CN112316213A - 一种用于高效血管化的材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于高效血管化的材料及其制备方法和应用，其解决了现有材料在促进血管再生中的副作用，其含有HtrA3蛋白。本发明同时提供了其制备方法和应用。本发明可用于高效血管化的材料领域。

Description

一种用于高效血管化的材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生物材料及其制备方法和应用，具体说是一种用于高效血管化的材料及其制备方法和应用。
背景技术
血管再生是指从原有的血管以出芽的方式形成新的血管的过程。血管再生是一个高度有序的过程，对很多生理和病理过程都十分重要，如胚胎发育、组织修复、肿瘤形成等。一旦血管再生被启动，向外生长的毛细血管是由一种特殊的被称为“尖端细胞”的细胞带领，后面跟随者茎细胞。在血管内皮生长因子(VEGF)的刺激下，尖端细胞伸出长的且具有动态变化特性的丝状伪足。利用伸向细胞外机制的丝状伪足，尖端细胞具有探测周围环境并带茎细胞定向移动的能力。此外，丝状伪足的融合可导致新的血管分支的形成，过多的尖端细胞可导致超支化的血管网络。因此，尖端细胞和茎细胞的分化是控制血管再生的关键环节。
随着对血管再生研究的深入，一些传统的促进血管再生的细胞因子，如VEGF，bFGF已经应用于促进缺血区域的血管再生了。但是这些传统的细胞因子用于治疗性血管再生因其非特异性有很多副作用，比如病理性血管再生、纤维化、血栓形成等。同样地，因VEGF和其受体在正常的血管内皮上也有生理功能，阻断这些受体会导致正常功能的破坏。
发明内容
本发明就是为了解决现有材料在促进血管再生中存在副作用的技术问题，提供一种对促进血管再生效果较好的用于高效血管化的材料及其制备方法和应用。
为此，本发明提供一种用于高效血管化的材料，其含有HtrA3蛋白。
优选的，其还含有IV型胶原。
优选的，所述有IV型胶原的浓度为0～8mg/ml。
优选的，所述HtrA3蛋白的浓度为0.1～100μg/ml。
本发明同时提供一种用于高效血管化的材料的制备方法，其含有如下步骤：(1)将含有IV型胶原的原料(如基质胶、IV型胶原、明胶等)原料制备成含有浓度0～8mg/ml的IV型胶原液；(2)将HtrA3蛋白制备成0.1～10mg/ml的HtrA3蛋白液；(3)将所述步骤(1)制得的IV型胶原液与所述步骤(2)制得的HtrA3蛋白液混合，固化，制得用于高效血管化的材料。
优选的，所述步骤(3)中，加入血管内皮细胞。
本发明同时提供一种用于高效血管化的材料在用于促进血管再生材料中的应用；
本发明具有以下有益效果：
1.将IV型胶原与HtrA3蛋白混合后，Western显示IV型胶原发生明显降解；
2.将基质胶与HtrA3蛋白液混合后可发现明显β1整合素的吸附，说明β1整合素结合位点的暴露；
3.体内应用100μg/ml的HtrA3溶液三天，可明显促进大鼠颅骨缺损区域的血管再生。与对照组相比，应用了HtrA3溶液的颅骨缺损处内皮细胞的数量多了2倍。
附图说明
图1是本发明中，IV型胶原被HtrA3分解图；
图2是本发明中，被HtrA3分解后，IV型胶原β1整合素结合位点暴露图；
图3A和图3B是2.5％明胶加入0.1μg/mlHtrA3蛋白液可明显促进人脐静脉内皮细胞球的出芽：其中图3A为两组内皮细胞球铺展图；图3B为对两组细胞球的定量分析显示HtrA3可促进细胞球的侵袭距离和出芽的数目。(标尺：200μm)
图4A和图4B过表达HtrA3的脐静脉内皮细胞具有更强的管腔形成能力：其中图4A为两组内皮细胞管腔形成实验图；图4B为对两组细胞管腔形成实验的定量分析显示HtrA3过表达可明显促进管腔长度、分支数目和管腔数目。(标尺：500μm)
图5A和图5B皮下植入过表达HtrA3的脐静脉内皮细胞具有更强的血管再生能力：其中图5A为两组皮下注入内皮细胞血管再生实验图；图5B为对两组体内实验的定量分析显示HtrA3过表达可明显促进分支数目、管腔数目和血管面积。(标尺：200μm)
图6A和图6B在大鼠颅骨缺损处应用50μg/ml和100μg/ml的HtrA3溶液三天后照片：图6A应用50μg/mlHtrA3溶液，图6B为100μg/ml的HtrA3溶液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改，皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。本发明所涉及的IV型胶原指含有IV型胶原的原料，比如IV型胶原、基质胶、明胶及其制品等；HtrA3蛋白可以从市场公开购买。
实施例1
2.5％明胶(IV型胶原含量约8mg/ml)加入0.1μg/mlHtrA3蛋白液和人脐静脉内皮细胞球混合后，光固化1min后，加入内皮细胞培养基。在培养箱培养12h后，可发现加入HtrA3蛋白液的明胶可明显促进内皮细胞球的出芽。
实施例2
24孔板里加入300μl的基质胶，在37℃培养箱中固化30分钟。固化后加入500μl 1*106个过表达HtrA3的脐静脉内皮细胞或其对照细胞后，在培养箱中培养6h。结果显示过表达HtrA3的脐静脉内皮细胞具有更强的管腔形成能力。
实施例3
将1ml的基质胶和1*109个过表达HtrA3的脐静脉内皮细胞(产生HtrA3浓度约为50μg/ml)或其对照细胞混合后，植入4周的裸鼠皮下，每只0.1μl。7天后，将植入物取出，固定，切片，免疫荧光染色。结果显示，过表达HtrA3的脐静脉内皮细胞在体内具有更强的血管再生能力。
实施例4
体内应用50μg/ml和100μg/ml的HtrA3溶液三天，不加入IV型胶原(利用体内自身胶原)可明显促进大鼠颅骨缺损区域的血管再生，且100μg/ml的体内效果明显优于50μg/ml。

Claims (7)

1.一种用于高效血管化的材料，其特征是，其含有HtrA3蛋白。
2.根据权利要求1所述的用于高效血管化的材料，其特征在于，其还含有IV型胶原。
3.根据权利要求1或2所述的用于高效血管化的材料，其特征在于，所述HtrA3蛋白的浓度为0.1～100μg/ml。
4.根据权利要求3所述的用于高效血管化的材料，其特征在于，所述IV型胶原的浓度为0～8mg/ml。
5.如权利要求1所述的用于高效血管化的材料的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)将含有IV型胶原的原料制备成含有浓度0～8mg/ml的IV型胶原液；
(2)将HtrA3蛋白制备成0.1～100μg/ml的HtrA3蛋白液；
(3)将所述步骤(1)制得的IV型胶原液与所述步骤(2)制得的HtrA3蛋白液混合，固化，制得用于高效血管化的材料。
6.根据权利要求5所述的用于高效血管化的材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，加入血管内皮细胞。
7.如权利要求1或2所述的用于高效血管化的材料在用于促进血管再生材料中的应用。
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