CN115232785A - 用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物、方法和骨修复用途 - Google Patents

用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物、方法和骨修复用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物、方法和骨修复用途。在具体实施方案中，通过HtrA3蛋白处理胶原蛋白得到的处理物解决了针对传统骨再生相关细胞因子的局限性，能够特异性促进骨缺损早期骨髓间充质干细胞分化，从而有效促进骨再生或骨修复。

Description

用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物、方法和骨修复 用途
技术领域
本发明涉及高效成骨领域，具体地涉及用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物和方法以及在骨再生材料中的用途。
背景技术
随着预期寿命的延长和世界人口的老龄化，骨折、骨质疏松症和骨转移等疾病迅速增加，与骨骼相关的医疗和成本都在上升，因此骨再生的相关研究具有重大意义。骨缺损修复是一个多因素调控的复杂过程，首先需要间充质干细胞迁移至目标位置才能启动新骨的合成，故在某种程度上其迁移效率决定了骨愈合的速度和质量。参与骨修复的间充质干细胞主要来源于骨髓与骨膜内层。在静息状态下，它们稳定居住在血管壁周围或其他位置的干细胞微环境中。当损伤出现时，间充质干细胞迁移至缺损修复区进行成骨分化，并进行骨再生。
目前，一些经典的促进骨再生的细胞因子，如BMP、VEGF、FGF、PTH等已经用于促进骨缺损的愈合。但是这些传统的细胞因子因其非特异性作用于多种细胞和器官，常伴有很多副作用，比如异位骨形成、血管瘤等，并且有些因子应用时在剂量的控制上必须十分准确。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
高温需要A蛋白3(HtrA3)是一种新发现的妊娠相关性蛋白，被证实参与了胚胎着床、胚胎发育、肿瘤侵袭等生理、病理过程。本发明研究发现HtrA3 蛋白能够促使人骨髓间充质干细胞成骨向分化，从而起到促进骨缺损修复的作用。至少部分地基于上述发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其包含胶原蛋白处理物或能够产生所述胶原蛋白处理物的前体。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，所述前体包括HtrA3蛋白或IV型胶原；或者包括独立或混合状态存在的HtrA3蛋白和IV型胶原。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，所述前体为凝胶态或固态。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，所述胶原蛋白处理物通过使胶原蛋白原料与HtrA3蛋白在适于间充质干细胞培养的条件下接触反应而得到。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，其包括包被于至少培养基材的培养表面的胶原蛋白以及溶解于培养基中的HtrA3蛋白；当所述培养基为直接用于培养间充质干细胞的工作培养基时，HtrA3蛋白在所述培养基中的浓度为0.05-2 ng/ml。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，所述成骨向分化包括下述(1)-(5)情形中的至少一种：
(1) 成骨相关基因的转录水平或对应mRNA的表达水平提高；
(2) 成骨相关蛋白的量或活性提高；
(3) 碱性磷酸酶活性提高；
(4) 钙结节或矿化结节的量增加；
(5) 骨体积和/或骨密度增加。
本发明的第二方面，提供一种用于促进间充质干细胞体外成骨向分化的方法，其包括使第一方面所述的组合物或其中至少部分成分与间充质干细胞接触的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于促进间充质干细胞体外成骨向分化的方法，其包括以下步骤：
(1) 向至少培养表面包被有胶原蛋白的培养基材加入骨髓间充质干细胞和第一培养基，在适用培养的条件下保持5小时至5天；
(2) 之后更换第二培养基继续培养甚至得到分化细胞；
其中，所述第一培养基包含0.05-2 ng/ml HtrA3蛋白，所述第二培养基不包含HtrA3蛋白。
本发明的第三方面，提供一种骨髓间充质干细胞，其通过第二方面所述的方法制备得到。
本发明的第四方面，提供根据第一方面所述的组合物在制备骨再生材料中的用途。
本发明解决了针对传统骨再生相关细胞因子的局限性，提供一种新型特异性促进骨缺损早期骨髓间充质干细胞分化，从而有效促进骨再生的方法。实验证明体内应用100ng/ml的HtrA3溶液三天可明显促进大鼠颅骨缺损区域的骨再生或骨修复。本发明的方法新颖、快速，便捷。
附图说明
图1 前3天在培养基中加入重组HtrA3蛋白溶液在7天时成骨相关基因的表达情况。通过Ct值计算成骨基因的表达量，统计对照组与实验组ALP、RUNX2、OPN和OPG的柱状图。
图2 前3天在培养基中加入重组HtrA3蛋白溶液在7天时成骨相关基因表达得到的蛋白情况。蛋白免疫印迹结果显示，实验组中RUNX2、BMP2和SP7的蛋白表达水平明显大于空白对照组。
图3 ALP和ARS染色显示成骨前3天加入重组HtrA3蛋白可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。图3的A图为两组ALP染色的代表图；图3的B图示出了通过检测每克蛋白中所产生的碱性磷酸酶活性来对ALP活性的进行定量，统计分析显示rhHtrA3组ALP活性增加；图3的C图为两组ARS染色的代表图，rhHtrA3组钙结节更多；图3的D图示出了通过在562nm下吸光度对茜素红染色进行定量，统计结果显示rhHtrA3组茜素红染色着色更深，成骨向分化潜能更大。
图4 体内应用100ng/ml的HtrA3溶液三天可明显促进大鼠颅骨缺损修复。图4的A图为4w时颅骨缺损修复的CT扫描图片以及骨体积、骨密度定量统计图；图4的B图为8w时颅骨缺损修复的CT扫描图片以及骨体积、骨密度定量统计图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。
本文中，术语“间充质干细胞”，本文中也简写为MSC，是指具有干细胞所有共性的多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力或潜能，例如在特定条件下可分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞，可进而分化为各种组织，如骨、软骨、肌肉或肌腱。本文中的间充质干细胞的来源包括但不限于骨髓、骨骼肌、骨外膜、骨小梁、血液(如脐带血)等。
本文中，术语“成骨向分化”是指具有多向分化能力或潜能的间充质干细胞定向分化为骨细胞谱系的过程。骨细胞谱系包括骨原细胞、成骨细胞前体细胞、成熟的成骨细胞和终末骨细胞，这些细胞类型之间无明显界限，成骨向分化是一个连续发生发展的时序性动态过程。本发明的成骨向分化可通过特征性标志物或得到的成骨参数来表征，具体地可包括下述情形至少之一：
(1) 成骨相关基因的转录水平或对应mRNA的表达水平提高；
(2) 成骨相关蛋白的量或活性提高；
(3) 碱性磷酸酶活性提高；
(4) 钙结节或矿化结节的量增加；
(5) 骨体积和/或骨密度增加。
组合物
本发明的第一方面，提供一种用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，本文有时简写为“本发明的组合物”，其包含胶原蛋白处理物或能够产生所述胶原蛋白处理物的前体。
本发明中，胶原蛋白处理物是由胶原蛋白得到的胶原蛋白降解物或分解物。通常情况下，处理物的分子量比胶原蛋白本身更低。
本发明中，胶原蛋白有时也可以理解为包括胶原肽，一般是指从动物中获取的天然胶原蛋白或肽，对于具体来源不限定。优选地，胶原蛋白是指IV胶原蛋白或至少包含IV胶原蛋白等多种不同类型胶原蛋白的混合物。
本发明中，产生胶原蛋白处理物的前体一般包括作为原料的胶原蛋白和/或作为处理剂的HtrA3蛋白。在同时存在两者的情况下，两者可以单独存在，也可以以混合物形式存在。当单独存在时，则至少在使用前使两者混合所需的时间，例如5小时以上，优选10小时以上，20小时以上，1天以上，如2天、3天、4天。另一方面，一般为5天以下，优选4天以下。两者混合时的温度一般为室温。当以混合物形式存在时，两者的比例不限定。例如基于重量可以在(1-10)：(10-1)范围内。
在某些实施方案中，本发明的前体包括胶原蛋白和HtrA3蛋白，且两者形成为凝胶态或固态。
在某些实施方案中，胶原蛋白处理物通过使胶原蛋白原料与HtrA3蛋白接触反应而得到。接触反应的条件不限定，一般为温和条件，包括1-40℃之间，优选5-35℃，更优选10-30℃的温度，或者在室温下进行所需的反应时间。例如5小时以上，优选10小时以上，20小时以上，1天以上，如2天、3天、4天。另一方面，一般为5天以下，优选4天以下。如果时间过短，则可能不足以生成所需的处理物。另一方面，如果时间过长，则得到的处理物促进成骨向分化的功能变弱，且趋向于向其他方向分化，例如成脂细胞分化。
在优选的实施方案中，胶原蛋白原料与HtrA3蛋白接触反应的条件为适用间充质干细胞培养的条件。该条件既适于产生处理物同时又保证间充质干细胞的培养和分化。在此情况下，处理物的产生和间充质干细胞的培养和分化可同时进行。
在某些实施方案中，胶原蛋白原料和HtrA3蛋白以独立或分离的形式存在。例如，将胶原蛋白包被于至少培养基材的培养表面，而将HtrA3蛋白溶解于培养基，优选地，培养基为间充质干细胞分化用培养基，此类培养基的组成在本领域是已知的。HtrA3蛋白在培养基中的浓度不限定，一般要求能够使得到的工作培养基中的浓度达到0.05-2 ng/ml，优选0.01-1ng/ml，更优选0.5-1ng/ml。
成骨向分化方法
本发明的第二方面，提供一种用于促进间充质干细胞体外成骨向分化的方法，其包括使第一方面所述的组合物或其中至少部分成分与间充质干细胞接触的步骤。
在某些实施方案中，本发明的成骨向分化包括以下步骤：
(1) 向至少培养表面包被有胶原蛋白的培养基材加入骨髓间充质干细胞和第一培养基，在适用培养的条件下保持5小时至5天；
(2) 之后更换第二培养基继续培养甚至得到分化细胞；
其中，所述第一培养基包含0.05-2 ng/ml HtrA3蛋白，所述第二培养基不包含HtrA3蛋白。
此类实施方案中，培养基材可以培养皿、培养瓶、培养板等本领域已知的各种形式。至少培养基材中与骨髓间充质干细胞接触的培养表面包被胶原蛋白，优选IV胶原蛋白或含有IV胶原蛋白的混合物，例如基质胶等。
实施例1
基质胶预包被的培养板中加入人骨髓间充质干细胞以及培养基，实验组在前3天用含重组HtrA3蛋白液（0.1ng/ml）的培养基培养，之后换成正常的培养基。培养7天后，用Trizo提取RNA样品，逆转录后qRT-PCR检测成骨相关基因。如图1所示，图1示出了前3天在培养基中加入重组HtrA3蛋白溶液在7天时成骨相关基因的表达情况。通过Ct值计算成骨基因的表达量，统计对照组与实验组ALP、RUNX2、OPN和OPG的柱状图。结果显示前3天加入重组HtrA3蛋白溶液可以明显增加了骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达水平。7天后，加入细胞裂解液（含1%PMSF）提取蛋白，测量蛋白浓度后通过蛋白免疫印迹检测成骨相关蛋白表达情况，结果显示前3天加入重组HtrA3蛋白溶液明显促进了骨髓间充质干细胞成骨相关蛋白的表达。图2示出了前3天在培养基中加入重组HtrA3蛋白溶液在7天时成骨相关基因表达得到的蛋白情况。蛋白免疫印迹结果显示，实验组中RUNX2、BMP2和SP7的蛋白表达水平明显大于空白对照组。
实施例2
基质胶预包被的培养板中加入人骨髓间充质干细胞以及培养基，实验组在前3天加入重组HtrA3蛋白液（0.1ng/ml），14天时进行碱性磷酸酶（ALP）染色以及ALP活性定量分析，21天时进行茜素红（ARS）矿化结节染色，拍照后加入100nM十六烷基吡啶，以溶解与钙螯合的茜素红染剂，酶标仪于562nm下进行测量吸光度进行ARS定量。结果显示前3天加入重组HtrA3蛋白液后ALP活性是对照组的1.3倍，并且ARS定量显示实验组比对照组提高了5倍。图3结果显示ALP和ARS染色显示成骨前3天加入重组HtrA3蛋白可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。图3中的A为两组ALP染色的代表图；图3中的B为通过检测每克蛋白中所产生的碱性磷酸酶活性来对ALP活性的进行定量，统计分析显示rhHtrA3组ALP活性增加；图3中的C为两组ARS染色的代表图，rhHtrA3组钙结节更多；图3中的D为通过在562nm下吸光度对茜素红染色进行定量，统计结果显示rhHtrA3组茜素红染色着色更深，成骨向分化潜能更大。
实施例3
构建SD大鼠颅骨缺损模型，并于左侧缺损处应用含有100ng/mlHtrA3溶液基质胶，右侧缺损只用基质胶作为空白对照。分别在模型构建后4w和8w取材，多聚甲醛固定24-48h后进行Micro-CT扫描分析。图4结果显示，体内应用100ng/ml的HtrA3溶液三天可明显促进大鼠颅骨缺损修复。图4中的A为4w时颅骨缺损修复的CT扫描图片以及骨体积、骨密度定量统计图；图4中的B为8w时颅骨缺损修复的CT扫描图片以及骨体积、骨密度定量统计图。结果表明，体内应用100ng/ml的HtrA3溶液三天可明显促进大鼠颅骨缺损区域的骨再生。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其特征在于，包含胶原蛋白处理物或能够产生所述胶原蛋白处理物的前体。
2.根据权利要求1所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，所述前体包括HtrA3蛋白或IV型胶原；或者包括独立或混合状态存在的HtrA3蛋白和IV型胶原。
3.根据权利要求1所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，所述前体为凝胶态或固态。
4.根据权利要求1所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，所述胶原蛋白处理物通过使胶原蛋白原料与HtrA3蛋白在适于间充质干细胞培养的条件下接触反应而得到。
5. 根据权利要求1所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，其包括包被于至少培养基材的培养表面的胶原蛋白以及溶解于培养基中的HtrA3蛋白；当所述培养基为直接用于培养间充质干细胞的工作培养基时，HtrA3蛋白在所述培养基中的浓度为0.05-2 ng/ml。
6.根据权利要求1所述的用于促进间充质干细胞成骨向分化的组合物，其中，所述成骨向分化包括下述(1)-(4)情形中的至少一种：
(1) 成骨相关基因的转录水平或对应mRNA的表达水平提高；
(2) 成骨相关蛋白的量或活性提高；
(3) 碱性磷酸酶活性提高；
(4) 钙结节或矿化结节的量增加；
(5) 骨体积和/或骨密度增加。
7.一种用于促进间充质干细胞体外成骨向分化的方法，其特征在于，包括使根据权利要求1-6任一项所述的组合物或其中至少部分成分与间充质干细胞接触的步骤。
8.根据权利要求7所述的用于促进间充质干细胞体外成骨向分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 向至少培养表面包被有胶原蛋白的培养基材加入骨髓间充质干细胞和第一培养基，在适用培养的条件下保持5小时至5天；
(2) 之后更换第二培养基继续培养甚至得到分化细胞；
其中，所述第一培养基包含0.05-2 ng/ml HtrA3蛋白，所述第二培养基不包含HtrA3蛋白。
9.一种骨髓间充质干细胞，其通过根据权利要求7或8所述的方法制备得到。
10.根据权利要求1-6任一项所述的组合物在制备骨再生或骨修复材料中的用途。
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