WO1989001978A1 - Sondes moleculaires d'adn specifique du genome male du genre bos - Google Patents
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- WO1989001978A1 WO1989001978A1 PCT/FR1988/000427 FR8800427W WO8901978A1 WO 1989001978 A1 WO1989001978 A1 WO 1989001978A1 FR 8800427 W FR8800427 W FR 8800427W WO 8901978 A1 WO8901978 A1 WO 8901978A1
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- C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
Definitions
- the present invention relates to molecular probes specific DNA useful for sex determination - or sexing - embryos or fetuses of ruminants, no ⁇ MENT of the subfamily of cattle, particularly of the genus Bos, having DNA sequences specific for the male sex, as well as flanking sequences, or primers, for the gene amplification of these probes; the present invention also encompasses the applications of said probes, preferably amplified using the above flanking sequences, and in particular their applications to the determination of the sex of embryos and fetuses of the aforementioned ruminants, and to the control of the presence of the Y chromosome in a population of spermatozoa as well as in the separation of said population into two groups respectively comprising the Y chromosome and the X chromosome, for the purpose of artificial insemination.
- RNA is mentioned in this PCT International Application (see d) above), it seems that the preferred nucleic acids are DNA and consist of the EcoRI fragment of 6.2 kbp, 4, 0 kbp or 2.2 kbp of the genome of -ES6.0.
- the process for sexing embryos or fetuses of the genus Bos consists in: - bringing the DNA of cells of the embryo or fetus into contact, under hybridization conditions, with one or more probes hybridization as defined above, each detectably marked;
- the hybridization probes are obtained by nicktranslation and the DNA of embryos or fetuses would only come from at least 4, but preferably from at least 10, embryonic cells. .
- PCT International Application 86/07095 further describes a method of isolating a DNA clone from a genomic library of males of the species concerned which consists of:
- nucleic acids used as probes are marked by radioactive atoms and it also seems preferred to jointly use two of the probes defined above.
- the applicants have, for their part, isolated a DNA molecular probe specific for the male genome of mammals, in particular of the genus Bos - which the inventors have moreover managed to synthesize -, the hybridization profile of which (determined by hybridization of said probe with male genomic DNA giganted by EcoRI) reveals the presence of a band of the order of 7 kb specific for the male genome of the genus Bos (and absent from the female genomic DNA), which probe - which has received the designation bc.1.2 - comprises 49 base pairs, the nucleotide sequence (A) is as follows:
- the Inventors have managed to identify the flanking segments of said probes, which has enabled them to amplify the latter and has the consequence of increasing ter their sensitivity, to ensure a reliability of the sex determination of embryos of the order of 100%, to reduce the time necessary for such a determination.
- the inventors have been able to establish that the segments or fragments of short male-specific DNA which they have identified and synthesized, can play the role of probes as well as flanking segments, or primers.
- the subject of the present invention is synthetic oligonucleotides which are characterized in that they consist of fragments of a molecular probe comprising a nucleotide sequence of 49 base pairs, of formula A, below: known in itself, and constituting a DNA segment specific to the male genome of ruminant mammals, in particular of the genus Bos, which fragments are themselves characterized in that they comprise at least 10 bases of said sequence A, including at least 5 consecutive bases thereof, as well as their complementary or any fragment having at least 60% homology with said oligonucleotides.
- the synthetic oligonucleotides according to the invention are characterized in that they consist of fragments of the molecular probe (A) which comprise 17 bases, including at least 5 consecutive bases of this one and in that they respond to formulas 1 to 8 below:
- the synthetic oligonucleotides according to the invention are characterized in that they consist of fragments of the molecular probe (A) which comprise 20 bases each and have the nucleotide sequences represented by formulas (9) to (11), below:
- sequences comprising at least 5 consecutive nucleotides or any fragment having at least 60% homology with said sequences.
- sequence (9) corresponds to a fragment of the 49 bp probe of formula (A) which goes from base 1 to base 20
- sequence (10) corresponds to a fragment of the probe 49 bp of formula (A) which goes from base 21 to base 40 and that the sequence (11) corresponds to a fragment of said probe which goes from base 11 to base 30.
- the inventors have, for their part, synthesized a certain number of fragments of the bovine DNA sequence and have been able to establish that these fragments, on the one hand, are male-specific, and are capable of constituting molecular probes for sexing. of embryos and on the other hand, are capable of playing the role of primers - or flanking segments - and, consequently, of amplifying the fragments of the DNA sequence which play the role of probes, in particular the molecular probe (A), which is also the case for fragments (1) to (8) and (9) to (11) each of which can just as easily act as primers - or flanking segment - of another of these fragments used as probe, that the role of probed amplified by each of said fragments.
- the molecular probe (A) which is also the case for fragments (1) to (8) and (9) to (11) each of which can just as easily act as primers - or flanking segment - of another of these fragments used as probe, that the role of probed amplified by
- said fragments of the bovine DNA sequence are characterized in that they have the nucleotide sequences represented by the formulas (12) to (29) below:
- the present invention further relates to a method for gene amplification of a DNA molecular probe specific for the male genome of mammals, especially ruminants, more particularly of the subfamily of cattle and in a genus-specific manner.
- Bos which probe has one of the nucleotide sequences of formulas (A) and (1) to (29) above, which amplification method consists in attaching to each of the ends, respectively, of said molecular probe, a flanking sequence judiciously chosen from the DNA fragments of formulas (1) to (29) as defined above, by hybridization, then to implement an enzymatic extension process using DNA polymerase, followed a process of ⁇ enaturation, and to repeat the hybridization-extension-denaturation cycle, known as the PCR cycle, a number of times sufficient to increase the quantity of the sequence constituting the starting molecular probe in a e exponential proportion compared to the number of cycles implemented.
- Bovine DNA fragments which can be used as molecular DNA probes specific for the male genome of mammals mentioned above, or as flanking segments of these probes, identified above and, where appropriate, advantageously amplified in accordance with the present invention, and duly marked with a radioisotope or with an appropriate non-radioactive substance, are used as described in French Patent Application N ° 86 02811 and / or in its Certificate of Addition N ° 86 12616, for the sexing of embryos or fetuses or for checking the presence of the Y chromosome in a sperm population, or for the separation of spermatozoa into two populations of spermatozoa carrying respectively the Y chromosome and the X chromosome with a view to their use for artificial insemination.
- the present invention also relates to a process for the preparation of monoclonal or polyclonal antibodies by immunization of rodent mammals by sperm fractions carrying the Y- or X-chromosome controlled by hybridization with a bovine DNA fragment of formula (1) to (29), or a probe of formula (A), amplified by one or more primers - or flanking segments - of formulas (1) to (29).
- the present invention further relates to specific immunological reagents recognizing antigenic determinants controlled by chromosomes X or Y, which have served to obtain said reagents and expressed on the surface of the spermatozoa, characterized in that they consist of the antibodies obtained by implementing the above process, optionally purified.
- the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows.
- oligonucleotides of 17 base pairs each, comprising at least 5 consecutive bases of the molecular probe (A), which correspond respectively to formula (1) are fragments of the 49 bp sequence which has the nucleotide composition (A) indicated above.
- Their chemical synthesis was carried out using an automatic synthesizer "APPLIED BIOSYSTEMS” according to the technique of phophoramidite in solid phase.
- 10 to 20 ⁇ M of the fragments (1) to (8) in a volume of 3 ⁇ l are added to 23 ⁇ 1 of the reaction mixture composed of: 100 mM dithiothreitol (2.5 ⁇ 1), 10 mM spermidine (2.5 ⁇ 1), buffer d incubation 500 mM Tris-HC1 pH 7.5 + 100 mM MgCl2 (2.5 ⁇ 1), 100 ⁇ Ci ( ⁇ -32p) adenosine triphosphate-ATP 3000Ci / mmole (Amersham) and 20 U T4 polynucleotide kinase (Boehringer). After incubation for 30 min at 37 ° C, the reaction is stopped with 2 ⁇ 1 400 mM EDTA and the labeled oligonucleotide is separated from ATP by column chromatography with Sephadex G-25.
- the reaction mixture composed of: 100 mM dithiothreitol (2.5 ⁇ 1), 10 mM sperm
- the filters or blots are prehybridized at 40 to 65 ° C for 1 to 4 hours with a 5xSSPE mixture containing 0.9 M - NaCl; 50 mM NaHPO 4 pH 7.4; 5 mM EDTA pH 7.4; 5 x Denhart; 0.3 mg / ml of sonicated salmon sperm DNA and hydrolysis; 0.5% sodium dodecyl sulfate.
- Hybridization is carried out in the same mixture.
- Each of the 32 P radiolabelled probes, denatured at 100 ° C. for two minutes, is added to the hybridization solution at 1 to 6 ⁇ 10 6 cpm / ml.
- Hybridization is carried out from 40 to 65 ° C for at least 1 hour.
- the filters are washed in a 2 x SSC buffer plus 0.5% SDS, once or twice at 45 ° C for 30 minutes.
- the filters are then placed in a cassette fitted with "CRONEX” intensifiers (DUPONT), placed in contact with a Kodak XAR-5 film for autoradiography for 1 to 16 hours at -70 ° C.
- DUPONT "CRONEX" intensifiers
- the reaction was 95-97% efficient at each stage, it was necessary to purify the final product (subfragments (9) to (11) - 20 mer) from the intermediate oligonucleotides.
- About 7 mg of the mixture of oligonucleotides in 60 ⁇ 1 H 2 O are separated by electrophoresis in the gel of $ 20 polyacrylamide + 8 M urea at 700 V, 38mA for 3 hours.
- the bands corresponding to the sea are identified using an aluminum sheet coated with silica gel, fluorescent at 254 nm (Merck). This part of the gel is cut, then the DNA eluted in 1.5 ml of the 0.5 M CH 3 COONH 4 + 5 mM EDTA solution with stirring at 37 ° C. for 16 hours.
- 10 to 20 ⁇ M of fragments 9 to 11 in a volume of 3 ⁇ l are added to 23 ⁇ 1 of the reaction mixture composed of: 100 mM dithiothreitol (2.5 ⁇ 1), 10 mM spermidine (2.5 ⁇ 1), incubation buffer 500 mM Tris-HC1 pH 7.5 + 100 mM MgCl2 (2.5 ⁇ 1), 100 ⁇ Ci (-32P) adenosine triphosphate-ATP 3000Ci / mole (Amersham) and 20 U T4 polynucleoide kinase (Boehringer).
- the reaction mixture composed of: 100 mM dithiothreitol (2.5 ⁇ 1), 10 mM spermidine (2.5 ⁇ 1), incubation buffer 500 mM Tris-HC1 pH 7.5 + 100 mM MgCl2 (2.5 ⁇ 1), 100 ⁇ Ci (-32P) adenosine triphosphate-ATP 3000Ci / mole
- Hybridization is carried out at 55 ° C for at least 1 hour. After hybridization, the filters are washed in a 6 x SSC buffer plus 0.1% SDS, once or twice at 65 ° C for 20 minutes. The filters are then placed in a cassette fitted with “CRONEX” intensifiers (DUPONT), placed in contact with a Kodak XAR-5 film for autoradiography for 7 to 36 hours at -70 ° C.
- DUPONT “CRONEX” intensifiers
- the biotinylation of said fragments is carried out by adding 3 ′ of biotinated dUTP or any other biotinized deoxynucleotide using the enzymeterminal transferase (Boehringer).
- 10 to 20 ⁇ M respectively of the synthesized fragments are added to 100 ⁇ l of the reaction mixture composed of: 140 mM potassium cacodylate; 30 mM Tris-HCl pH 7.6; 0.1 mM dithiothreitol; 1 mM CoC1 2 + 0.02 mM biotinylated dUTP and 1 to 2 units of terminal transferase enzyme.
- the labeled oligonucleotide is separated by column chromatography with Sephadex 25 superfine.
- the slides are incubated with 90 to 100 ⁇ 1 of hybridization liquid and covered with a plastic film (to avoid evaporation).
- the slides After denaturing for 10 min in an oven at 100 ° C, the slides are. put in a humid chamber and incubated at 55 ° C for 16 hours.
- the final composition of the hybridization liquid is:
- DAB SIGMA ref. D 8001 a diaminobenzidine solution
- the precipitate formed by the action of peroxidase on DAB is amplified by successive precipitation of gold and silver salts according to the method described by BURNS et al (Journal Clinical Pathology 1985, 35, 1085-1092): Firstly, 50 to 100 ⁇ l are deposited per slide of a 2.5 mM solution of Na chloroaurate (NaAuCl 4 BDH ref. 30125 2R) and incubated for 5 min at room temperature. After washing for 5 min in distilled water, the slides are incubated for 5 min at room temperature with 50 to 100 ⁇ l of a 0.1 M solution of Na sulphide (Na 2 S, SIGMA ref. S 2006), rinsed 5 min with distilled water and incubated 4 to 8 minutes with 100 to 300 ⁇ l of silver reagent.
- BURNS et al Journal Clinical Pathology 1985, 35, 1085-1092
- composition of the silver reagent is as follows:
- the silver reagent is prepared by successively mixing the solutions B1 - B2 - B3 - B4 with stirring. The mixture obtained is added 1: 1 to the. solution A and the reagent thus prepared is used immediately.
- the cells used are frozen bull sperm stored in liquid nitrogen. We thaw a straw, about 13,000,000 sperm living. The straws are warmed for 30 seconds at 37 ° C. then the sperm diluted in 1 ml of sterile PBS.
- a series of centrifugations is carried out with the aim of eliminating the freezing medium as much as possible.
- the suspension of the spermatozoa in PBS is first centrifuged for 10 min at 500 g, the supernatant aspirated and the spermatozoa taken up in 1 ml of 0.11 M sodium citrate. Centrifuge for 10 min at 500 g. The supernatant is aspirated, the residue is taken up in 1 ml of 0.11 M sodium citrate + 5% DMSO, and centrifuged for 10 min at 500 g. We aspirate the supernatant, we resuspend in
- the cells are either deposited on a slide (30 - 40 ⁇ l of sperm suspension per slide) and treated by in situ hybridization with one of the probes of formulas (1) to (29) biotinylated, or deposited on a filter and hybridized according to the dot-blot technique with one of the probes of formulas (1) to (29) labeled with radioactive nucleotides.
- the in vitro gene amplification process is based on successive cycles of hybridization of the probes with oligonucleotide "primers" (the “primers” are flanking segments and, specifically, in the present case, any of the fragments of formulas (1) to (29)), -extension from “primers”, using the DNA polymerase enzyme and - denaturation, for example according to a process said PCR ("Polymerase chain reaction") described by the company CETUS CORPORATION (cf. in particular MULLIS et Al., COLD SPRING HARBOR SYMPOSIA ON QUANTITATIVE BIOLOGY, Vol. II, 1986, pages 263-272).
- PCR Polymerase chain reaction
- the cells of a biopsy are placed in a microtube in a volume of 1 O ⁇ l in PBS - 35 ⁇ 1 of H2 ⁇ are added, then the tube is placed at 95 ° C for 10 minutes to lyse the cells and denature the DNA.
- 55 ⁇ l of PCR buffer 50 mM KC1, 10 mM Tris pH 8.3, 8 mM MgC1 2 , 1 ⁇ M of primer A to be fixed at one of the ends of the probe, 1 ⁇ M of primer are added to the lysate B to be fixed at the other end of the probe, 1.5 mM ATP, 1.5 mM dCTP, 1.5 mM dTTP, 1.5 mM dGTP
- the samples are then transferred to an appropriate temperature for 2 minutes so that the primers are fixed
- the strand extension is initiated by the addition of 4 units of "Taq Polymerase" (CETUS CORPORATION) and incubation at 69 ° C for 2 minutes.
- the membranes are then neutralized and then dried at 80 ° C, prehybridized and hybridized at 40 or 65 ° C depending on the primer used, in a buffer 5 x SSPE, 5 x Denhart, 0.5% SDS containing the radiolabelled probes in 5 '- terminal with / ⁇ 32 p / ATP using the polynucleotide kinase enzyme.
- the probes (49 sea or 17 sea or 20 sea) can be either radioactive. Drink marked with biotiné or another cold compound. Hybridization is carried out at 40 to 60 ° C for 1 hour. The membranes are then washed twice in
- Primer B GATCAGTGC ⁇ GGGACCG (1) the PCR cycle takes place as follows: The biopsy cells are deposited in a microtube in a volume of 10 ⁇ l in PBS with addition of 35 ⁇ l of H 2 O, as described above above ; however the tube is placed at 95 ° C for only 2 minutes and the operations continue as described above, except that the samples are transferred for 2 minutes at 55 ° C and that the incubation with "Taq Polymerase” takes place at 69 ° C for 2 minutes and the cycle is repeated 40 times.
- the probe used can be a probe chosen from the probes or fragments of formulas A and 1 to 29. It is possible, for example, with primers of formulas (7) and (1) to use a probe of formula (4):
- the prehybridization is carried out, as is the hybridization, at 65 ° C.
- the hybridization at 65 ° C.
- a very intense male signal distinct from that of females, which is very weak, from 125 picograms of DNA, the equivalent of 25 cells and directly from cells, with 50 male cells, after 30 minutes of autoradiography.
- a specifically male signal is obtained, from 125 picograms of DNA.
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Abstract
Oligonucléotides synthétiques constitués par des fragments d'une sonde moléculaire comprenant une séquence en nucléotides de 49 paires de bases, de formule (A). Application: en tant que sonde moléculaire pour la détermination des sexes d'embryons ou de foetus de mammifères ruminants ou en tant que sonde moléculaire pour le contrôle de la présence de chromosomes Y dans une population de spermatozoïdes.
Description
Sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome maie du genre BOS.
La présente invention est relative à des sondes moléculaires d'ADN spécifique utiles pour la détermination du sexe - ou sexage - d'embryons ou de foetus de ruminants, no¬ tamment de la sous-famille des bovines, et en particulier du genre Bos, présentant des séquences d'ADN spécifique du sexe mâle, ainsi qu'à des séquences flanquantes, ou amorces, pour l'amplification génique de ces sondes ; la présente invention englobe également les applications desdites sondes, de préférence amplifiées à l'aide des séquences flanquantes susdites, et notamment leurs applications à la détermination du sexe d'embryons et de foetus des ruminants susdits, et au contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes ainsi qu'à la séparation de ladite population en deux groupes comprenant respectivement le chromosome Y et le chromosome X, en vue de l'insémination artificielle.
La Demande Internationale PCT 86/07095 au nom de THE SALK INSTITUTE BIOTECHNOLOGY INDUSTRIAL ASSOCIATES, déposée le 30 Mai 1986 en revendiquant une priorité US Sériai Numbβr 739 817 du 31 Mai 1985 et publiée le 4 Décembre 1986, décrit des sondes d'acide nucléique pour le sexage prénatal de mâles du genre Bos, plus particulièrement des races Hereford et Holstein. Ces sondes qui ont pour caractéristique d'être constituées par des acides nucléiques qui hybrident de façon significative avec l'ADN total de mâles d'une des races précitées du genre 3os, sont constituées : a) soit par uh segment qui a sensiblement la même séquence que :
. le plus petit fragment PstI du plasmide PES5 (2), . ou le plus petit fragment PstI du plasmide pES8, . ou le fragment EcoRI 6,2 kpb du génome de lambda-ES6,0 ; b) soit par tout segment supérieur à une longueur de 20 pb de l'un quelconque des segments énumé
rés sous a) ; c) soit l'un ou l'autre des brins de l'un des segments énumérês sous a) et b) ; d) soit l'ARN simple ou double-brin, présentant la même séquence que l'un des segments énumérês sous a), b) et c) ci-dessus. Cependant, bien que l'ARN soit mentionné dans cette Demande Internationale PCT (voir d) ci-dessus), il semble que les acides nucléiques préférés soient de l'ADN et soient constitués par le fragment EcoRI de 6,2 kpb, 4,0 kpb ou 2,2 kpb du génome de -ES6,0.
Conformément à cette Demande Internationale, le procédé de sexage des embryons ou des foetus du genre Bos consiste à : - mettre en contact l'ADN de cellules de l'embryon ou du foetus, dans des conditions d'hybridation, avec une ou plusieurs sondes d'hybridation telles que définies plus haut, marquées chacune de façon détectable ;
- vérifier qu'il se produit une hybridation significative entre l'ADN des cellules de l'embryon ou du foetus et la ou les sonde(s) d'hybridation.
Conformément à la Demande Internationale PCT en question, les sondes d'hybridation sont obtenues par nicktranslation et l'ADN d'embryons ou de foetus ne proviendrait que d'au moins 4, mais de préférence d'au moins 10, cellules d' embryons.
La Demande Internationale PCT 86/07095 décrit en outre un procédé d'isolement d'un clone d'ADN provenant d'une banque génomique des mâles de l'espèce concernée qui consiste à :
- cribler la banque génomique par hybridation d'acide nucléique avec une préparation de sonde mâle-spécifique comprenant l'ADN mâle total et l'ADN femelle total de l'espèce, pour identifier les clones de la banque qui comprennent l'ADN qui hybride avec un fragment contenant un segment
d'ADN mâle-spécifique, ledit criblage étant réalisé sur un support solide pré-hybridé avec l'ADN femelle total de l'espèce, fragmenté au hasard pour avoir une longueur moyenne d'environ 20 à 1000 nucleotides ; - puis identifier les clones de la banque identifiés au cours du criblage, qui abritent de l'ADN qui hybride considérablement plus avec de l'ADN mâle total de l'espèce qu'avec de l'ADN femelle total de ladite espèce.
Dans la pratique, pour permettre l'hybridation détectable avec les faibles quantités d'ADN embryonnaire disponibles dans le petit nombre de cellules susceptibles d'être prélevées chez les embryons ou les foetus à sexer, il est préféré que les acides nucléiques utilisés comme sondes soient marqués par des atomes radioactifs et il semble également préféré de mettre en oeuvre conjointement deux des sondes définies plus haut.
Trois sondes mâles-spécifiques ont été obtenues, dont la première correspond au fragment RsAI de 5-6 kpb d'ADN mâle bovin, la seconde au fragment Rsal-EcoRI de 4 kpb d ' ADN mâle bovin et la troisième au fragment EcoRI de 2,2 kpb d'ADN mâle bovin, et leur séquence en nucleotides a été au moins en partie identifiée.
Toutefois, en raison même de leur longueur, il est difficilement envisageable de synthétiser de telles sondes, dont rien n'indique, au demeurant, dans ladite Demande Internationale PCT, quels sont les segments de ces séquences qui sont "spécifiquement" mâles-spécifiques et sont effectivement utiles pour le sexage des embryons, et qui n'ont manifestement pas été identifiés. les Demanderesses ont, de leur coté, isolé une sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères, notamment du genre Bos - que les Inventeurs sont d'ailleurs parvenus à synthétiser -, dont le profil d'hybridation (déterminé par hybridation de ladite sonde avec de l'ADN génomique mâle gigéré par EcoRI) fait apparaître la
la présence d'une bande de l'ordre de 7 kb spécifique du génome mâle du genre Bos (et absente de l'ADN génomique femelle) , laquelle sonde - qui a reçu la dénomination bc.1.2 - comprend 49 paires de bases dont la séquence en nucleotides (A) est la suivante :
Cette sonde est décrite et revendiquée dans une Demande de Brevet déposée en France au nom des Demanderesses en date du 28 Février 1986, sous le N° 86 02811, et ses applications sont décrites et revendiquées, d'une part, dans ladite Demande et, d'autre part, dans une Demande de Certificat d'Addition à cette Demande, qui a été déposée en France, le 9 Septembre 1986, sous le N° 86 12616.
Dans le cadre de la poursuite de leurs recherches dans le but de préciser si la spécificité de la reconnaissance du génome mâle pouvait être identifiée dans un segment de la séquence de 49 nucleotides qui constitue la sonde objet de la Demande de Brevet français N° 86 02811, les Inventeurs ont établi qu'à l'intérieur de cette séquence, des segments ou fragments de plusieurs nucleotides consécutifs présentent le profil d'hybridation défini dans leur Demande de Brevet de Février 1986 et sont spécifiques du génome mâle du genre Bos. La possibilité de pouvoir disposer d'une sonde comprenant une séquence en nucleotides de faible longueur présente un intérêt considérable, car elle permet la synthèse à volonté, à des prix de revient industriellement acceptables, d'une telle sonde qui, de ce fait, est totalement pure et ne provoque pas de bruits de fond.
De plus, les Inventeurs sont parvenus à identifier les segments flanquants desdites sondes, ce qui leur a permis d'amplifier ces dernières et a pour conséquence d'augmen
ter leur sensibilité, d'assurer une fiabilité de la détermination du sexe des embryons de l'ordre de 100 %, de réduire le temps nécessaire à une telle détermination.
En outre, les Inventeurs ont pu établir que les segments ou fragments d'ADN de faible longueur mâles-spécifiques qu'ils ont identifiés et synthétisés, peuvent jouer le rôle aussi bien de sondes que de segments flanquants, ou amorces.
La présente invention a pour objet des oligonucléotides synthétiques qui sont caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des fragments d'une sonde moléculaire comprenant une séquence en nucleotides de 49 paires de bases, de formule A, ci-après :
connue en elle-même, et constituant un segment d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères ruminants, notamment du genre Bos, lesquels fragments sont eux-mêmes caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins 10 bases de ladite séquence A, dont au moins 5 bases consécutives de celle-ci, ainsi que leurs complémentaires ou tout fragment présentant au moins 60 % d'homologie avec lesdits oligonucleotides.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les oligonucleotides synthétiques conformes à l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des fragments de la sonde moléculaire (A) qui comprennent 17 bases, dont au moins 5 bases consécutives de celle-ci et en ce qu'ils répondent aux formules 1 à 8 ci-après :
( 1 )
( 2 )
( 3 )
( 4 )
ainsi que leurs complémentaires ou tout fragment présentant au moins 60 % d'homologie avec lesdits oligonucleotides.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les oligonucleotides synthétiques conformes à l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des fragments de la sonde moléculaire (A) qui comprennent 20 bases chacun et présentent les séquences en nucleotides représentées par les formules (9) a (11), ci-après :
Il est à souligner que la séquence (9) correspond à un fragment de la sonde de 49 pb de formule (A) qui va de la base 1 à la base 20, que la séquence (10) correspond à un fragment de la sonde de 49 pb de formule (A) qui va de la base 21 à la base 40 et que la séquence (11) correspond à un fragment de ladite sonde qui va de la base 11 à la base 30.
La Demande internationale PCT n° 86/07095 au nom de THE SALK INSTITUTE BIOTECHNOLOGY INDUSTRIAL ASSOCIATES INC (en abrégé "SIBIA") déposée le 30 mai 1986 en revendi
quant la priorité d'un dépôt initial du 31 mai 1985 aux ETATS-UNIS, a décrit, comme indiqué plus haut, la séquence partielle d'ADN total (chromosomique) extrait de cellules bovines et a notamment décrit les séquences constituant respectivement le fragment Rsal de 5-6 kpb et le fragment EcoRI de 4 kpb de l'ADN mâle bovin et cette Demande a donné la séquence partielle comprenant ces deux fragments.
Les Inventeurs ont, de leur coté, synthétisé un certain nombre de fragments de la séquence d'ADN bovin et ont pu établir que ces fragments, d'une part, sont mâles-spécifiques, et sont aptes à constituer des sondes moléculaires pour le sexage d'embryons et d'autre part, sont apte s à j oue r le rôle d ' amorces -ou segments flanquants- et , par conséquent, à amplifier les fragments de la séquence d'ADN qui jouent le rôle de sondes, notamment la sonde moléculaire (A), ce qui est également le cas des fragments (1) à (8) et (9) à (11) dont chacun peut tout aussi bien jouer le rôle d'amorces -ou segment flanquant- d'un autre de ces fragments utilisé comme sonde, que le rôle de sondé amplifiée par chacun desdits fragments.
Conformément à la présente invention, lesdits fragments de la séquence d'ADN bovin sont caractérisés en ce qu'ils présentent les séquences en nucleotides représentées par les formules (12) à (29) ci-après :
La présente invention a, de plus, pour objet des réactifs immunologiques spécifiques reconnaissant des déter- minants antigeniques contrôlés par les chromosomes X ou Y, ayant servi à l'obtention desdits réactifs et exprimés à la surface des spermatozoïdes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les anticorps obtenus en mettant en oeuvre le procédé précité, éventuellement purifiés. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exem- pies de mise en oeuvre de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1
SYNTHESE ET PURIFICATION DES OLIGONUCLEOTIDES DE SYNTHESE DE FORMULES (1) A (8 ) CONFORMES A L'INVENTION
Ces huit oligonucleotides de 17 paires de bases chacun, comprenant au moins 5 bases consécutives de la sonde moléculaire (A), qui répondent respectivement aux formule (1)
sont des fragments de la séquence de 49 pb qui présente la composition en nucleotides (A) indiquée plus haut. Leurs synthèse chimique a été réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatique "APPLIED BIOSYSTEMS" selon la technique de phophoramidite en phase solide.
La réaction étant efficace à 95-97 % à chaque stade, il a été nécessaire de purifier le produit final (sous- fragments (1) à (8)) des oligonucleotides intermédiaires. Environ 7 mg du mélange d'oligonucleotides dans 60 μ1 H2O sont séparés par électrophorèse dans urt gel de 20 % polyacrylamide + 8 M urée à 700 V, 38 mA pendant 3 heures. Les bandes correspondant au 17 mer sont repérées à l'aide d'une feuille d'aluminium recouverte de gel de silice, fluorescente à 254 nm (Merck).
Cette partie du gel est découpée, puis l'ADN élue dans 1,5 ml de la solution 0,5 M CH3COONH4 + 5 mM EDTA sous agitation à 37°C pendant 16 heures. Le surnageant est concentré à environ 300 μ1 et l'urée est éliminée par chromatographie sur une colonne
10 cm x 1 cm de Sephadex G-50 (Pharmacia) équilibré avec le tampon 10 mM Tris-HCl pH 7,5 + 1 mM EDTA. L'ADN ainsi isolé est lyophilisé et conservé à -20°C.
MARQUAGE RADIOACTIF (32P) DES FRAGMENTS (1) A (8) DE SYNTHESE (Monobrin)
10 à 20 pM des fragments (1) à (8) dans un volume de 3μ1 sont ajoutés à 23μ1 du mélange réactionnel composé de : 100 mM dithiothréitol (2,5 μ1), 10 mM spermidine (2,5 μ1), tampon d'incubation 500 mM Tris-HC1 pH 7,5 + 100 mM MgCl2 (2,5 μ1), 100 μCi (γ-32p) adénosine triphosphate-ATP 3000Ci/ mmole (Amersham) et 20 U T4 polynucléotide kinase (Boehringer). Après Incubation de 30 mn à 37°C, la réaction est arrêtée avec 2μ1 400 mM EDTA et l' oligonuclêotide marqué est séparé de l'ATP par chromatographie sur colonne avec Sephadex G-25.
PREHYBRIDATION ET HYBRIDATION
Les filtres ou blots sont préhybridés de 40 à 65°C pendant 1 à 4 heures avec un mélange 5xSSPE contenant 0,9 M - NaCl ; 50 mM NaHPO4 pH 7,4 ; 5 mM EDTA pH 7,4 ; 5 x Denhart ; 0,3 mg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et hydrolyse ; 0,5 % dodecyl sulfate de sodium. L'hybridation est réalisée dans le même mélange. Chacune des sondes radiomarquées au 32P,dénaturées à 100°C pendant deux minutes, est ajoutée dans la solution d'hybridation à 1 à 6x106cpm/ml. L'hybridation est réalisée de 40 à 65° C pendant au moins 1 heure. Après l'hybridation, les filtres sont lavés dans un tampon 2 x SSC plus 0,5 % SDS, une à deux fois à 45°C pendant 30 minutes. Les filtres sont ensuite placés dans une cassette équipée d' intensificateurs "CRONEX" (DUPONT), mise en contact avec un film Kodak XAR-5 pour l'autoradiographie pendant 1 à 16 heures à -70°C. EXEMPLE 2
SYNTHESE ET PURIFICATION DES OLIGONUCLEOTIDES DE SYNTHESE DE FORMULES (9) A (11) CONFORMES A L'INVENTION Ces trois oligonucleotides de 20 paires de bases
chacun qui répondent respectivement aux formules (9) et (10) ci-après :
La synthèse des fragments (9) à (11) a été réalisée en prenant pour modèle la séquence (A).
Cette synthèse chimique a été réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatique "Applied Biosystems" selon la technique de phosphoramidite en phase solide.
La réaction a été efficace à 95-97 % à chaque stade, il a été nécessaire de purifier le produit final (sous- fragments (9) à (11) - 20 mer) des oligonucleotides intermédiaires. Environ 7 mg du mélange d'oligonucléotides dans 60 μ1 H2O sont séparés par électrophorèse dans le gel de 20 $ polyacrylamide + 8 M urée à 700 V, 38mA pendant 3 heures. Les bandes correspondant au 20 mer sont repérées à l'aide d'une feuille d'aluminium recouverte de gel de silice, fluorescente à 254 nm (Merck). Cette partie du gel est découpée, puis l'ADN élue dans 1,5 ml de la solution 0,5 M CH3COONH4 + 5 mM EDTA sous agitation à 37° C pendant 16 heures. Le surnageant est concentré à environ 300μ1 et l'urée est éliminée par chromatographie sur une colonne 10 cm- x 1 cm de Sephadex G-50 (Pharmacia) équilibré avec le tampon 10 mM Tris-HC1 pH 7,5 + 1 mM EDTA. L'ADN ainsi isolé est lyophilisé et conservé à -20°C. MARQUAGE RADIOACTIF (32P) PES FRAGMENTS (9) A (11) DE SYNTHESE (Monobrin)
10 à 20 pM des fragments 9 à 11 dans un volume de 3 μ1 sont ajoutés à 23 μ1 du mélange réactionnel composé de :
100 mM dithiothréitol (2,5μ1), 10 mM spermidine (2,5 μ1), tampon d'incubation 500 mM Tris-HC1 pH 7,5 + 100 mM MgCl2 (2,5 μ1), 100 μCi (-32P) adénosine triphosphate-ATP 3000Ci/ mole (Amersham) et 20 U T4 polynucléoide kinase (Boehrin- ger). Après incubation de 30 mn à 37°C, la réaction est arrêtée avec 2μ1 400 mM EDTA et l'oligonucléotide marqué est séparé de l'ATP par chromatographie sur colonne avec Sephadex G-50. PREHYBRIDATION ET HYBRIDATION Les filtres ou blots sont préhybridés à 55° C pendant 4 heures avec un mélange 5xSSPE contenant 0,9 M NaC1 ; 50 mM NaHPO4 pH 7,4 ; 5 mM EDTA PH 7,4 ; 5 x Denhart ; 0,3 mg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et hydrolyse ; 0,5 % dodecyl sulfate de sodium. L'hybridation est réalisée dans le même mélange. Chacun des fragments radiomarques au 52P, dénaturés à 100°C pendant deux minutes, est ajouté dans la solution d'hybridation à 1 à 2 x 10°cpm/mlL
L'hybridation est réalisée à 55° C pendant au moins 1 heure Après, l'hybridation, les filtres sont lavés dans un tampon 6 x SSC plus 0,1 % SDS, une à deux fois à 65°C pendant 20 minutes. Les filtres sont ensuite placés dans une cassette équipée d'intensificateurs 'CRONEX" (DUPONT), mise en contact avec un film Kodak XAR-5 pour l'autoradiographie pendant 7 à 36 heures à -70°C. EXEMPLE 5
SYNTHESE ET PURIFICATION DES OLIGONUCLEOTIDES DE SYNTHESE
DE FORMULES (12) A (29)
On procède comme décrit à l'Exemple 1, pour préparer les fragments d'ADN de formules (12) à (29). EXEMPLE 4
DETERMINATION DU SEXE DES EMBRYONS BOVINS PAR HYBRIDATION IN SITU AVEC DES FRAGMENTS D'ADN BIOTINYLES(NON-RADIOACTIFS) DE FORMULES (1 ) A (29) A. Préparation des cellules Les cellules utilisées proviennent d'embryons
bovins âgés de 7 à 8 jours de gestation. Après avoir été disséquées, les cellules sont déposées sur une lame et incubées pendant 10 à 15 minutes dans une solution de fixateur tel que le mélange alcool-acide acétique (3 : 1 v/v) puis séchées à l'air. Les lames sont utilisées immédiatement ou, en cas de sexage différé, conservées à 4°C à l'abri des poussières.
B. Biotinylation des fragments d'ADN de formules (1) à (29). La biotinylation desdits fragments s'effectue par addition en 3' de dUTP biotiné ou tout autre désoxynucléo- tide biotiné à l'aide de l'enzymeterminal-transférase (Boehringer).
10 à 20 pM respectivement des fragments synthétisés sont ajoutés à 100μ1 du mélange réactionnel composé de : 140 mM cacodylate de potassium ; 30 mM Tris-HCl pH 7,6 ; 0,1 mM dithiothréitol ; 1 mM CoC12 + 0,02 mM de dUTP biotinylé et 1 à 2 unités d'enzyme terminal-transférase.
Après incubation de 1 heure à 37°C, l'oligonucléotide marqué est séparé par chromatographie sur colonne avec Sephadex 25 superfine.
C . Technique d ' hyb ridation sur lames .
Les lames sont incubées avec 90 à 100μ1 de liquide d'hybridation et recouvertes d'un film plastique (pour éviter l'évaporation).
Après dénaturation pendant 10 mn dans un four à 100°C, les lames sont. mises en chambre humide et incubées à 55°C pendant 16 heures.
La composition finale du liquide d'hybridation est :
. 0,9 M NaC1 . 5 mM EDTA . 50 mM NaHP04 pH 7,4 . 5 x Denhart . 0,5 % SDS
(5 x Denhart = 0,1 % BSA, ou 0,1 % lait écrémé en poudre ;
0,1 % polyvinylpyrrolidone 0,1 % Ficoll); Après avoir ôté le film plastique, les lames sont lavées successivement en solution 6 x SSC (2 x 30 minutes à 55°C), puis en PBS pH 7,4 additionné de 0,1 % v/v de Triton X - 100 et 0,5 % (p/v) de lait écrémé en poudre (Régilait). D. Révélation. Les lames encore humides après avoir ôté l'excédent de fluide sont alors incubées 1 heure à 37° C avec un anticorps de chère antibiotine ou un anticorps de lapin antibiotine. Cet anticorps est vendu purifié par chromatographie d'affinité (Vector Laboratories réf. SP-3000) et est utilisé dans nos tests, dilué au 1:350 dans du PBS pH 7,4 + 0,1 % (v/v) Triton x - 100 + 0,5 % (p/v) lait écrémé en poudre.
Après un lavage de 15 minutes à température ambiante dans PBS pH 7,4 + 0,1 % (v/v) Triton x - 100 + 0,5 % (p/v) lait écrémé en poudre, les lames sont alors incubées 1 heure à 37°C avec un anticorps conventionnel de lapin anti-chèvre ou de chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase (Biosys réf. BI 2403) dilué 1:40 dans PBS pH 7,4 + Triton 0,1% + lait écrémé en poudre 0,5%. Les lames sont ensuite lavées deux fois 15 minutes dans PBS pH 7,4 contenant cette fois 0,1 % (v/v) de Tween - 20 et finalement dans du PBS pH 7,4 pendant 5 minutes.
On procède à une incubation de 5 à 8 minutes à température ambiante avec une solution de diaminobenzidine (DAB SIGMA réf. D 8001) à 0,5 mg/ml dans PBS pH 7,4 contenant 0,01% de H2O2.
Le précipité formé par l'action de la peroxydase sur la DAB est amplifié par précipitation successive de sels d'or et d'argent selon le procédé décrit par BURNS et al (Journal Clinical Pathology 1985, 35, 1085-1092) :
Dans un premier temps on dépose 50 à 100μ1 par lame d'une solution 2,5 mM de chloroaurate de Na (NaAuCl4 BDH réf. 30125 2R) et on incube 5 mn à température ambiante. Après un lavage de 5 mn dans de l'eau distillée, les lames sont incubées 5 mn à température ambiante avec 50 à 100μ1 d'une solution 0,1 M de sulfure de Na (Na2S, SIGMA réf. S 2006), rincées 5 mn à l'eau distillée et incubées 4 à 8 minutes avec 100 à 300μ1 de réactif à l'argent.
La composition du réactif à l'argent est la suivante :
A Carbonate de Na 0,24 M (SIGMA réf. S 4132) B1 Nitrate d'Ammonium 13 mM (SIGMA réf. A 9642) B2 Nitrate d'Argent 6 mM (BDH réf. 303873N) B3 Ac. Dodecatungsto- silicique 1 , 5 mM (BDH réf. 305453R)
B4 Formaldéhyde 37% 0,6μ1/ml (SIGMA réf. F 1635)
Le réactif à l'argent est préparé en mélangeant successivement et sous agitation les solutions B1 - B2 - B3 - B4. Le mélange obtenu est additionné 1:1 à la. solution A et le réactif ainsi préparé est utilisé immédiatement.
Après le traitement au réactif a l'argent, les lames sont lavées à 1'H2O distillée pendant 15 minutes, puis dans l'acide acétique 1% (v/v) 2 fois 15 minutes et enfin colorées pendant 1 minute en Pyronin Y (SYGMA réf. P 7017) 1% en H2O, rincées pendant quelques secondes à l'eau distillée, séchées à l'air chaud et montées en DPX. EXEMPLE 5
CONTROLE DE LA QUALITE DU TRI D'UNE POPULATION DE SPERMATO- ZOIDES BOVINS AVEC LES SONDES D'ADN SPECIFIQUES DU SEXE MALE CONFORMES A L'INVENTION. Préparation des cellules
Les cellules utilisées sont des spermatozoïdes de taureau congelés et stockés dans l'azote liquide. On décongèle une paillette, soit environ 13 000 000 de spermatozoïdes
vivants. Les paillettes sont réchauffées pendant 30 secondes à 37°C puis le sperme dilué dans 1 ml de PBS stérile.
On procède à une série de centrifugations dans le but d'éliminer au maximum le milieu de congélation. La suspension des spermatozoïdes en PBS est d'abord centrifugée pendant 10 mn à 500 g, le surnageant aspiré et les spermatozoïdes repris en 1 ml de 0,11 M citrate de sodium. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant, on reprend en 1 ml de 0,11 M citrate de sodium + 5% DMSO, on centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant, on resuspend dans
1 ml de 0,11 M citrate de sodium + 15% DMSO. On centrifuge
10 mn à 500 g. On aspire le surnageant, on resuspend dans
1 ml de 0,11 M citrate de sodium + 50% DMSO. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant; on resuspend dans 1 ml de 0,11 M citrate de sodium dans du Tris-HCl 0,1 M pH 7,4. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant et on resuspend dans 250μ1 de ce même tampon.
A ce stade, les cellules sont soit déposées sur lame (30 - 40μ1 de suspension de spermatozoïdes par lame) et traitées par hybridation in situ avec une des sondes de formules (1) à (29) biotinylées, soit déposées sur filtre et hybridées selon la technique des dot-blots avec l'une des sondes de formules (1) à (29) marquées à l'aide de nucleotides radioactifs. EXEMPLE 6
AMPLIFICATION GENIQUE IN VITRO DES SONDES MOLECULAIRES D'ADN SPECIFIQUES DU GENOME MALE DE MAMMIFERES RUMINANTS, NOTAMMENT DU GENRE BOS.
Le processus d'amplification génique in vitro est basé sur des cycles successifs-d'hybridation des sondes avec des "amorces" oligonucléotidiques (les "amorces" sont des segments flanquants et, spécifiquement, dans le cas présent, l'un quelconque des fragments de formules (1) à (29)), -d'extension à partir des "amorces", à l'aide de l'enzyme ADN-polymé- rase et - de dénaturation , par exemple selon un processus
dit PCR ("Polymerase chain reaction") décrit par la Société CETUS CORPORATION (cf. notamment MULLIS et Al., COLD SPRING HARBOR SYMPOSIA ON QUANTITATIVE BIOLOGY, Vol. I-I, 1986, pages 263-272). Les cellules d'une biopsie sont déposées dans un microtube sous un volume de 1 Oμl dans du PBS - 35μ1 d'H2θ sont ajoutés, puis le tube est placé à 95 °C pendant 10 minutes pour lyser les cellules et dénaturer l'ADN. Dans le lysat est ajouté 55μ1 du tampon PCR (50 mM KC1, 10 mM Tris pH 8,3, 8 mM MgC12, 1 μM d'amorce A à fixer à l'une des extrémités de la sonde, 1 μM d'amorce B à fixer à l'autre extrémité de la sonde, 1,5 mM d'ATP,1,5 mM dCTP, 1,5 mM dTTP, 1,5 mM dGTP. Les échantillons sont ensuite transférés à une tempêra- ture appropriée pour 2 minutes de façon à ce que les amorces se fixent. L'extension des brins est initiée par l'addition de 4 unités de "Taq Polymerase" (CETUS CORPORATION) et l'incubation à 69°C pendant 2 minutes. Ce cycle est répété de 30 à 40 fois. Les échantillons sont ensuite dénaturés dans une solution 0,4 N NaOH, 25 mM EDTA et déposés sur une membrane Nylon manuellement ou à l'aide d'un appareil à dot-blot. La répétition de ce cycle à 30 à 40 reprises procure une augmentation de 1 x 1012 fois de la quantité de la séquence de départ qui constitue la sonde proprement dite.
Les membranes sont ensuite neutralisées puis séchées à 80°C, préhybridées et hvbridées à 40 ou à 65° C selon l'amorce mise en oeuvre, dans un tampon 5 x SSPE, 5 x Denhart, 0,5 % SDS contenant les sondes radiomarquées en 5' - terminal avec /γ32p / ATP à l'aide de l'enzyme polynucléotide-kinase.
Les sondes (49 mer ou 17 mer ou 20 mer) peuvent être soit radioactives. Boit marquées avec la biotiné ou un autre composé froid. L'hybridation est effectuée de 40 à 60°C pendant 1 heure. Les membranes sont ensuite lavées 2 fois dans du
2 x SSPE, 0,1 % SDS à température ambiante, suivi d'un lavage à 45°C dans le même tampon pendant 10 minutes. Pour les sondes radioactives, l'autoradiographie est effectuée pendant
30 minutes à 10 heures à -80°C avec écran intensificateur. Pour les sondes froides, la mise en évidence de l'hybridation se fait par une suite de réactions immunocytochimiques décrites à l'Exemple 3 ci-dessus. Dans le cas d'un exemple spécifique dans lequel les amorces A et B sont respectivement le fragment de formule (7) et le fragment de formule (1) :
Amorce A (7)
Amorce B : GATCAGTGCÂGGGACCG (1) le cycle PCR se déroule de la façon suivante : Les cellules de biopsie sont déposées dans un microtube sous un volume de 10 u1 dans du PBS avec addition de 35 u1 d'H2O, comme décrit ci-dessus ; toutefois le tube est placé à 95°C pendant seulement 2 minutes et les opérations se poursuiventcomme décrit plus haut, à ceci près que les échantillons sont transférés pendant 2 minutes à 55°C et que l'incubation avec la "Taq Polymerase" a lieu à 69°C pendant 2 minutes et le cycle est répété 40 fois.
Avec d'autres amorces il pourra être recommandé de réaliser l'Incubation avec la "Taq Polymerase" à une température inférieure, de l'ordre de 37°C par exemple, ou de réaliser l'incubation dans certains cycles à cette température et à 55°C dans d'autres cycles, les durées étant opportunément légèrement prolongées ou réduites selon les amorces mises en oeuvre.
La sonde mise en oeuvre peut être une sonde choisie parmi les sondes ou fragments de formules A et 1 à 29. On pourra, par exemple, avec des amorces de formules (7) et (1) utiliser une sonde de formule (4) :
En pareil cas, la préhybridation est effectuée, de même que l'hybridation, à 65°C.
Avec ce système on obtient un signal mâle très intense, distinct de celui des femelles, qui est très faible, à partir de 125 picogrammes d'ADN, soit l'équivalent de 25 cellules et directement à partir de cellules, avec 50 cellules mâles, après 30 minutes d' autoradiographie. De la même manière, en utilisant, par exemple, comme sonde un fragment de formule (2) ou de formule (3) avec des amorces respectivement de formules (8) et (5), on obtient un signal spécifiquement mâle, à partir de 125 picogrammes d'ADN.
Bien que la description qui précède ait essentiellement fait état du rôle joué par les sondes de formules. (1) à (29) pour la détermination du sexe des embryons de bovins, le contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes et la séparation de cette dernière en deux groupes comprenant respectivement le chromosome Y et le chromosome X en vue de leur utilisation pour l'insémination artificielle, l'on comprendra aisément que ce rôle puisse s'étendre à d'autres animaux dans la mesure où ces derniers présentent des séquences d'ADN spécifique du sexe mâle similaires à celles desdits embryons de bovins ; de même, le rôle des sondes de formules (1) à (29) tel que décrit dans ce qui précède, est uniquement donné à titre d'exemple non limitatif et peut d'étendre à la recherche d'autres séquences spécifiques du sexe mâle.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
Claims
REVENDICATIONS 1. Oligonucleotides synthétiques caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des fragments d'une sonde moléculaire comprenant une séquence en nucleotides de 49 paires de bases, de formule(A) ci-après : 5« 3'
ATCAGTGCAGGGACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTT1 (A) connue en elle-même, et constituant un segment d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères ruminants, notamment du genre Bos, lesquels fragments sont eux-mêmes caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins 10 bases de ladite séquence A,dont au moins 5 bases consécutives de celle-ci, ainsi que leurs complémentaires ou tout fragment présentant au moins 60% d'homologie avec lesdits oligonucleotides.
2. Oligonucleotides synthétiques selon la
Revendication 1, caractérisésen ce qu'ils sont constitués par des fragments de la sonde moléculaire (A) qui comprennent 17 bases, dont au moins 5 bases consécutives de celle-ci et en ce qu'ils répondent aux formules 1 à 8 ci- après :
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8) 
ainsi que leurs complémentaires ou tout fragment présentant au moins 60 % d'homologie avec lesdits oligonucleotides.
3. Oligonucleotides synthétiques selon l'une quelconque, des Revendications 1 et 2, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des fragments de la sonde moléculaire (A) qui comprennent 20 bases chacun et présentent les séquences en nucleotides représentées par les formules (9) à (11), ci-après :
(9)
(10)
(11). 
ainsi que leurs complémentaires ou un fragment desdites séquences comportant au moins 5 nucleotides consécutifs ou tout fragment présentant au moins 60%' d'homologie avec lesdites séquences.
4. Oligonucleotides synthétiques caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des fragments d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères ruminants, notamment du genre Bos, lesquels fragments présentent les séquences en nucleotides représentées par les formules (12) à
(29) ci-après :
5. Procédé d'amplification génique de sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères, notamment de ruminants, plus particulièrement de la sous- famille des bovines et de façon spécifique du genre Bos, lesquelles sondes présentent l'une des séquences en nucléo- tides (A) ou (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4 ci-dessus, lequel procédé d'amplification est caractérisé en ce qu'il consiste à fixer à chacune des extrémités, respectivement, de ladite sonde moléculaire, une séquence flanquante judicieusement choisie parmi les fragments d'ADN de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, par hybridation, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation, et à répéter le cycle hybridation-extension- dénaturation, connu sous le nom de cycle PCR, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence constituant la sonde moléculaire de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre.
6. Application des fragments d'ADN de formules
(1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, avantageusement marqués par un radio-isotope ou par une substance non-radioactive appropriée, en tant que sondes moléculaires pour la détermination du sexe d'embryons ou de foetus de mammifères ruminants, notamment de la sous- famille des bovines, et en particulier du genre Bos.
7. Application des fragments d'ADN de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, avantageusement marqués par un radio-isotope ou par une substance non-radio-active appropriée, en tant que sondesmoléculaires pour le contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes.
8. Application des fragments d'ADN de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, avantageusement marqués par un radio-isotope ou par une substance non radio-active appropriée, en tant que sondes moléculaires pour la séparation des spermatozoïdes en deux populations de spermatozoïdes porteurs respectivement du chromosome Y et du chromosome X en vue de leur utilisation pour l'insémination artificielle.
9. Application des fragments d'ADN de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, avantageusement marqués de façon appropriée et amplifiés à l'aide d'un ou plusieurs des fragments d'ADN de formules (1) à (2g) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, à la détermination du sexe d'embryons ou defoetus de mammifères ruminants, notamment de la sous- famille des bovines, et en particulier du genre Bos.
10. Application des fragments d'ADN de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à
4, avantageusement marqués de façon appropriée et amplifiés à l'aide d'un ou plusieurs des fragments d'ADN de formules (1) à (2g) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, au contrôle de la présence du chromosome Y dans une population de spermatozoïdes.
11. Application des fragments d'ADN de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Reventications 1 à 4, avantageusement marqués de façon appropriée et amplifiés à l'aide d'un ou plusieurs des fragments de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, à la séparation des spermatozoïdes en deux populations de spermatozoïdes porteurs respectivement du chromosome Y et du chromosome X en vue de leur utilisation pour l'insémination artificielle.
12. Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux par immunisation de mammifères rongeurs par des fractions de spermatozoïdes porteurs du chromosome Y - ou X - contrôlées par hybridation avec un fragment d'ADN de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4.
13. Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux par immunisation de mammifères rongeurs ou des fractions de spermatozoïdes porteurs du chromosome
Y - ou X - contrôlées par hybridation avec un fragment d'ADN de formules (1) à (29), selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, ou une sonde de formule (A) amplifiée par un ou plusieurs fragments d'ADN de formules (1) à (29) selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4.
14. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon la Revendication 12 ou la Revendication 13, éventuellement après purification.
15. Réactifs immunologiques spécifiques reconnaissant des déterminants antigeniques contrôlés par les chromosomes X ou Y, ayant servi à l'obtention desdits réactifs et exprimés à la surface des spermatozoïdes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon la Revendication 14.
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