画像から、視野１１内の生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値を決定すること（ステップＳ０２ｂ）と、を含む。
測定期間中の各測定時間に獲得した画像は、生体サンプルのホログラフィック画像であることが可能であり、獲得した画像それぞれに対して、生体サンプル分析基準は、ホログラフィック画像装置１０の視野１１内における生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値であることが可能である。この場合、分析結果（ステップＳ０６）は、各測定時間に対して決定された分布パラメータ値から得ることができる。
また、生体サンプルのホログラフィック画像を獲得すること、および分布パラメータを決定することが、測定期間の始めの測定時間（第１の半期内）にのみ実施され、その後に含まれる測定時間（測定期間の第２の半期内）には実施されないことが可能である。この場合、分布パラメータの値は、初期コンプライアンスチェックにのみ使用され、分析結果を得るのには使用されず、したがって分析結果は、別の生体サンプル分析基準によって得られる。これに関して、初期コンプライアンス制御が実施されない測定時間について、ホログラフィック画像装置以外を使用して画像を獲得して、この他の分析基準を決定するのを可能にすること、もしくはホログラフィック画像装置を使用してホログラフィック画像以外の画像を獲得すること、または分布値を決定せずにホログラフィック画像を獲得し、獲得したホログラフィック画像から他の分析基準を決定することが可能である。
ホログラフィック画像の獲得中、ホログラフィック画像装置１０はホログラムを獲得し、それによって深い被写界深度を、またしたがって生体サンプル中の生物剤の検出に高い感受性を提供するという利点を有する。ホログラムの獲得中、光源１４は、イメージング軸１６に沿った方向Ｚで伝播する参照平面波をもたらすことができる、参照照明ビームを放射する。分析レセプタクル２内部の視野１１内に存在する生物剤は、生物剤の回折特性によって、入射参照光を散乱させる。生物剤によって散乱する波および参照波は、イメージセンサ１２上で干渉して、ホログラムを形成する。デジタルイメージセンサ１２は電磁界の強度にのみ感受性を有するので、ホログラムは、散乱波および参照波の追加に対応する視野全体の空間強度分布に対応する。活用されるホログラフィック画像は、ホログラムであることができ、または例えば、レイリー・ゾンマーフェルトの回折原理に基づいた伝播アルゴリズムを使用して、ホログラムから逆伝播計算によって再構築された画像であることができる。再構築せずにホログラムを使用することによって、各生物剤が、上記生物剤の存在によって生じる干渉図に対応するリングに取り囲まれてホログラムに現れるので、高い検出感度による利益を得ることが可能になり、したがってこれらの生物剤の存在を検出することが容易になる。加えて、再構築しないことによって、計算リソースおよび時間が削減される。しかしながら、再構築された画像を使用することには、再構築された画像に現れる生物剤を、場合によっては三次元で、正確に局在化することが可能になるなど、他の利点がある。
獲得したホログラフィック画像は、ホログラフィック画像内で空間的に分配される、視野１１内の生物剤の表現を含む。したがって、ホログラフィック画像によって、視野１１内における生物剤の定量的分布を保存することが可能になる。そのため、視野１１内で複数の位置に複数の生物剤が存在する場合、これら生物剤の複数の表現がホログラフィック画像の複数の場所に存在することになる。したがって、視野１１内における生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータを決定することが可能である。そのため、分布パラメータは、サンプルの特性に影響を及ぼす全体作用から推定されるサンプルのバイオマス全体を、透過率などのように分析基準として考慮するだけではなく、サンプル１中の生物剤の空間分布を考慮し、したがって、ホログラフィック画像の二次元情報によって生物剤の濃度を考慮する。このように、分布パラメータは、サンプル中の定量的空間分布を反映する、ホログラフィック画像におけるこの定量的空間分布を考慮に入れることに基づいて構築される。
この分布パラメータは、例えば、視野１１内にあり、ホログラフィック画像に現れる生物剤の数であり、または例えば、生物剤が占めるホログラフィック画像の面積の比率である。例えば、ホログラフィック画像における生物剤の数を計数することが可能である。ホログラフィック画像がホログラムである場合、干渉パターンは一般的に、生物剤の周囲にリングの形態で現れる。リングは、形状認識アルゴリズムを用いて同定するのが特に簡単な形状であり、したがって、同じ数の生物剤に対応する、画像に現れるすべてのリングを同定するために、ホログラフィック画像を分析することが可能である。
分布パラメータのこの決定を単純にするために、方法は、ホログラフィック画像の複数の区域、一般的に数千の区域それぞれに対して、上記区域に生物剤が存在するか否かを決定することを含むことができる。区域のサイズは、生物剤を単離することは可能であるが、上記生物剤の表現を必ずしも切り取らなくてもよい、十分に小さいサイズであるように選ばれる。例えば、区域は、探される生物剤の一般的サイズの５から２０倍の間の大きさであることができる。それにより、分布パラメータは、例えば、生物剤が存在する区域の数を含むことができ、またはより簡単に、生物剤が存在しない区域の数に対応することができ、この方が実証が簡単である。
ホログラフィック画像の区域内に生物剤が存在するか否かの決定は、例えば、区域内のグレー（または光強度）の平均レベルをグレーの閾値レベルと比較することによって決定することができる。また、区域のパターンの生物剤の複数の見た目に対応する参照パターンのデータベースとの比較を実施し、区域のパターンとの類似性が最も高い参照パターンを同定することが可能である。この参照パターンと関連付けられた特徴は、パターンの区域の特徴とみなされ、それによって、区域内における生物剤の存在を検出するのに加えて、情報がデータベースに提供される見た目の特徴に応じて、生物剤の個別の成長などのさらなる特徴を推論することが可能になる。
ホログラフィック画像を獲得し、分布パラメータを決定するサイクル（ステップＳ０２）は、測定期間中の複数の測定時間のうちの少なくとも１つの測定時間について、各分析レセプタクル２に対して繰り返される。上述したように、ホログラフィック画像を獲得し、分布パラメータの値を決定するサイクル（ステップＳ０２）を、すべての測定時間について繰り返すことが可能である。次に、このように決定された分布パラメータを使用して、分析結果を生成することができる。これらの結果は、例えば、分布パラメータの変化の時間的モニタリングであるか、またはそこから導き出される同定の指示であることができる。測定期間、即ち培養期間は、一般的に数時間に及び、生物剤と試薬との間の相互作用の差を明らかにするために、分析レセプタクル２内のバイオマスの異なる変化を実証するのに必要であるとみなされる、モニタリング時間に対応する。しかしながら、この測定期間の始めにおいて、より正確には、測定期間の第１の半期以内、好ましくは測定期間の第１の１／４期以内、または測定期間の最初の１時間以内、好ましくは測定期間の最初の３０分以内、より好ましくは測定期間の最初の１５分以内の、少なくとも１つの測定時間について、方法は、生体サンプルが予期される品質を最初に有すること、またしたがって分析方法の要件に適応することをチェックするために、少なくとも１つの分布パラメータに基づいて、生体サンプルに対する初期コンプライアンスチェック（ステップＳ０３）を実施することを含む。生体サンプルに対するこの初期コンプライアンスチェックは、測定期間の始めに１回だけ実施することができ、または測定期間の始め、すなわち測定期間の第１の半期、好ましくは測定期間の第１の１／４期、もしくは測定期間の最初の１時間、好ましくは最初の３０分、より好ましくは最初の１５分に、複数の測定時間について実施することができる。
初期コンプライアンスチェックは、測定期間の始めに決定される分布パラメータの値に基づくので、非コンプライアンスがあればできるだけ早く検出することができる。初期コンプライアンスチェックは、分布パラメータの値を、コンプライアンス範囲の限界を規定する少なくとも１つの閾値と比較することを含み、分布パラメータの値がコンプライアンス範囲外である場合、測定機器は、生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する（Ｓ０５）。
閾値は下限閾値であることができ、分布パラメータの値が下限閾値よりも低い場合（ステップＳ０４）、測定機器は、生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する（ステップＳ０５）。別の方法として、または好ましくはそれに加えて、閾値は、下限閾値よりも高い上限閾値であることができ、初期コンプライアンスチェック中に分布パラメータの値がこの上限閾値と比較され、分布パラメータの値が上限閾値よりも高い場合、測定機器は、生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する。下限閾値は分布パラメータコンプライアンス範囲の下限に対応し、上限閾値は分布パラメータコンプライアンス範囲の上限に対応する。
このコンプライアンス範囲は、分析を実施することができるように、特に分析結果をエラーなしに解釈することを可能にするように、分布パラメータの初期値がその中になくてはならない範囲に対応する。したがって、コンプライアンス範囲は、実施される分析のタイプおよび測定機器の設定に応じて決まる。例えば、グラム陽性菌のアンチバイオグラムの場合、コンプライアンス範囲は、０．０５から０．０６３ＭｃＦの間の濁り度値に対応することができ、グラム陰性菌のアンチバイオグラムの場合は、０．０２５から０．０３２ＭｃＦの間、または推奨される希釈値に応じてさらに低い濁り度値に対応することができる。分布パラメータの初期値がコンプライアンス範囲内にない（加減閾値未満または上限閾値超過である）限り、生体サンプルは、予期される品質を最初に有しておらず、したがって不適応である。コンプライアンス範囲は半開放であってもよく、例えば、上限なしに下限から広がってもよく、またはその逆であってもよい。
生体サンプル非コンプライアンス警告は複数の形態を取ることができる。一般的に、分析機器は電気音響変換器を備え、非コンプライアンス警告を発行することは、非コンプライアンスをオペレータに知らせるために、オペレータに向けて音声を発行することを含む。同様に、非コンプライアンス警告を発行することは、オペレータに向けて光信号を発行することを含むことができる。分析機器は、一般的に、表示画面を有するヒューマンマシンインターフェースを備え、非コンプライアンス警告を発行することは、好ましくは分布パラメータの値を示すのと同時に、種菌の非コンプライアンスをオペレータに知らせるメッセージを画面上に表示することを含むことができる。他のタイプの警告を想到することができ、重要な態様は、分析機器のオペレータに、サンプルが最初は不適応であることを知らせることで、サンプルのこの非コンプライアンスをできるだけ早く修正できることである。
生体サンプルが最初に適応している場合、すなわち分布パラメータの初期値がコンプライアンス範囲内にある場合、すなわち一般的に、下限閾値よりも高く上限閾値よりも低い場合、生体サンプルを分析することができ、分析結果が分布パラメータの値から得られるかまたは別の分析基準から得られるかにかかわらず、測定期間の終わりに有効な分析結果が得られる（ステップＳ０６）。したがって、最終分析結果の有効性は、初期サンプルのコンプライアンスに応じて決まる。さらに、生体サンプルが適応していない場合、非コンプライアンス警告を発行することが、分析機器による分析の残りを含むことが可能である。第一に、これは、生体サンプルの初期の非コンプライアンスが、測定期間の始めから、最終分析結果が信頼性の低いものになることを示している場合、分析を継続する意味がないためであり、第二に、これは、最終分析結果が信頼性の低いものであることから、解釈された場合に危険であり得る最終分析結果の決定を防ぐためである。
本発明は、記載され添付図面に示される実施形態に限定されない。特に様々な技術的特徴の構成の観点から、または等価の技術の置換えによって、ただし本発明の保護の分野から逸脱することなく、変更が依然として可能である。

Claims (10)

  1. 分析機器を用いて生体サンプルを分析する方法であって、前記生体サンプルが、ホログラフィック画像装置の視野（１１）内で、前記生体サンプル中に存在する生物剤と相互作用することが意図される少なくとも１つの試薬を含む、分析レセプタクル（２）内に配置された後（Ｓ０１）、測定期間中の複数の測定時間について繰り返す形で実施される、
    前記生体サンプルの画像を獲得することと、
    獲得した前記画像から、生体サンプル分析基準を決定することと、を含むステップ（Ｓ０２）と、
    前記測定期間の終わりに前記生体サンプル分析基準から分析結果を得ること（Ｓ０６）と、を含む方法において、
    前記方法が、前記測定期間の第１の半期および第２の半期内の、前記測定期間中の複数の測定時間について、
    前記ホログラフィック画像装置によって前記生体サンプルのホログラフィック画像を獲得すること（Ｓ０２ａ）と、
    獲得した前記ホログラフィック画像から、前記視野内の生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値を決定すること（Ｓ０２ｂ）であって、前記ホログラフィック画像の複数の区域それぞれについて、前記区域内に生物剤が存在するか否かを決定することを含み、前記分析結果が得られる元となる前記生体サンプル分析基準が、生物剤の前記定量的空間分布を表す前記分布パラメータの値である、分布パラメータの値を決定すること（Ｓ０２ｂ）とを含み、
    前記方法がまた、前記測定期間の第１の半期内の少なくとも１つの測定時間について、前記分布パラメータの前記値を、コンプライアンス範囲の限界を規定する少なくとも１つの閾値と比較することを含む、前記生体サンプルの初期コンプライアンスチェックを行うこと（Ｓ０３）を含み、前記分布パラメータの前記値が前記コンプライアンス範囲外である場合、前記測定機器が生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する（Ｓ０５）、分析方法。
  2. 前記閾値が、前記コンプライアンス範囲の下限に対応する下限閾値であり、前記分布パラメータの前記値が前記下限閾値よりも低い場合、前記測定機器が、生体サンプル非コンプライアンス警告を発行し（Ｓ０５）、および／または前記閾値が、前記コンプライアンス範囲の上限に対応する上限閾値であり、前記分布パラメータの前記値が前記上限閾値よりも高い場合、前記測定機器が、生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する、請求項１に記載の分析方法。
  3. 前記生体サンプルの初期コンプライアンスチェックが、前記測定期間の第１の１／４期内の少なくとも１つの測定時間について実施される、請求項１または２に記載の分析方法。
  4. 前記生体サンプルの初期コンプライアンスチェックが、前記測定期間の最初の１時間以内または前記測定期間の最初の３０分以内の少なくとも１つの測定時間について実施される、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析方法。
  5. 前記分布パラメータが、前記ホログラフィック画像に現れる生物剤の数から導き出される、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
  6. 前記ホログラフィック画像の区域が、前記生体サンプルの前記生物剤の一般的なサイズの５から２０倍の間の大きさである、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
  7. 区域内に生物剤が存在するか否かが、前記区域のグレーレベルの値を閾値と比較することによって、または前記区域のパターンをデータベースの参照パターンと比較することによって決定される、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
  8. 前記ホログラフィック画像が、ホログラム、またはホログラムから再構築された画像である、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
  9. 前記分析レセプタクル（２）が、少なくとも２つの向かい合った透明面を有し、前記ホログラフィック画像装置（１０）が、前記分析レセプタクル（２）の前記２つの向かい合った透明面の間で少なくとも１００μｍの被写界深度にわたって前記視野が延在するように構成された、請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法。
  10. ホログラフィック画像を獲得するように構成された視野（１１）を有するホログラフィック画像装置（１０）と、データ処理手段と、を備える分析機器であって、ホログラフィック画像装置（１０）の前記視野（１１）内で、生体サンプル中に存在する生物剤と相互作用することが意図される少なくとも１つの試薬を含む、分析レセプタクル（２）に前記生体サンプルを受け入れるとともに、請求項１から９に従って、前記測定期間の第１の半期および第２の半期内の前記測定期間中の複数の測定時間について、
    前記生体サンプルのホログラフィック画像を獲得すること（Ｓ０２ａ）と、
    獲得した前記ホログラフィック画像から、前記視野内における生物剤の定量的空間分布を表す分布パラメータの値を決定すること（Ｓ０２ｂ）であって、前記分布パラメータの前記値の前記決定が、前記ホログラムの複数の区域それぞれについて、前記区域内に生物剤が存在するか否かを決定することを含み、前記測定期間の終わりに前記分析結果が得られる元となる生体サンプル分析基準が、生物剤の前記定量的空間分布を表す前記分布パラメータの値である、分布パラメータの値を決定すること（Ｓ０２ｂ）と、を実施するように構成され、
    測定期間の第１の半期内の少なくとも１つの測定時間について、生体サンプル初期コンプライアンスチェック（Ｓ０３）が、前記分布パラメータの前記値を、コンプライアンス範囲の限界を規定する少なくとも１つの閾値と比較することを含み、前記分布パラメータの前記値が前記コンプライアンス範囲外である場合、前記測定機器が生体サンプル非コンプライアンス警告を発行する（Ｓ０５）、分析機器。
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