FR3131315A1 - Oligonucléotide linéaire et utilisation dans la détection d’analytes d’intérêt - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un oligonucléotide linéaire présentant, dans sa séquence, à son extrémité 5’ ou à son extrémité 3’, une structure comprenant une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à au moins un analyte d’intérêt. La présente invention concerne également l’utilisation d’un tel oligonucléotide linéaire pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, via une amplification isotherme médiée par des boucles à deux amorces. Figure 2
Description
La présente invention concerne le domaine des outils et procédés de détection de molécules d’intérêt.
Plus particulièrement, la présente invention propose une structure oligonucléotidique linéaire particulière, utile notamment pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte d’intérêt dans un échantillon liquide mettant en œuvre une amplification LAMP (pour « Loop-mediated isothermal AMPlification ») à deux amorces. La présente invention concerne également un tel procédé de détection et d’éventuelle quantification.
De nombreux travaux et études dans des domaines englobant notamment la recherche académique ; la recherche et les analyses, cliniques et diagnostiques, avec des essais réalisés sur des prélèvements de sang ou des biopsies cellulaires ou tissulaires ; la surveillance environnementale ; la surveillance civile ; la sécurité alimentaire et notamment le contrôle qualité ; les analyses criminelles sur traces… impliquent la détection de biomarqueurs, de molécules d’intérêt ou de contaminants dans un échantillon et notamment dans un échantillon liquide.
Plusieurs techniques ont été mises au point à cet effet.
Une première technique immuno-enzymatique de détection intitulée méthode ELISA (pour « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ») a été développée au début des années 1970. Parmi les différentes mises en œuvre employées dans cette technique, un sandwich entre deux anticorps spécifiques et la cible peut être réalisé. Le premier anticorps est utilisé pour capturer la cible, par exemple, au fond d’un puits, alors que le deuxième anticorps sert à l’amplification enzymatique, directement ou via un anticorps secondaire couplé à une enzyme comme la HRP (pour « Horse Radish Peroxidase »). La méthode ELISA met en œuvre un anticorps et permet une quantification de la cible au moyen d’une gamme de calibration réalisée au préalable ou simultanément. Cette méthode est encore actuellement largement utilisée et de nombreuses variantes existent. En effet, un aptamère qui est une séquence oligonucléotidique sélectionnée spécifiquement pour son interaction avec un analyte ou toute autre séquence oligonucléotidique ayant une affinité spécifique envers un analyte peut être utilisé à la place d’un anticorps et appliqué comme sonde dans une méthode ELISA. Les aptamères constituent une bonne alternative aux anticorps dans la mesure où, présentant une affinité similaire à celle des anticorps, ils peuvent détecter de petites molécules et où ils sont très spécifiques d’une cible, beaucoup plus faciles à produire et à manipuler, plus stables et moins coûteux.
Cependant, lorsque la cible à détecter est présente en très faibles concentrations dans l’échantillon, la technique ELISA avec anticorps ou aptamères s’avère inefficace et ne permet pas d’atteindre des faibles limites de détection. Pour résoudre ce problème, l’amplification d’une sonde ADN est généralement nécessaire.
C’est pourquoi, d’autres méthodes de détection ont été développées mettant en œuvre une amplification en chaîne par polymérase (ou PCR pour « Polymerase Chain Reaction »). A titre d’exemples particuliers de telles méthodes, on peut citer l’immuno-PCR et l’aptaméro-PCR.
Dans l’immuno-PCR, l’amplification enzymatique de la technique ELISA est remplacée par une amplification d’ADN. Le second anticorps est alors couplé à une séquence ADN qui est exponentiellement amplifiée par PCR. Cette méthode est très spécifique et quantitative mais elle nécessite toujours la présence de deux anticorps spécifiques de la cible et notamment le développement d’un anticorps couplé à un ADN, ce qui rend cette méthode compliquée et coûteuse.
L’aptaméro-PCR, quant à elle, permet de remplacer l’anticorps secondaire par un oligonucléotide contenant une séquence d’aptamère spécifique de la cible à détecter. La détection est obtenue par l’amplification directe de cette sonde par PCR. Cette méthode permet d’atteindre une limite de détection de quelques picomolaires. Cependant, l’immuno-PCR et l’aptaméro-PCR présentent, toutes deux, les inconvénients de la PCR à savoir la nécessité de cycles de températures relativement longs et comportant différentes températures.
Enfin, une autre méthode d’amplification a été développée pour remplacer la PCR dans le cadre de l’amplification de doubles brins d’ADN. Cette méthode appelée LAMP et brevetée[1]présente l’avantage majeur d’être isotherme, l’amplification étant réalisée à une température constante typiquement comprise entre 60°C et 65°C, et permettant une détection rapide.
Ainsi, une méthode de détection de protéines avec amplification LAMP a été décrite par Pourhassan-Moghaddamet al, 2013[2]. Elle met en œuvre, d’une part, un anticorps ou un aptamère fixé à une surface pour capturer la cible et, d’autre part, un oligonucléotide contenant une séquence aptamère qui reconnaît la cible. Cet oligonucléotide est, par la suite, amplifié par la méthode LAMP classique avec quatre amorces.
Cependant, le design complexe des quatre amorces indispensables à la méthode d’amplification LAMP rend ce procédé complexe et relativement long à mettre en œuvre, malgré le développement de nombreux logiciels de design des amorces LAMP comme, par exemple, LAMP designer (OPtigene) ou primer Explorer.
Enfin, une méthode de détection de micro-ARNs (mi-ARNs) par une méthode LAMP avec deux amorces a été développée[3, 4]. Cette méthode présente l’avantage d’être quantitative. Toutefois, elle ne permet de détecter que de l’ARN à partir duquel est formé un fragment d’ADN complémentaire (ADNc) au moyen d’une réaction de transcription inverse. Deux sondes d’ADN en épingle à cheveux désignées H1 et H2 dans Duet al, 2016[4]sont conçues, la sonde H1 présentant à son extrémité 3’ une extension complémentaire à la moitié du fragment d’ADNc et la sonde H2 présentant à son extrémité 5’ une extension complémentaire à l’autre moitié du fragment d’ADNc. En présence du fragment d’ADNc, les sondes H1 et H2 s’hybrident sur ce dernier et, si aucun mésappariement n’existe entre les extensions des sondes H1 et H2 et le fragment d’ADNc, une liaison covalente entre les deux sondes d’ADN H1 et H2 peut être formée grâce à une ligase haute-fidélité comme laTaqDNA ligase. Il est donc clair que cette méthode de détection de mi-ARNs n’est pas générique puisqu’elle nécessite la préparation de deux sondes spécifiques de chaque mi-ARN à détecter. Par ailleurs, cette méthode implique plusieurs étapes avant la mise en œuvre de la technique LAMP avec une étape de transcription inverse et une étape de ligation, cette dernière pouvant être complexe avec un rendement possiblement faible et la nécessité d’utiliser une enzyme supplémentaire. Malgré cela, dans leur publication Duet al, 2016[4], les auteurs insistent sur le fait que cette étape est primordiale notamment pour une meilleure discrimination des mutations dans les mi-ARNs (phrase pontant les colonnes de la page 12722).
Les inventeurs ont déjà mis au point une méthode innovante permettant de réaliser une amplification LAMP avec seulement deux amorces[5 , 6 ]. Cette méthode permet de détecter des analytes d’intérêt de nature variée dans un échantillon et ne présente pas les inconvénients des méthodes de l’état de la technique. Elle met en œuvre une séquence se présentant sous forme d’un oligonucléotide à double structure tige-boucle, également désigné sous le terme « haltère », servant de matrice à l’amplification LAMP et permettant d’éliminer les premières étapes de cette amplification. Elle permet de combiner la reconnaissance d’analytes par des brins oligonucléotidiques et l’amplification LAMP à deux amorces, et donne une détection à haute sensibilité. En effet, l’oligonucléotide à double structure tige-boucle mis en œuvre intègre, au sein de sa structure[5]ou à l’une de ses extrémités[6 ], une entité de reconnaissance de l’analyte d’intérêt.
Les inventeurs se sont donc fixé pour but de proposer un outil utile dans un procédé permettant de détecter des molécules d’intérêt de nature variée dans un échantillon, ledit procédé ne présentant pas les inconvénients des méthodes de l’état de la technique et permettant d’améliorer encore l’oligonucléotide à double structure tige-boucle décrit dans[5 , 6 ].
La présente invention permet de résoudre des problèmes techniques et inconvénients précédemment listés. En effet, les inventeurs ont proposé un nouvel outil oligonucléotidique notamment utile dans un procédé de détection et éventuellement de quantification d’un analyte, qui permet de profiter des avantages de l’amplification LAMP à deux amorces, à savoir méthode isotherme, quantifiable et ne nécessitant que deux amorces.
L’outil oligonucléotidique objet de la présente invention est un oligonucléotide linéaire qui se distingue clairement des oligonucléotides à double structure tige-boucle décrits dans[5, 6]. En effet, la séquence de l’oligonucléotide selon l’invention mise en œuvre est modifiée pour devenir plus courte, idéalement inférieure à 100 bases. Cela permet notamment d’envisager une synthèse chimique plus simple, plus efficace avec un rendement important et une purification plus facile et plus économe.
Plus particulièrement, les portions F1c et B1 telles que définies dans les oligonucléotides à double structure tige-boucle décrits dans[5, 6]ont été supprimées dans l’oligonucléotide selon l’invention empêchant ainsi toute hybridation et donc la formation de structures tige-boucle. Cet oligonucléotide comprenant les portions F2, F1, B1c et B2c peut alors être modifié en ajoutant une entité spécifique de l’analyte à détecter ou utilisable pour cette détection à divers endroits de la séquence, notamment en 5’ ou 3’ mais aussi entre F2 et F1, entre F1 et B1c ou entre B1c et B2c.
Ainsi, il est facile de préparer l’oligonucléotide selon l’invention à partir de la séquence de toutes amorces FIP (pour « Forward Inner Primer ») et BIP (pour « Backward Inner Primer ») décrites dans l’art antérieur. En effet, l’oligonucléotide objet de l’invention comprend une portion F2 également présente dans l’amorce FIP, une portion F1 complémentaire à la portion F1c présente dans l’amorce FIP, une portion B1c également présente dans l’amorce BIP et une portion B2c complémentaire à la portion B2 présente dans l’amorce BIP.
Dans le cadre de la présente invention, deux séquences nucléotidiques sont complémentaires l’une de l’autre, lorsqu'un nombre suffisant de nucléotides de la première séquence nucléotidique peut se lier, au moyen de liaisons hydrogène, avec les nucléotides correspondants de la deuxième séquence nucléotidique de telle sorte que l'appariement entre les deux séquences nucléotidiques peut se produire. La « complémentarité », telle qu'utilisée ici, se réfère à la capacité d'appariement entre les nucléotides d'une première séquence nucléotidique et d'une seconde séquence nucléotidique. Des nucléotides non complémentaires entre deux séquences nucléotidiques peuvent être tolérés à condition que les deux séquences nucléotidiques restent capables de s'hybrider spécifiquement l'une à l'autre. De plus, une première séquence nucléotidique peut s'hybrider sur un ou plusieurs segments d'une seconde séquence nucléotidique de telle sorte que les segments intermédiaires ou adjacents ne sont pas impliqués dans l'hybridation. Dans certaines formes de mise en œuvre de l’invention, une première séquence nucléotidique ou une partie spécifique de celle-ci, est au moins 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complémentaire à une deuxième séquence nucléotidique ou une partie spécifiée de celle-ci.
De manière surprenante et contrairement à ce que l’homme du métier pourrait penser, la mise en contact de l’oligonucléotide linéaire selon l’invention avec les deux amorces FIP de séquence 5’-F1c-F2-3’ et BIP de séquence 5’-B1c-B2-3’, classiquement utilisées dans les amplifications LAMP à deux amorces donne bien lieu à une amplification exponentielle, comme décrit dans la partie expérimentale ci-après.
L’oligonucléotide linéaire, objet de la présente invention répond à la formule (I) suivante :
Sa-F2-Sb-F1-Int-B1c-Sc-B2c-Sd (I)
dans laquelle
Sa représente l’extrémité 5’ de la portion F2 ou une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
la portion F2 comprend de 8 à 30 nucléotides,
Sb séparant la portion F2 et la portion F1 est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
la portion F1 comprend de 10 à 35 nucléotides,
Int séparant la portion F1 et la portion B1c est choisi dans le groupe constitué par une liaison covalente, une portion comprenant au moins un nucléotide et une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
la portion B1c comprend de 10 à 35 nucléotides,
Sc séparant la portion B1c et la portion B2c est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
la portion B2c comprend de 8 à 35 nucléotides, et
Sd représente l’extrémité 3’ de la portion B2c ou une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
à condition qu’au moins un parmi Sa, Sb, Int, Sc et Sd comprenne une structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt.
L’oligonucléotide linéaire selon l’invention peut comprendre deux, trois, quatre ou cinq structures ou portions comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt.
Avantageusement, l’oligonucléotide linéaire selon l’invention comprend une seule structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt.
En d’autres termes, l’oligonucléotide linéaire selon l’invention répond à l’une quelconque des formules (II), (III), (IV), (V) et (VI) suivantes :
Sa’-F2-F1-Int’-B1c-B2c (II)
F2-Sb’-F1-Int’-B1c-B2c (III)
F2-F1-Int’’-B1c-B2c (IV)
F2-F1-Int’-B1c-Sc’-B2c (V) et
F2-F1-Int’-B1c-B2c-Sd’ (VI)
dans lesquelles
les portions F2, F1, B1c et B2c sont telles que précédemment définies,
Int’ séparant la portion F1 et la portion B1c est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins un nucléotide, et
Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ et Sd’ représentent une structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l’oligonucléotide linéaire selon l’invention répond à la formule (II) ou (VI) suivante :
Sa’-F2-F1-Int’-B1c-B2c (II)
F2-F1-Int’-B1c-B2c-Sd’ (VI)
dans lesquelles
les portions F2, F1, B1c et B2c sont telles que précédemment définies,
Int’ séparant la portion F1 et la portion B1c est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins un nucléotide, et
Sa’ et Sd’ représentent une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt.
Dans l’oligonucléotide linéaire selon l’invention, la portion F2 peut comprendre de 10 à 27 nucléotides et, à titre d’exemple particulier, 21 ou 24 nucléotides.
Dans l’oligonucléotide linéaire selon l’invention, la portion F1 peut comprendre de 15 à 25 nucléotides et, à titre d’exemples particuliers, 19, 20, 21 ou 22 nucléotides. Par ailleurs, la portion F1 présente une séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique de la portion F1c présente dans l’amorce FIP utilisée lors de l’amplification LAMP à deux amorces. La température de fusion (Tm) de F1-F1c est typiquement supérieure à la température utilisée lors de l’amplification (typiquement entre 55°C et 65°C). La Tm de F1-F1c est supérieure à la température utilisée lors de l’amplification avantageusement d’au moins 5°C, notamment d’au moins 7°C et, en particulier, d’au moins 10°C. L’homme du métier pourra trouver des informations additionnelles quant à ces portions dans[1].
Dans l’oligonucléotide linéaire selon l’invention, la portion B1c peut comprendre de 17 à 27 nucléotides et, à titre d’exemples particuliers, 18 ou 25 nucléotides. Par ailleurs, la portion B1c présente une séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique de la portion B1 présente dans l’amorce BIP utilisée lors de l’amplification LAMP à deux amorces. La température de fusion (Tm) de B1-B1c est notamment supérieure à la température utilisée lors de l’amplification. La Tm de B1-B1c est supérieure à la température utilisée lors de l’amplification avantageusement d’au moins 5°C, notamment d’au moins 7°C et, en particulier, d’au moins 10°C. L’homme du métier pourra trouver des informations additionnelles quant à ces portions dans[1].
Dans l’oligonucléotide linéaire selon l’invention, la portion B2c peut comprendre de 15 à 30 nucléotides et, à titre d’exemples particuliers, 18 ou 22 nucléotides.
Dans l’oligonucléotide linéaire selon la présente invention, lorsque Int ou Int’ représente une portion comprenant au moins un nucléotide, cette dernière peut comprendre jusqu’à 3 nucléotides, 10 nucléotides, 30 nucléotides, 50 nucléotides et voire 70 nucléotides et ne comprend aucune structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt.
Avantageusement, l’oligonucléotide linéaire selon l’invention comprend moins de 180 nucléotides, notamment moins de 160 nucléotides, en particulier moins de 150 nucléotides, plus particulièrement moins de 140 nucléotides et tout particulièrement moins de 130 nucléotides.
Dans certains modes de réalisation, l’oligonucléotide linéaire selon l’invention peut comprendre moins de 130 nucléotides, notamment moins de 120 nucléotides, en particulier moins de 110 nucléotides, plus particulièrement moins de 100 nucléotides et tout particulièrement moins de 90 nucléotides, notamment lorsque la ou les structures ou portions comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt ne présente(nt) aucun nucléotide.
Avec une telle taille, la synthèse chimique de cet oligonucléotide est facilitée et le coût de cette synthèse et, par conséquent, le coût du procédé selon l’invention sont moindres.
La structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ dans l’oligonucléotide selon l’invention peut ne comprendre qu’une entité E telle que précédemment définie. Dans cette première variante, la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ consiste en une entité E. En d’autres termes, cette entité E est liée :
- via une liaison covalente, à l’extrémité 5’ de la portion F2, ou
- via une liaison covalente, à l’extrémité 3’ de la portion B2c, ou
- soit via une première liaison covalente à l’extrémité 3’ de F2 et via une seconde liaison covalente à l’extrémité 5’ de F1, ou
- soit via une première liaison covalente à l’extrémité 3’ de F1 et via une seconde liaison covalente à l’extrémité 5’ de B1c, ou
- soit via une première liaison covalente à l’extrémité 3’ de B1c et via une seconde liaison covalente à l’extrémité 5’ de B2c.
- via une liaison covalente, à l’extrémité 5’ de la portion F2, ou
- via une liaison covalente, à l’extrémité 3’ de la portion B2c, ou
- soit via une première liaison covalente à l’extrémité 3’ de F2 et via une seconde liaison covalente à l’extrémité 5’ de F1, ou
- soit via une première liaison covalente à l’extrémité 3’ de F1 et via une seconde liaison covalente à l’extrémité 5’ de B1c, ou
- soit via une première liaison covalente à l’extrémité 3’ de B1c et via une seconde liaison covalente à l’extrémité 5’ de B2c.
Dans une deuxième variante, la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ dans l’oligonucléotide selon l’invention peut comprendre, en plus d’une entité E telle que précédemment définie, au moins un autre élément permettant de lier l’entité E à l’extrémité 5’ de la portion F2, à l’extrémité 3’ de la portion F2, à l’extrémité 3’ de la portion F1, à l’extrémité 5’ de la portion F1, à l’extrémité 5’ de la portion B1c, à l’extrémité 3’ de la portion B1c, à l’extrémité 5’ de la portion B2c et/ou à l’extrémité 3’ de la portion B2c. Cet élément additionnel est connu sous l’expression « bras de liaison » et sert à améliorer l’accessibilité de l’entité E. L’homme du métier connaît différents exemples de tels éléments utilisables dans le cadre de la présente invention[5, 6]. A titre d’exemples, on peut citer une molécule nucléotidique telle que précédemment définie et notamment une séquence comprenant plusieurs bases thymine et notamment 10 bases thymine, un polymère comme, par exemple, un poly-éthylène glycol (PEG) ou une structure moléculaire streptavidine-biotine. Ces deux derniers exemples (polymère et structure moléculaire) sont notamment plus adaptés aux structures Sa, Sd, Sa’ et Sd’ dans l’oligonucléotide selon l’invention. Les liaisons mises en œuvre dans cette variante sont des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals et/ou des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes.
Dans une troisième variante, la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ dans l’oligonucléotide selon l’invention peut comprendre plusieurs entités E telles que précédemment définies, identiques ou différentes. Dans cette variante, deux entités E successives peuvent éventuellement être séparées par un bras de liaison. De même, ces entités peuvent éventuellement être liées à l’extrémité 5’ ou 3’ de la portion adjacente via un bras de liaison. Enfin, lorsque la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ présente plusieurs bras de liaison, ces derniers peuvent être identiques ou différents.
Dans un premier mode de réalisation, la ou les entités E présente(s) au niveau de la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ dans l’oligonucléotide selon l’invention sont aptes à se lier directement à au moins un analyte d’intérêt. Une entité E selon ce mode de réalisation peut également être désignée, dans la présente, par l’expression « entité de reconnaissance ».
Cette entité peut être toute molécule capable de former avec l’analyte à détecter une paire d’éléments formant une liaison, également désignée par l’expression « paire de liaison » ou, en anglais, « binding pair ». L’entité E et l’analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison analyte-entité sont avantageusement des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals et/ou des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes. Des liaisons non covalentes et de faible énergie seront notamment mises en œuvre lorsque l’entité E se trouve dans l’une quelconque des portions ou structures précitées et, en particulier, dans la portion Sb, Sb’, Int, Int’’, Sc ou Sc’. Des liaisons de forte énergie pourront être mises en œuvre dans les structures Sa, Sa’, Sd et Sd’. En effet, dans ces structures, des liaisons de forte énergie n’affecteront pas l’amplification LAMP.
La ou les entités de reconnaissance utilisées sont donc dépendantes du ou des analytes à détecter. En fonction de ce ou des derniers, l’homme du métier saura, sans effort inventif, choisir la ou les entités les plus adaptées. Une entité de reconnaissance peut être choisie, par exemple, dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide tel qu’un peptide antimicrobien ou un MIP pour « MHC class I peptide » i.e. un peptide associé au CMH-1 (pour « Complexe Majeur d’Histocompatibilité-1 ») ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d’un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d’anticorps tel qu’un fragment Fab, F(ab’)2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Region ») ; une molécule nucléotidique ; et un aptamère.
A noter qu’une entité formant une paire de liaisons avec un analyte d’intérêt se présente avantageusement sous forme d’une séquence nucléotidique, lorsque cette entité est comprise dans la portion Sb, Sb’, Int, Int’’, Sc ou Sc’.
L’expression « molécule nucléotidique » utilisée dans la présente est équivalente aux termes et expressions suivants : « acide nucléique », « polynucléotide », « séquence nucléotidique », « séquence polynucléotidique » et « séquence oligonucléotidique ». Par « molécule nucléotidique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal (ou ribozyme) ; un ARN de transfert ; un micro-ARN ; un petit ARN interférent; une séquence faisant office d’aptamère ; un acide nucléique peptidique ; un acide nucléique verrouillé (ou LNA pour « Locked Nucleic Acid ») ; un morpholino ; une portion ou un fragment de ceux-ci.
Dans un second mode de réalisation notamment illustré dans la partie expérimentale ci-après, la ou les entités E présentes au niveau de la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ sont aptes à se lier indirectement à un ou des analytes d’intérêt. Ce second mode de réalisation s’applique en particulier au cas où la ou les entités E sont présentes au niveau de la structure Sa, Sd, Sa’ ou Sd’. En d’autres termes, cette ou ces entités E sont indépendantes du ou des analytes d’intérêt à détecter et cette détection nécessite l’utilisation d’un intermédiaire de liaison apte à se lier, d’une part, à l’oligonucléotide selon ce second mode de réalisation de l’invention et, d’autre part, à ou aux analytes d’intérêt. Ce partenaire de liaison correspond à une molécule comprenant une première portion P1 apte à se lier à une entité E présente dans la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ de l’oligonucléotide et notamment dans la structure Sa, Sd, Sa’ ou Sd’ et une seconde portion P2 apte à se lier à au moins un analyte d’intérêt. La portion P2 de cette molécule correspond à une entité de reconnaissance telle que définie précédemment ou comprend plusieurs entités de reconnaissance telles que définies précédemment, identiques ou différentes. Ainsi, tout ce qui a été décrit ci-dessus pour l’entité ou les entités de reconnaissance s’appliquemutatis mutandisà la portion P2. Dans ce partenaire de liaison, la portion P1 et la portion P2 sont couplées l’une à l’autre au moyen d’une liaison covalente. En variante, la portion P1 et la portion P2 peuvent être couplées l’une à l’autre au moyen d’un bras de liaison tel que précédemment défini.
Une entité E de ce second mode de réalisation peut être toute molécule capable de former une paire de liaison avec la portion P1 du partenaire de liaison, l’entité E et la portion P1 correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison entité-portion P1 sont des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals.
La présente invention concerne un complexe non-covalent, formé par un oligonucléotide selon le second mode de réalisation et une molécule comprenant une première portion P1 apte à se lier à ladite au moins une entité E dudit oligonucléotide et une seconde portion P2 apte à se lier à au moins un analyte d’intérêt. En d’autres termes, ce complexe non-covalent est formé par un oligonucléotide linéaire dont la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ et notamment la structure Sa, Sd, Sa’ ou Sd’ comprend au moins une entité E apte à se lier indirectement à au moins un analyte d’intérêt tel que précédemment défini et une molécule comprenant une première portion P1 apte à se lier à cette au moins une entité E présente dans la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ et notamment la structure Sa, Sd, Sa’ ou Sd’ et une seconde portion P2 apte à se lier à au moins un analyte d’intérêt. Un tel complexe peut être désigné par l’expression « complexe de liaison ».
La présente invention concerne également l’utilisation d’un oligonucléotide linéaire tel que précédemment défini ou un complexe de liaison tel que précédemment défini pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide.
Cette utilisation met plus particulièrement en œuvre une amplification LAMP à deux amorces, l’une, généralement désignée « amorce FIP », de formule 5’-F1c-F2-3’ et l’autre, généralement désignée « amorce BIP », de formule 5’-B1c-B2-3’.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes :
i) mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d’un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ;
ii) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant soit au moins un oligonucléotide linéaire dont la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ comprend une entité E apte à se lier directement à au moins un analyte d’intérêt tel que précédemment défini, soit un complexe de liaison tel que précédemment défini, ledit oligonucléotide et ledit complexe ayant été préparés préalablement à ladite mise en contact ;
iii) éliminer l’excès d’oligonucléotides ou l’excès de complexes de liaison n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii) ;
iv) mettre en contact, avec deux amorces d’amplification isotherme médiée par des boucles dans des conditions permettant l’amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l’oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison tel que précédemment défini, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ;
v) détecter et éventuellement quantifier le produit de l’amplification dudit oligonucléotide (moyennant quoi ledit au moins un analyte est détecté et éventuellement quantifié).
i) mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d’un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ;
ii) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant soit au moins un oligonucléotide linéaire dont la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ comprend une entité E apte à se lier directement à au moins un analyte d’intérêt tel que précédemment défini, soit un complexe de liaison tel que précédemment défini, ledit oligonucléotide et ledit complexe ayant été préparés préalablement à ladite mise en contact ;
iii) éliminer l’excès d’oligonucléotides ou l’excès de complexes de liaison n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii) ;
iv) mettre en contact, avec deux amorces d’amplification isotherme médiée par des boucles dans des conditions permettant l’amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l’oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison tel que précédemment défini, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ;
v) détecter et éventuellement quantifier le produit de l’amplification dudit oligonucléotide (moyennant quoi ledit au moins un analyte est détecté et éventuellement quantifié).
Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes :
i') mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d’un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ;
i') mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d’un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ;
ii1’) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins une molécule comprenant une première portion P1 apte à se lier à l’entité E présente dans la structure de l’oligonucléotide selon la présente invention et une seconde portion P2 apte à se lier audit au moins un analyte d’intérêt ;
ii2’) éliminer l’excès de molécules n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii1’) ;
ii3’) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire dont la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ comprend une entité E apte à se lier indirectement audit analyte d’intérêt tel que précédemment défini, ledit oligonucléotide ayant été synthétisé préalablement à ladite mise en contact ;
iii’) éliminer l’excès d’oligonucléotides n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii3’) ;
iv’) mettre en contact, avec deux amorces d’amplification isotherme médiée par des boucles dans des conditions permettant l’amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l’oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison tel que précédemment défini, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ;
v’) détecter et éventuellement quantifier le produit de l’amplification dudit oligonucléotide (moyennant quoi ledit au moins un analyte est détecté et éventuellement quantifié).
ii2’) éliminer l’excès de molécules n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii1’) ;
ii3’) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire dont la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ comprend une entité E apte à se lier indirectement audit analyte d’intérêt tel que précédemment défini, ledit oligonucléotide ayant été synthétisé préalablement à ladite mise en contact ;
iii’) éliminer l’excès d’oligonucléotides n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii3’) ;
iv’) mettre en contact, avec deux amorces d’amplification isotherme médiée par des boucles dans des conditions permettant l’amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l’oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison tel que précédemment défini, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ;
v’) détecter et éventuellement quantifier le produit de l’amplification dudit oligonucléotide (moyennant quoi ledit au moins un analyte est détecté et éventuellement quantifié).
L’échantillon liquide mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est un liquide susceptible de contenir un ou des analytes à détecter et éventuellement à quantifier. Il peut être de nature et d’origine très variées.
Cet échantillon liquide est avantageusement choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; un fluide végétal tel que sève, nectar et exsudat racinaire ; un prélèvement dans un milieu de culture ou dans un réacteur de culture biologique comme une culture cellulaire d’eucaryotes supérieurs, de levures, de champignons, d’algues ou de bactéries ; un liquide obtenu à partir d’une (ou plusieurs) cellule(s) animale(s) ou végétale(s) ; un liquide obtenu à partir d’un tissu animal ou végétal ; un prélèvement dans une matrice alimentaire ; un prélèvement dans un réacteur chimique ; de l’eau de ville, de rivière, de mer, de piscines, de tours aéro-réfrigérées ou d’origine souterraine; un prélèvement à partir d’un effluent industriel liquide;de l’eau usée provenant notamment d’élevages intensifs ou d’industries du domaine chimique, pharmaceutique ou cosmétique ; un prélèvement provenant d’une filtration d’air ou d’un revêtement ; un prélèvement sur un objet tel qu’un fragment de tissu, un habit, une semelle, une chaussure, un outil ou une arme ; un produit pharmaceutique ; un produit cosmétique ; un parfum ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « prélèvement » tout type de collecte d’échantillons, par exemple, par contact, raclage, forage, découpage, poinçonnage, broyage, lavage, rinçage, aspiration ou pompage.
Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, la salive, le crachat, les larmes, la sueur, le sperme, l'urine, les selles, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito-urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d’organes. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d’un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d’un corps humain ou animal, par toute technique connue de l’homme du métier telle qu’une extraction, un prélèvement ou un lavage. Les étapes de récupération et d’isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
De même, si un des prélèvements envisagés ne permet pas de mettre en œuvre le procédé de l’invention, par exemple du fait de sa nature gazeuse ou solide, de sa concentration ou des éléments qu’il contient tels que résidus solides, déchets, suspension ou molécules interférentes, le procédé de l’invention comprend en outre une étape préalable de préparation de l’échantillon liquide avec éventuellement une mise en solution du prélèvement par les techniques connues de l’homme du métier telles que filtration, précipitation, dilution, distillation, mélange, concentration, lyse, etc.
Par ailleurs, il est possible d’ajouter, à l’échantillon liquide, des quantités connues d’au moins un analyte à détecter. On parle alors d’échantillon liquide dopé par au moins un analyte, ce dopage permettant d’avoir un contrôle positif notamment lorsque l’échantillon liquide est complexe et éventuellement d’obtenir une quantification du ou des analytes à détecter initialement contenus dans l’échantillon liquide.
Un analyte à détecter et éventuellement à quantifier dans l’échantillon liquide peut être choisi dans le groupe constitué par une molécule d’intérêt environnemental tel qu’un pesticide ; une molécule d’intérêt biologique ; une molécule d’intérêt pharmacologique ; une toxine ; un glucide tel que du glucose ; un lipide tel que du cholestérol ; un peptide ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur nucléaire ou membranaire ; un agoniste ou un antagoniste d’un récepteur nucléaire ou membranaire ; une hormone ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d’anticorps tel qu’un fragment Fab, F(ab’)2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Region ») ; une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; des ions tels que des ions mercure ou des ions plomb ; une cellule eucaryote ; une cellule procaryote et un virus.
A noter que, dans certaines formes de mise en œuvre, un analyte à détecter et éventuellement à quantifier dans l’échantillon liquide peut être défini comme une petite molécule i.e. une molécule dont le poids moléculaire est inférieur ou égal à 10000 daltons et notamment inférieur ou égal à 8000 daltons. Cette petite molécule peut appartenir à l’un quelconque des éléments des listes d’analytes ci-dessus.
L’étape i) ou i’) du procédé selon la présente invention met en œuvre une sonde apte à lier ledit au moins un analyte immobilisée sur la surface d’un support solide. La sonde utilisée pour fonctionnaliser une zone active de la surface du support solide est toute molécule capable de former avec un analyte à détecter une paire de liaisons, la sonde et l’analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaisons. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison analyte-sonde sont avantageusement soit des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals, soit des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes.
La sonde utilisée est donc dépendante d’un analyte à détecter. En fonction de cet analyte, l’homme du métier saura, sans effort inventif, choisir la sonde la plus adaptée. Elle peut être choisie, par exemple, dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide tel qu’un peptide antimicrobien ou un MIP i.e. un peptide associé au CMH-1 (pour « Complexe Majeur d’Histocompatibilté-1 ») ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d’un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d’anticorps tel qu’un fragment Fab, F(ab’)2, Fv ou un domaine hypervariable ; une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; et un aptamère.
Il est évident que, lors du choix de la sonde la mieux adaptée, il convient de tenir compte de l’entité de reconnaissance mise en œuvre ultérieurement. La sonde et l’entité de reconnaissance peuvent reconnaître des zones ou éléments distincts au niveau de l’analyte à détecter. En variante, la sonde et l’entité de reconnaissance peuvent cibler le même élément au niveau de l’analyte à détecter. Cette variante correspond notamment au cas où l’analyte à détecter est une bactérie ou un virus et l’élément à cibler un élément de surface présent au niveau de plusieurs zones de surface bactérienne ou virale.
Tout support solide permettant de mettre en œuvre la présente invention est utilisable. Il peut s’agir, par exemple, d’un support de biopuce tel que ceux classiquement utilisés en silicium, en verre, en métal, en polymère ou en plastique. Ce support solide peut également consister en des particules et notamment des particules de silice, des particules polymériques et/ou des particules magnétisables.
La fonctionnalisation de la zone active de la surface du support solide par une sonde telle que précédemment définie peut être effectuée par toute technique adaptée permettant la fixation d’un composé sur un support solide. On peut en particulier envisager une simple adsorption, des liaisons ioniques, des liaisons hydrogène, des interactions électrostatiques, des interactions hydrophobes, des liaisons de Van der Waals ou un greffage covalent.
Dans une forme de mise en œuvre particulière de la présente invention, la surface du support solide présente des groupements fonctionnels grâce auxquels la ou les sondes sont capables de s’immobiliser. De façon avantageuse, ces groupements fonctionnels sont choisis parmi les groupements carboxyliques, des entités radicalaires, les fonctions alcools, amines, amides, époxy ou thiols. Ces groupements sont portés, de façon intrinsèque ou par fonctionnalisation, par la zone active de la surface du support solide. La (ou les) sonde(s) peuvent également présenter de tels groupements fonctionnels, de façon intrinsèque ou par fonctionnalisation.
Dans une première variante de la présente invention, la ou les sondes peuvent être immobilisées de façon directe au niveau de la surface fonctionnalisée ou non. Un support solide « coaté » avec une protéine telle que la streptavidine est un exemple d’immobilisation directe, dans lequel la sonde doit être fonctionnalisée par une biotine.
Dans une seconde variante de la présente invention, la ou les sondes peuvent être immobilisées de façon indirecte au niveau de la surface fonctionnalisée ou non. Cette immobilisation indirecte fait intervenir un bras espaceur (ou agent de jonction) lié, d’une part, à la surface et, d’autre part, à une sonde. Un tel bras espaceur est notamment utilisé pour améliorer l’accessibilité à la sonde. A titre d’exemples illustratifs, on peut citer les réactifs silanes mis en œuvre pour le greffage de sondes sur du verre, la complexation de produits thiolés sur des surfaces d'or et l'immobilisation de sondes dans des matrices polymères. De plus, lorsque la ou les sondes sont une ou des molécules nucléotidiques telles que précédemment définies, un tel bras espaceur peut se présenter sous forme d’une séquence comprenant plusieurs bases thymine et notamment 10 bases thymine.
Les liaisons mises en œuvre au cours d’une immobilisation directe ou indirecte peuvent être toutes liaisons connues de l’homme du métier et notamment des liaisons covalentes, des liaisons ioniques, des liaisons hydrogène, des interactions électrostatiques, des interactions hydrophobes, des liaisons de Van der Waals ou une adsorption.
Avantageusement, une étape de blocage de la surface peut être mise en œuvre préalablement à la fixation de la sonde et/ou suite à cette fixation. La solution de blocage mise en œuvre lors de cette étape de blocage peut comporter un ou plusieurs des composants suivants : albumine comme de la BSA (pour « Bovine Serum Albumin »), ADN génomique comme de l’ADN simple brin et notamment de l’ADN simple brin de sperme de saumon, gélatine, caséine, protéines de lait, sérum, polyéthylène glycol et polymères du type polyvinylpyrrolidone. Un exemple particulier de solution de blocage est une solution contenant de 1% à 5% de BSA et éventuellement 20 µg/mL d’ADN simple brin de sperme de saumon.
L’étape i) ou i’) du procédé selon l’invention consiste à mettre en contact l’échantillon liquide tel que précédemment défini avec la surface d’un support solide fonctionnalisée par une ou plusieurs sondes aptes à lier l’analyte à détecter moyennant quoi, si l’échantillon liquide contient cet analyte, ce dernier est capturé au niveau de la ou des sondes.
Typiquement, l’étape i) ou i’) de mise en contact peut durer entre 1 min et 24 h, entre 2 min et 12 h, entre 5 min et 6 h, entre 10 min et 3 h, entre 15 min et 2 h, entre 20 min et 1 h et, notamment, de l’ordre de 30 min (i.e. 30 min ± 5 min). Par ailleurs, l’étape i) de mise en contact peut être réalisée à une température comprise entre 4°C et 70°C, notamment entre 10°C et 60°C, en particulier entre 15 et 45°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) ou à température physiologique (i.e. 37°C ± 5°C).
Suite à l’étape i) ou i’) et préalablement à l’étape ii) ou ii1’) du procédé selon la présente invention, il est possible d’éliminer les éléments présents dans l’échantillon liquide et qui n’ont pas été capturés par la ou les sondes. Toute technique permettant une telle élimination est utilisable dans le cadre de la présente invention. A titre d’exemple, on peut citer le lavage de la surface du support solide ou la séparation de l’échantillon liquide et du support solide comme une séparation physique ou magnétique. Toutefois, cette étape d’élimination est optionnelle puisque ces éléments pourront être éliminés par la suite et notamment lors de l’une quelconque des étapes iii), ii2’) ou iii’).
Lorsque cette étape d’élimination est mise en œuvre, la surface du support solide peut être soumise à au moins un rinçage de façon à éliminer toute trace de l’échantillon liquide. Ce rinçage est typiquement effectué avec une solution aqueuse de rinçage conservant l’interaction sonde/analyte ou liant irréversiblement l’analyte et la sonde. Cette solution peut également permettre d’éliminer les interactions non spécifiques. Elle peut comporter un ou plusieurs des composants suivants : un tampon comme un tampon Tris, phosphate, acétate ou borate ; des sels comme KCl, NaCl, (NH4)2SO4, MgCl2ou CaCl2; des détergents ou agents tensioactifs comme Tween®, Triton® ou dodécylsulfate de sodium (ou SDS) ; des agents dénaturants comme formamide ou diméthylsulfoxyde ; un solvant organique comme éthanol, méthanol ou acétonitrile ; et des agents pontants comme formaldéhyde ou glutaraldéhyde. Ce rinçage peut être répété deux fois, trois fois, cinq fois, 10 fois et voire 50 fois en utilisant, à chaque rinçage, une solution de rinçage identique ou différente. Typiquement, le rinçage est répété trois fois avec une solution comprenant (i) du tampon phosphate salin (ou PBS) et 0,1% de Tween® comme du Tween®20, (ii) du PBS, 0,3% de Tween® comme du Tween®20 et 1 M de NaCl ou (iii) une solution saline contenant 0,02 M de PBS, 1,074 M de NaCl et 0,3% de Tween® comme du Tween®20.
De plus, lorsque cette étape optionnelle d’élimination est mise en œuvre, elle est réalisée à une température comprise entre 4°C et 100°C, notamment entre 10°C et 60°C, en particulier entre 15°C et 45°C et, plus particulièrement, à température ambiante ou à température physiologique.
L’étape ii) du procédé selon la présente invention consiste à mettre en contact la surface du support solide sur laquelle un analyte à détecter est éventuellement retenu via la ou les sondes fonctionnalisant cette surface avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire, capable de se lier audit analyte ou au moins un complexe de liaison tel que précédemment défini, moyennant quoi, si cet analyte est présent à la surface du support solide, l’oligonucléotide ou le complexe de liaison se lie à ce dernier respectivement via son entité de reconnaissance ou sa portion P2. En d’autres termes, l’oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison est capable de former avec l’analyte à détecter une paire de liaison, l’oligonucléotide ou le complexe de liaison et l’analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison oligonucléotide-analyte ou dans la liaison complexe-analyte sont avantageusement des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals et/ou des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes.
L’oligonucléotide selon l’invention a été synthétisé préalablement à la mise en contact de l’étape ii) ou ii3’). En d’autres termes, cette synthèse n’est effectuée ni en présence de la surface du support solide fonctionnalisée par la ou les sondes telles que précédemment définies, ni en présence de l’analyte à détecter. Avantageusement, cette synthèse est une synthèse chimique classiquement utilisée pour préparer des oligonucléotides.
Lors de l’étape ii) du procédé selon la présente invention, la surface du support solide sur laquelle est éventuellement maintenu au moins un analyte au moyen d’une sonde est mise en contact avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire tel que précédemment défini ou un complexe de liaison tel que précédemment défini. Cette solution est avantageusement une solution aqueuse permettant l’interaction haltère ou complexe/analyte. Elle peut comporter un ou plusieurs des composants suivants : un tampon comme un tampon Tris, phosphate, acétate ou borate ; des sels comme KCl, NaCl, (NH4)2SO4, MgCl2ou CaCl2; des détergents ou agents tensioactifs comme Tween®, Triton® ou dodécylsulfate de sodium (ou SDS) ; des agents dénaturants comme formamide ou diméthylsulfoxyde ; un solvant organique comme éthanol, méthanol ou acétonitrile ; et des agents pontants comme formaldéhyde ou glutaraldéhyde. Avantageusement, lorsque l’oligonucléotide comprend une séquence aptamère pour la reconnaissance de l’analyte, la solution utilisée sera composée des éléments en totalité ou en partie constituant le tampon de sélection de l’aptamère. La solution utilisée lors de l’étape ii) peut, en outre, comprendre un ou plusieurs éléments choisis parmi un ADN génomique comme de l’ADN simple brin et notamment de l’ADN simple brin de sperme de saumon, du sérum, de l’albumine, un polymère de synthèse, un agent bloquant comme l’agent bloquant Denhardt et tout autre élément permettant de limiter l’adsorption non spécifique. Un exemple particulier de solution mise en œuvre lors de l’étape ii) est une solution saline contenant 0,02 M de PBS, 1,074 M de NaCl, 0,3% de détergent Tween20, 20 µg/mL d’ADN de sperme de saumon ainsi que 4% d’agent bloquant Denhardt.
Par ailleurs, l’oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison est présent dans cette solution en une quantité comprise entre 1 aM et 1 mM, et notamment entre 100 aM et 1 µM. A titre d’exemples particuliers de concentrations utilisables, on peut citer une concentration de 10 pM, de 100 pM, de 1 nM, ou de 10 nM. Avantageusement, l’oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison est présent dans la solution mise en œuvre lors de l’étape ii) à une concentration de 100 pM.
Typiquement, l’étape ii) de mise en contact peut durer entre 1 min et 24 h, notamment entre 2 min et 12 h et, en particulier, entre 5 min et 6 h. Dans une forme de mise en œuvre particulière, cette mise en contact peut durer entre 10 min et 3 h, entre 15 min et 2 h, entre 20 min et 1 h et, notamment, de l’ordre de 30 min (i.e. 30 min ± 5 min). Dans une autre forme de mise en œuvre, cette mise en œuvre peut durer entre 30 min et 6 h, entre 1 h et 5 h, entre 2 h et 4 h et, notamment, de l’ordre de 3 h (i.e. 3 h ± 15 min). De même, l’étape (ii) de mise en contact peut être réalisée à une température comprise entre 4°C et 100°C, notamment entre 10°C et 60°C, en particulier entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) ou à température physiologique (i.e. 37°C ± 5°C).
Préalablement à cette mise en contact, il est possible de chauffer l’oligonucléotide selon l’invention à une température supérieure à 80°C et notamment de l’ordre de 90°C (i.e. 90°C ± 5°C) pendant 5 min puis de le refroidir jusqu’à la température ambiante en environ 35 min (35 min ± 10 min). Cette étape préalable permet, notamment lorsque l’entité de reconnaissance est un aptamère, de donner à ce dernier une conformation optimale pour la détection de l’analyte.
Tout ce qui a été décrit ci-dessus pour l’étape ii) (nature de la solution, durée et température) s’applique aux étapes ii1’) et ii3’). De plus, la molécule comprenant une première portion P1 et une seconde portion P2 telle que précédemment définie et l’oligonucléotide linéaire est présent(e) dans la solution lors de la mise en contact respectivement à l’étape ii1’) et à l’étape ii3’) en une quantité comprise entre 1 aM et 1 mM, et notamment entre 100 aM et 1 µM. A titre d’exemples particuliers de concentrations utilisables, on peut citer une concentration de 10 pM, de 100 pM, de 1 nM, ou de 10 nM.
Suite à l’étape ii) ou ii3’) et préalablement à l’amplification LAMP ou suite à l’étape ii1’) et préalablement à l’étape ii3’), il est nécessaire d’éliminer tous les éléments susceptibles de donner de faux positifs, comme, par exemple, des oligonucléotides linéaires ou des molécules à portions P1 et P2 ou des complexes de liaison non spécifiquement liés à l’analyte à détecter ou liés à des éléments non liés aux sondes fonctionnalisant la surface du support solide. Il s’agit là de l’étape ii2’), iii) ou iii’) du procédé selon la présente invention.
Toute technique permettant une telle élimination est utilisable dans le cadre de la présente invention. A titre d’exemple, on peut citer le lavage de la surface du support solide ou la séparation de la solution contenant des oligonucléotides linéaires ou des molécules à portions P1 et P2 ou des complexes de liaison, du support solide comme une séparation physique ou magnétique.
Lorsque cette étape d’élimination est mise en œuvre, la surface du support solide peut être soumise à au moins un rinçage qui est typiquement effectué avec une solution de rinçage constituée d’une solution aqueuse :
- conservant l’interaction analyte/oligonucléotide ou liant irréversiblement l’analyte et l’oligonucléotide (cas de l’étape iii)) ;
- conservant l’interaction analyte/complexe de liaison ou liant irréversiblement l’analyte et le complexe de liaison (cas de l’étape iii) et de l’étape iii’)) ou
- conservant l’interaction analyte/molécule à portions P1 et P2 ou liant irréversiblement l’analyte et la molécule à portions P1 et P2 (cas de l’étape ii2’)).
- conservant l’interaction analyte/oligonucléotide ou liant irréversiblement l’analyte et l’oligonucléotide (cas de l’étape iii)) ;
- conservant l’interaction analyte/complexe de liaison ou liant irréversiblement l’analyte et le complexe de liaison (cas de l’étape iii) et de l’étape iii’)) ou
- conservant l’interaction analyte/molécule à portions P1 et P2 ou liant irréversiblement l’analyte et la molécule à portions P1 et P2 (cas de l’étape ii2’)).
Cette solution de rinçage peut également permettre d’éliminer les interactions non spécifiques. Elle peut comporter un ou plusieurs des composants suivants : un tampon comme un tampon Tris, phosphate, acétate ou borate ; des sels comme KCl, NaCl, (NH4)2SO4, MgCl2ou CaCl2; des détergents ou agents tensioactifs comme Tween®, Triton® ou dodécylsulfate de sodium (ou SDS) ; des agents dénaturants comme formamide ou diméthylsulfoxyde ; un solvant organique comme éthanol, méthanol ou acétonitrile ; et des agents pontants comme formaldéhyde ou glutaraldéhyde et un ou plusieurs élément(s) choisi(s) parmi un ADN génomique comme de l’ADN simple brin et notamment de l’ADN simple brin de sperme de saumon, du sérum, de l’albumine et un polymère de synthèse. Ce rinçage peut être répété deux fois, trois fois, cinq fois, 10 fois et voire 50 fois en utilisant, à chaque rinçage, une solution de rinçage identique ou différente. Typiquement, le rinçage est répété trois fois avec une solution comprenant du PBS et 0,1% de Tween®. En variante, le rinçage est répété trois fois avec une solution saline contenant 0,02 M de PBS, 1,074 M de NaCl et 0,3% de détergent Tween®20.
De plus, l’étape ii2’), iii) ou iii’) est réalisée à une température comprise entre 4°C et 100°C, notamment entre 15°C et 80°C, en particulier entre 30°C et 60°C et, plus particulièrement, à température de l’ordre de 40°C (i.e. 40°C ± 5°C) ou à température physiologique.
L’étape iv) ou iv’) du procédé selon l’invention est l’amplification LAMP à deux amorces à proprement parler. Les deux seules amorces mises en œuvre sont les amorces FIP et BIP telles que précédemment définies à savoir les amorces de séquences respectives 5’-F1c-F2-3’ et 5’-B1c-B2-3’.
La température de fusion (Tm) de B2-B2c est notamment supérieure à la température utilisée lors de l’amplification. La Tm de B2-B2c est supérieure à la température utilisée lors de l’amplification avantageusement d’au moins 5°C, notamment d’au moins 7°C et, en particulier, d’au moins 10°C. L’homme du métier pourra trouver des informations additionnelles quant à ces portions dans[1].
La température de fusion (Tm) de F2-F2c est notamment supérieure à la température utilisée lors de l’amplification. La Tm de B2-B2c est supérieure à la température utilisée lors de l’amplification avantageusement d’au moins 5°C, notamment d’au moins 7°C et, en particulier, d’au moins 10°C. L’homme du métier pourra trouver des informations additionnelles quant à ces portions dans[1].
Il convient de noter que, dans l’étape iv) ou iv’) du procédé selon la présente invention, l’analyte n’est pas utilisé comme une amorce de l’amplification LAMP.
Dans un mode de réalisation, l’étape iv) ou iv’) du procédé selon la présente invention consiste à mettre en contact la surface sur laquelle est/sont immobilisée(s) une ou des sonde(s) spécifique(s) du ou des analytes à détecter avec un mélange réactionnel comprenant les amorces FIP et BIP et tout élément nécessaire à la production d’un produit d’amplification si l’oligonucléotide linéaire est présent.
Dans un autre mode de réalisation particulier, il est possible de mettre en œuvre l’étape iv) ou iv’) après avoir remis en suspension l’oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison tel que précédemment défini. Dans ce mode de réalisation, il convient de soumettre, le support solide auquel l’oligonucléotide linéaire est indirectement lié via l’analyte d’intérêt et éventuellement une molécule à portions P1 et P2, à un traitement comme un traitement thermique ou chimique et ce, de façon à séparer les partenaires de liaison que sont (i) l’oligonucléotide linéaire et l’analyte d’intérêt, (ii) l’oligonucléotide linéaire et la molécule à portions P1 et P2, et/ou (iii) la molécule à portions P1 et P2 et l’analyte d’intérêt. Sans effort inventif, l’homme du métier saura déterminer le traitement le mieux adapté en fonction des partenaires de liaison mis en œuvre. Ce mode de réalisation particulier permet, une fois l’oligonucléotide ou le complexe de liaison remis en suspension, d’éliminer la surface sur laquelle l’analyte a été fixé avant de réaliser la LAMP avec le seul surnageant.
Typiquement, le mélange réactionnel mis en œuvre lors de l’étape iv) ou iv’) comprend un tampon approprié, comme, par exemple, un tampon phosphate ou un tampon Tris ; des désoxyribonucléosides (dNTP), comme, un mélange équimolaire de dATP, dCTP, dGTP et dTTP et une enzyme catalysant l’amplification LAMP. Une telle enzyme est une polymérase présentant une activité de déplacement de brin élevée en plus d’une activité de réplication. A titre d’exemples particuliers de telles enzymes, on peut utiliser l’une des enzymes listées ci-dessous :
- Bst DNA polymerase et ses variantes telles que, par exemple, Bst2.0 DNA polymerase et Bst3.0 DNA polymerase,
- Bsm DNA polymerase,
- Bca (exo-) DNA polymerase,
- Klenow fragment of DNA polymerase I,
- Vent DNA polymerase,
- Vent(Exo-) DNA polymerase (exonuclease activity-free Vent DNA polymerase),
- DeepVent DNA polymerase,
- DeepVent(Exo-) DNA polymerase (DeepVent DNA polymerase sans activité exonucléase),
- 29 phage DNA polymerase,
- MS-2 phage DNA polymerase,
- Z-Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), et
- KOD DNA polymerase (TOYOBO).
- Bsm DNA polymerase,
- Bca (exo-) DNA polymerase,
- Klenow fragment of DNA polymerase I,
- Vent DNA polymerase,
- Vent(Exo-) DNA polymerase (exonuclease activity-free Vent DNA polymerase),
- DeepVent DNA polymerase,
- DeepVent(Exo-) DNA polymerase (DeepVent DNA polymerase sans activité exonucléase),
- 29 phage DNA polymerase,
- MS-2 phage DNA polymerase,
- Z-Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), et
- KOD DNA polymerase (TOYOBO).
Le milieu réactionnel peut comprendre, en outre, des sels comme des sels de magnésium, des sels de manganèse et/ou sels d’ammonium ; des détergents, de la bétaïne et/ou des éléments utiles pour la détection et la quantification du produit d’amplification de l’oligonucléotide linéaire comme, par exemple, de la calcéine, un colorant intercalant comme, par exemple, iodure de propidium, SYTO 9, le vert SYBR et l’EvaGreen.
L’étape iv) ou iv’) du procédé selon la présente invention est mise en œuvre pendant une période de temps et à une température suffisantes pour la production d’un produit d’amplification si l’oligonucléotide linéaire est présent. Avantageusement, cette étape est effectuée dans des conditions isothermes et notamment à une température comprise entre 15°C et 90°C, en particulier, comprise entre 50°C et 80°C et, plus particulièrement de l’ordre de 65°C (i.e. 65°C ± 5°C). La durée de l’étape iv) ou iv’) du procédé selon la présente invention est comprise entre 1 min et 120 min, notamment entre 5 min et 90 min et, en particulier, entre 10 min et 60 min.
L’étape v) ou v’) consiste à détecter et éventuellement à quantifier le produit d’amplification de l’oligonucléotide linéaire et donc à détecter et éventuellement à quantifier l’analyte auquel l’oligonucléotide linéaire est ou a été lié puisque l’accumulation du produit d’amplification est un indicateur de la présence de cet analyte immobilisé à la surface du support solide.
L’étape v) ou v’) peut être réalisée simultanément à l’étape iv) ou iv’) ou après cette dernière. L’homme du métier connaît différentes techniques pour réaliser cette détection. Cette dernière peut notamment être l’une quelconque des techniques décrites dans Bechereret al, 2020[7 ].
Le produit d’amplification peut être détecté, lors de l’étape v) ou v’) par mesure de la turbidité causée par le pyrophosphate de magnésium précipité en solution comme sous-produit de l’amplification. Cette mesure peut être réalisée à l’œil nu ou via un turbidimètre ou par imagerie sans lentille[ 8 ].
Le produit d’amplification peut être détecté, lors de l’étape v) ou v’), par une sonde pH permettant de suivre l’acidification du mélange réactionnel lors de l’amplification LAMP.
Le produit d’amplification peut être détecté, lors de l’étape v) ou v’), via une électrophorèse sur gel.
Le produit d’amplification peut être détecté, lors de l’étape v) ou v’), par détection de cristaux en plan par imagerie sans lentille comme décrit dans[ 8 ].
Le produit d’amplification peut également être détecté, lors de l’étape v) ou v’), par un test colorimétrique ou par mesure de fluorescence notamment lorsque la calcéine ou un colorant intercalant fluorescent est présent dans le mélange réactionnel.
Lorsque l’on souhaite réaliser une quantification d’au moins un analyte lors de l’étape v) ou v’) du procédé selon la présente invention, cette quantification est réalisée par une comparaison avec une gamme étalon d’analyte à des concentrations connues. Cette quantification est une étape classique de la méthode ELISA. Cette quantification peut également mettre en œuvre des quantités connues d’analyte à détecter, ajoutées à l’échantillon liquide comme précédemment envisagé (échantillon liquide dopé).
D’autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l’homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
I.
Amplification de
l’oligonucléotid
e selon l’invention
par LAMP à deux amorces
.
Pour prouver la fonctionnalité de la LAMP à deux amorces, plusieurs séquences sont utilisées :
- un oligonucléotide linéaire selon l’invention désigné M1 avec une entité de reconnaissance E1 de 40 bases constituée d’un aptamère anti-thrombine appelé « Thr1 »[ 9 ],
- un oligonucléotide linéaire selon l’invention désigné M2 avec une entité de reconnaissance E2 de 24 bases constituée d’une séquence oligonucléotidique « Zip6 », et
- un haltère à double structure tige-boucle comme présenté dans[ 5, 6 ]et utilisé ici comme référence. Cet haltère est dit « minimal » car il ne contient aucune entité de reconnaissance.
- un oligonucléotide linéaire selon l’invention désigné M1 avec une entité de reconnaissance E1 de 40 bases constituée d’un aptamère anti-thrombine appelé « Thr1 »[ 9 ],
- un oligonucléotide linéaire selon l’invention désigné M2 avec une entité de reconnaissance E2 de 24 bases constituée d’une séquence oligonucléotidique « Zip6 », et
- un haltère à double structure tige-boucle comme présenté dans[ 5, 6 ]et utilisé ici comme référence. Cet haltère est dit « minimal » car il ne contient aucune entité de reconnaissance.
Les séquences des deux oligonucléotides M1 et M2, de l’haltère minimal M3 et des amorces FIP et BIP mis en œuvre durant l’amplification LAMP sont données dans le Tableau 1 ci-après.
Plusieurs solutions des oligonucléotides M1 et M2 et de l’haltère M3 à des concentrations différentes ont été amplifiées selon le protocole d’amplification LAMP à deux amorces.
Ce protocole consiste à ajouter 2 µL de solution d’oligonucléotide ou d’haltère diluée dans un tampon contenant du PBS et du MgCl2(pH = 7,3) avec 18 µL de mix réactionnel comprenant :
- une enzyme catalysant l’amplification, Bst DNA Polymerase par exemple, avec son tampon d’amplification associé, comme « isothermal amplification buffer (NEB) » par exemple,
- des désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP),
- des sels de magnésium tels que MgCl2,
- un colorant intercalant tel que l’EvaGreen,
- de la bétaïne et
- les amorces FIP et BIP telles que définies ci-après.
- une enzyme catalysant l’amplification, Bst DNA Polymerase par exemple, avec son tampon d’amplification associé, comme « isothermal amplification buffer (NEB) » par exemple,
- des désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP),
- des sels de magnésium tels que MgCl2,
- un colorant intercalant tel que l’EvaGreen,
- de la bétaïne et
- les amorces FIP et BIP telles que définies ci-après.
La gamme de calibration comparant les 3 séquences est présentée . Celle-ci représente les valeurs de cycles seuils dits « Ct » en fonction du logarithme de la concentration de la matrice d’ADN. La valeur de Ct est définie par le temps à partir duquel la valeur de fluorescence est supérieure à une valeur de fluorescence seuil.
La valide l’amplification par LAMP à deux amorces des oligonucléotides M1 et M2. Leur amplification est plus lente que la version en double boucle « haltère » i.e. M3, mais ils présentent l’avantage d’avoir une longueur de brin beaucoup plus courte, permettant une synthèse facile.
Ces oligonucléotides sont alors utilisés par la suite dans diverses configurations incluant une entité de reconnaissance pour des applications de détection.
II.
Utilisation d’un
oligonucléotide
selon la présente invention en détection
.
L’oligonucléotide M2 est utilisé en détection, car il inclut une partie entité de reconnaissance « Zip6 » permettant de s’hybrider sur la séquence complémentaire « Zip6c ». La séquence de « Zip6 » et celle de « Zip6c » sont respectivement 5'-GACCGGTATGCGACCTGGTATGCG-3’ (SEQ ID NO: 6 dans le listage de séquences en annexe) et 5’-CGCATACCAGGTCGCATACCGGTC-3’ (SEQ ID NO: 7 dans le listage de séquences en annexe).
Par rapport aux haltères utilisés en détection dans[ 5, 6], l’oligonucléotide M2 a l’avantage d’être court et générique car pouvant s’hybrider sur tout type de sondes.
II.1.Gamme de quantification d’oligonucléotides sur billes (direct).
La détection de brins d’ADN immobilisés sur billes magnétiques a été réalisée et a permis de montrer que l’oligonucléotide selon l’invention permet de détecter un simple brin d’ADN lorsque celui-ci est complémentaire de la séquence placée à l’extrémité 5’.
Une gamme de différentes concentrations d’oligonucléotide M2 mélangées avec des billes sur lesquelles sont greffées le brin d’ADN complémentaire à l’entité de reconnaissance « Zip6 » via un bras de liaison de 10 bases thymine « 10T-Zip6c », est réalisée. La solution contenant les billes et la matrice est amplifiée, après avoir effectué 3 lavages permettant d’éliminer les oligonucléotides ne s’étant pas accrochés à la cible. Le principe du protocole de détection est représenté .
Le protocole de détection est alors le suivant :
- incubation du brin d’ADN biotinylé « 10T-Zip6c » avec les billes magnétiques streptavidine à 25°C pendant 10 min puis 3 rinçages à l’aide d’un aimant et d’un tampon de rinçage
- incubation du brin d’ADN biotinylé « 10T-Zip6c » avec les billes magnétiques streptavidine à 25°C pendant 10 min puis 3 rinçages à l’aide d’un aimant et d’un tampon de rinçage
- blocage des billes magnétiques pendant 30 min à l’aide d’une solution de 1% de BSA
- incubation de différentes concentrations d’oligonucléotide M2 (1 nM – 100 pM) à 37°C pendant 30 min, puis 3 rinçages avec le tampon de rinçage,
- ajout de la solution LAMP contenant les 2 amorces et l’enzyme nécessaire à l’amplification
- ajout de la solution LAMP contenant les 2 amorces et l’enzyme nécessaire à l’amplification
Ce protocole permet d’obtenir une gamme d’amplification de l’oligonucléotide lorsque son extrémité 5’ s’hybride avec le brin complémentaire placé sur les billes. Les courbes d’amplification obtenues et la gamme de calibration associée sont exposées et .
II.2.Détection de protéines : ImmunoLAMP.
Un autre exemple d’utilisation d’un oligonucléotide linéaire selon l’invention consiste à l’utiliser avec des anticorps. Cela permet de combiner la spécificité de reconnaissance des anticorps avec la sensibilité donnée par l’amplification LAMP de cet oligonucléotide, afin d’aller détecter des molécules présentes en très petites quantités dans les fluides. Cette technique est équivalente aux techniques d’immunoPCR connues et utilisées depuis une vingtaine d’années, mais utilise l’amplification LAMP qui a l’avantage d’être isotherme[ 2].
Grâce à la présente invention, ce protocole est encore simplifié car l’oligonucléotide linéaire, utilisé pour la LAMP est raccourci et n’utilise que 2 amorces. Pour cela, un anticorps peut être greffé à l’oligonucléotide par liaison biotine-streptavidine, par liaison covalente à l’extrémité 5’ ou bien par l’intermédiaire d’une portion P1, ici « Zip6c » qui reconnait l’entité de reconnaissance « Zip6 » de l’oligonucléotide, l’anticorps correspondant à la portion P2, comme exposé . Ce type de configuration permet de faire un sandwich avec deux anticorps suivi d’une amplification LAMP, combinant spécificité et sensibilité de la reconnaissance.
Cette détection de protéine a été mise en place à titre d’exemple avec un anticorps 1 anti-souris et un anticorps 2 anti-CD63 produit chez la souris. Dans un premier temps, l’anticorps 2 est fonctionnalisé avec un brin oligonucléotidique « Zip6c », complémentaire à la partie « Zip6 » présente dans l’oligonucléotide linéaire selon l’invention). Une liaison covalente est alors établie entre l’anticorps 2 et le brin oligonucléotidique grâce à une réaction entre une molécule thiol fixée sur l’oligonucléotide et la molécule SM(PEG)12fixée sur l’anticorps 2. Ce complexe est alors mis en contact avec l’oligonucléotide selon l’invention, amplifiable par LAMP à 2 amorces, qui s’y lie par hybridation d’ADN, formant un complexe de reconnaissance de protéine et amplifiable par LAMP à 2 amorces.
Le protocole de détection est alors le suivant:
- incubation de l’anticorps 1 biotinylé et spécifique de l’anticorps 2 sur les billes magnétiques pendant 30 min sous agitation à 25°C, puis 3 rinçages à l’aide d’un aimant et d’une solution de PBS, 1% BSA et 0,3% de Tween 20,
- blocage des billes magnétiques pendant 30 min à l’aide d’une solution de 1% BSA,
- incubation de l’anticorps 2 spécifique de l’anticorps 1 et fonctionnalisé avec l’oligonucléotide selon l’invention, pendant 30 min, sous agitation à 25°C, puis 3 rinçages à l’aide d’un aimant et d’une solution de PBS, 1% BSA et 0,3% de Tween 20,
- ajout de la solution LAMP contenant les 2 amorces et l’enzyme nécessaire à l’amplification
- incubation de l’anticorps 1 biotinylé et spécifique de l’anticorps 2 sur les billes magnétiques pendant 30 min sous agitation à 25°C, puis 3 rinçages à l’aide d’un aimant et d’une solution de PBS, 1% BSA et 0,3% de Tween 20,
- blocage des billes magnétiques pendant 30 min à l’aide d’une solution de 1% BSA,
- incubation de l’anticorps 2 spécifique de l’anticorps 1 et fonctionnalisé avec l’oligonucléotide selon l’invention, pendant 30 min, sous agitation à 25°C, puis 3 rinçages à l’aide d’un aimant et d’une solution de PBS, 1% BSA et 0,3% de Tween 20,
- ajout de la solution LAMP contenant les 2 amorces et l’enzyme nécessaire à l’amplification
En parallèle de ce protocole de détection, des contrôles négatifs ( ) sont effectués avec des anticorps 1 non spécifiques de l’anticorps 2, de la manière suivante :
- Contrôle négatif 1 : Anticorps 1 spécifique de l’anticorps 2 et ajout de l’oligonucléotide selon l’invention, non fonctionnalisé avec l’anticorps,
- Contrôle négatif 2 : Anticorps 1bis non spécifique de l’anticorps 2,
- Contrôle négatif 3 : Pas d’anticorps 1 ajouté.
- Contrôle négatif 1 : Anticorps 1 spécifique de l’anticorps 2 et ajout de l’oligonucléotide selon l’invention, non fonctionnalisé avec l’anticorps,
- Contrôle négatif 2 : Anticorps 1bis non spécifique de l’anticorps 2,
- Contrôle négatif 3 : Pas d’anticorps 1 ajouté.
Ce protocole permet d’observer la détection de protéine par cette méthode d’ImmunoLAMP. Les résultats obtenus sont présentés .
Cette dernière montre la spécificité de la reconnaissance de protéine suivie d’une amplification LAMP. En effet, le signal de fluorescence correspondant à la détection apparait plus tôt (quelques minutes) par rapport aux contrôles négatifs. Les résultats présentés ici mettent en avant la possibilité d’implémenter des protocoles de détection par ImmunoLAMP à 2 amorces avec l’oligonucléotide linéaire selon l’invention.
[1] Brevet US 6,410,278 publié le 25 juin 2002.
[2] Pourhassan-Moghaddamet al, 2013, « Protein detection through different platforms of immuno-loop-mediated isothermal amplification », Nanoscale Research Letters, vol. 8:485, pages 1-11.
[3] Duet al, 2016, « A ligation-based loop-mediated isothermal amplification (ligation-LAMP) strategy for highly selective microRNA detection », Chem. Commun., vol. 52, pages 12721-12724.
[4] Demande de brevet CN 106148549 publiée le 23 novembre 2016.
[5] Demande de brevet EP 3878971 publiée le 15 septembre 2021.
[6] Demande de brevet FR 2109667 déposée le 15 septembre 2021.
[7] Bechereret al, 2020, « Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) – review and classification of methods for sequence-specific detection », vol. 12, pages 717-746.
[8] Demande de brevet EP 3363913 publiée le 22 août 2018.
[9] Danielet al, 2013, « Real-time monitoring of thrombin interactions with its aptamers: Insights into the sandwich complex formation », Biosens. Bioelectron., vol. 40, pages 186-192.
Claims (12)
- Oligonucléotide linéaire répondant à la formule (I) suivante :
Sa-F2-Sb-F1-Int-B1c-Sc-B2c-Sd (I)
dans laquelle
Sa représente l’extrémité 5’ de la portion F2 ou une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
la portion F2 comprend de 8 à 30 nucléotides,
Sb séparant la portion F2 et la portion F1 est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
la portion F1 comprend de 10 à 35 nucléotides,
Int séparant la portion F1 et la portion B1c est choisi dans le groupe constitué par une liaison covalente, une portion comprenant au moins un nucléotide et une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
la portion B1c comprend de 10 à 35 nucléotides,
Sc séparant la portion B1c et la portion B2c est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
la portion B2c comprend de 8 à 35 nucléotides, et
Sd représente l’extrémité 3’ de la portion B2c ou une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt,
à condition qu’au moins un parmi Sa, Sb, Int, Sc et Sd comprenne une structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt. - Oligonucléotide linéaire selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il répond à l’une quelconque des formules (II), (III), (IV), (V) et (VI) suivantes :
Sa’-F2-F1-Int’-B1c-B2c (II)
F2-Sb’-F1-Int’-B1c-B2c (III)
F2-F1-Int’’-B1c-B2c (IV)
F2-F1-Int’-B1c-Sc’-B2c (V) et
F2-F1-Int’-B1c-B2c-Sd’ (VI)
dans lesquelles
les portions F2, F1, B1c et B2c sont telles que définies à la revendication 1,
Int’ séparant la portion F1 et la portion B1c est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins un nucléotide, et
Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ et Sd’ représentent une structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d’intérêt. - Oligonucléotide linéaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que - ladite portion F2 comprend de 10 à 27 nucléotides,
- ladite portion F1 comprend de 15 à 25 nucléotides,
- ladite portion B1c comprend de 17 à 27 nucléotides, et/ou
- ladite portion B2c comprend de 15 à 30 nucléotides. - Oligonucléotide linéaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ comprend, en plus d’une entité, au moins un autre élément permettant de lier l’entité E à l’extrémité 5’ de la portion F2, à l’extrémité 3’ de la portion F2, à l’extrémité 3’ de la portion F1, à l’extrémité 5’ de la portion F1, à l’extrémité 5’ de la portion B1c, à l’extrémité 3’ de la portion B1c, à l’extrémité 5’ de la portion B2c et/ou à l’extrémité 3’ de la portion B2c.
- Oligonucléotide linéaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite au moins une entité E présente au niveau de ladite structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ est apte à se lier directement à au moins un analyte d’intérêt.
- Oligonucléotide linéaire selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite au moins une entité E est choisie dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide tel qu’un peptide antimicrobien ou un MIP i.e. un peptide associé au CMH-1 (pour « Complexe Majeur d’Histocompatibilté-1 ») ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d’un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d’anticorps tel qu’un fragment Fab, F(ab’)2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Region ») ; une molécule nucléotidique ; et un aptamère.
- Oligonucléotide linéaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite au moins une entité E présente au niveau de ladite structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa’, Sb’, Int’’, Sc’ ou Sd’ est apte à se lier indirectement à au moins un analyte d’intérêt.
- Complexe non-covalent, formé par un oligonucléotide linéaire selon la revendication 7 et une molécule comprenant une première portion P1 apte à se lier à ladite au moins une entité E dudit oligonucléotide et une seconde portion P2 apte à se lier à au moins un analyte d’intérêt.
- Utilisation d’un oligonucléotide linéaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 ou d’un complexe non covalent selon la revendication 8 pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide.
- Procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes :
i) mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d’un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ;
ii) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant soit au moins un oligonucléotide linéaire selon la revendication 5 ou 6, soit un complexe selon la revendication 8, ledit oligonucléotide et ledit complexe ayant été préparés préalablement à ladite mise en contact ;
iii) éliminer l’excès d’oligonucléotides ou l’excès de complexes de liaison n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii) ;
iv) mettre en contact, avec deux amorces d’amplification isotherme médiée par des boucles dans des conditions permettant l’amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l’oligonucléotide linéaire selon l’une quelconque des revendications 5 à 7 ou le complexe de liaison selon la revendication 8, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ;
v) détecter et éventuellement quantifier le produit de l’amplification dudit oligonucléotide. - Procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes :
i') mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d’un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ;
ii1’) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins une molécule comprenant une première portion P1 apte à se lier à l’entité E présente dans la structure de l’oligonucléotide selon la revendication 7 et une seconde portion P2 apte à se lier audit au moins un analyte d’intérêt ;
ii2’) éliminer l’excès de molécules n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii1’) ;
ii3’) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire selon la revendication 7, ledit oligonucléotide ayant été synthétisé préalablement à ladite mise en contact ;
iii’) éliminer l’excès d’oligonucléotides n’ayant pas réagi lors de la mise en contact de l’étape ii3’) ;
iv’) mettre en contact avec deux amorces d’amplification isotherme médiée par des boucles dans des conditions permettant l’amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l’oligonucléotide linéaire selon l’une quelconque des revendications 5 à 7 ou le complexe de liaison selon la revendication 8, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ;
v’) détecter et éventuellement quantifier le produit de l’amplification dudit oligonucléotide. - Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que ledit produit d’amplification est détecté, lors de ladite étape v) ou v’), par mesure de la turbidité, par imagerie sans lentille, par une sonde pH, via une électrophorèse sur gel, par un test colorimétrique ou par mesure de fluorescence.
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| CN106148549A (zh) | 2016-08-31 | 2016-11-23 | 湖南大学 | 一种基于连接的环介导等温扩增技术用于基因突变检测方法 |
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- 2021-12-27 FR FR2114556A patent/FR3131315A1/fr active Pending
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- 2022-12-22 WO PCT/EP2022/087655 patent/WO2023126329A1/fr unknown
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