FR2690460A1 - Préparation et utilisation de sondes d'acide nucléique spécifiques du chromosome 21. - Google Patents
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Abstract
L'invention est relative à un procédé de production de sondes spécifiques du chromosome 21 humain, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on effectue l'amplification de séquences d'ADN génomique d'une lignée cellulaire hybride homme-rongeur, laquelle lignée comprend comme seules séquences humaines les séquences du chromosome 21, en utilisant comme amorces, l'amorce Alu TC65 ou l'amorce Alu 517. L'Invention englobe également les sondes obtenues par ledit procédé, et leur utilisation pour le diagnostic de la trisomie 21.
Description
PREPARATION ET UTILISATION DE SONDES D'ACIDE NUCLEIQUE
SPECIFIQUES DU CHROMOSOME 21.
SPECIFIQUES DU CHROMOSOME 21.
L'Invention est relative à des sondes d'acide nucléique spécifiques du chromosome 21 humain, utilisables en particulier pour le diagnostic de la trisomie 21.
La trisomie 21 est l'une des causes les plus fréquentes de retard mental chez l'homme. Elle survient chez 1,5 à 1,8 pour mille nouveau-nés vivants.
Le diagnostic prénatal de cette anomalie chromosomique est réalisé actuellement par l'analyse du caryotype, soit sur cellules trophoblastiques, soit sur cellules amniotiques préalablement mises en culture pendant 10 à 15 jours. Ce procédé nécessite donc des manipulations longues et coûteuses, et de ce fait, ce diagnostic ne peut concerner qu'une population limitée.
I1 a été proposé récemment une nouvelle méthode d'identification des chromosomes sur noyaux en interphase par hybridation in situ avec des sondes non radioactives (sondes froides). Cette méthode, appelée "caryotype en interphase" a surtout été utilisée avec des sondes d'ADN correspondant à des séquences hautement répétées (séquences satellites), spécifiques d'un chromosome donné. Cette méthode de dénombrement des chromosomes interphasiques permettrait un diagnostic prénatal rapide de la trisomie 21, puisqu'il pourrait être effectué sur un petit nombre de cellules amniotiques, de cellules trophoblastiques ou de cellules foetales isolées dans le sang maternel. Cependant, jusqu'à présent, il n'a pas été possible d'isoler des séquences satellites strictement spécifiques du chromosome 21.C'est pourquoi d'autres types de sondes spécifiques du chromosome 21 ont été utilisées. Ainsi,
PINKEL et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:9138-9142 (1988)], KUO et al. [Am. J. Hum. Genet., 49:112-119 (1991)] ont utilisé un mélange de fragments d'ADN recombinant provenant d'une banque génomique établie à partir du chromosome 21 entier. En plus des séquences spécifiques de ce chromosome, ce mélange de fragments contient des séquences répétées (type Alu, LINE ...), communes à l'ensemble des chromosomes. La suppression des signaux secondaires dus à ces séquences est réalisée en utilisant de 1'ADN humain total comme compétiteur. Cette méthode, appelée "Hybridation in situ compétitive" permet de visualiser le chromosome entier, générant un puissant signal sur noyaux interphasiques.Cependant, l'existence de séquences péricentromériques communes aux chromosomes acrocentriques (13, 14, 15, 22), produit dans les noyaux des signaux surnuméraires rendant difficile l'interprétation des résultats.
PINKEL et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:9138-9142 (1988)], KUO et al. [Am. J. Hum. Genet., 49:112-119 (1991)] ont utilisé un mélange de fragments d'ADN recombinant provenant d'une banque génomique établie à partir du chromosome 21 entier. En plus des séquences spécifiques de ce chromosome, ce mélange de fragments contient des séquences répétées (type Alu, LINE ...), communes à l'ensemble des chromosomes. La suppression des signaux secondaires dus à ces séquences est réalisée en utilisant de 1'ADN humain total comme compétiteur. Cette méthode, appelée "Hybridation in situ compétitive" permet de visualiser le chromosome entier, générant un puissant signal sur noyaux interphasiques.Cependant, l'existence de séquences péricentromériques communes aux chromosomes acrocentriques (13, 14, 15, 22), produit dans les noyaux des signaux surnuméraires rendant difficile l'interprétation des résultats.
LICHTER et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
85:9664-68 (1988) ont utilisé une sonde constituée d'un mélange de trente plasmides contenant des séquences uniques localisées dans la bande q22.3 du chromosome 21.
Ce type de sonde permet de détecter efficacement le nombre de chromosomes 21 sur noyaux interphasiques. Mais la production et l'entretien d'une telle sonde, qui nécessitent une lourde infrastructure de biologie moléculaire, rendent son utilisation difficile en pratique quotidienne.
Ces auteurs ont également utilisé des cosmides du chromosome 21 comme sonde [Molecular Genetics of
Chromosome and Down Syndrome. p 69-78 (1990)]. Mais la détection des signaux nécessite l'utilisation d'appareils sophistiqués comme un microscope confocale à laser ou une camera CCD, associés à des systèmes informatiques de traitement d'images.
Chromosome and Down Syndrome. p 69-78 (1990)]. Mais la détection des signaux nécessite l'utilisation d'appareils sophistiqués comme un microscope confocale à laser ou une camera CCD, associés à des systèmes informatiques de traitement d'images.
KIEVITS et al. [Cytometry, 11:105-109 (1990)] ont proposé une méthode simple, qui consiste à utiliser comme sonde, l'ADN génomique total d'un hybride somatique homme-rongeur contenant un (ou une partie) d'un chromosome humain donné. Par hybridation in situ compétitive, seules les séquences spécifiques de ce chromosome sont visualisées.
Une autre approche développée par NELSON et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:6686-6690 (1989)] consiste en l'obtention de séquences d'ADN spécifiques d'un chromosome humain en amplifiant sélectivement par Polymerase Chain Reaction" (PCR), les séquences de ce chromosome contenues dans le génome d'un hybride somatique interspécifique homme-rongeur. Pour cela ils utilisent des amorces reconnaissant spécifiquement les séquences Alu (PCR-Alu) qui sont largement dispersées dans le génome humain. Ces amorces ont permis à ces auteurs d'amplifier certaines séquences spécifiques du chromosome X. Il a été également proposé d'utiliser, dans le même but, des amorces reconnaissant une autre famille de séquences d'ADN répétées et dispersées dans le génome humain : les séquences d'ADN LINE. LEDBETTER et al.
[Genomics, 8:614-622, (1990)]. LICHTER et al. [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 87:6634-6638 (1990)] et LENGAUER et al. [Hum. Genet. 86:1-6 (1990)], montrent que les produits d'amplification, utilisés comme sonde biotinylée sur chromosomes métaphasiques humains, sont strictement spécifiques des chromosomes humains ayant servi de matrice, en l'occurrence les chromosomes 22, 7, 18, et X.
Toutefois, malgré les recherches effectuées, on n'était jusqu'à présent pas parvenu à obtenir des résultats similaires concernant le chromosome 21.
Les Inventeurs se sont fixé pour but de produire une sonde spécifique du chromosome 21, donnant des signaux non ambigus sur noyaux interphasiques. Pour cela ils sont partis d'une approche similaire à celle décrite en particulier par NELSON et al. et LEDBETTER et al. (publications précitées), et afin de résoudre les problèmes posés par l'application au chromosome 21 des techniques décrites par ces auteurs, ils ont sélectionné les amorces et les conditions d'amplification par PCR propres à permettre l'obtention de sondes très spécifiques du chromosome 21.
Les Inventeurs ont choisi comme matériel de départ une lignée cellulaire hybride somatique hommesouris qui comprend comme seul chromosome humain le chromosome 21, et ont amplifié par PCR, à partir de l'ADN génomique total de cette lignée, des séquences spécifiques du chromosome humain, à l'aide d'amorces spécifiques des séquences Alu humaines (PCR-Alu)
La présente Invention a pour objet un procédé de production de sondes spécifiques du chromosome 21 humain, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle, en partant de 1'ADN génomique total d'une lignée cellulaire hybride homme-rongeur, laquelle lignée cellulaire comprend comme seules séquences d'origine humaine des séquences du chromosome 21.
La présente Invention a pour objet un procédé de production de sondes spécifiques du chromosome 21 humain, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle, en partant de 1'ADN génomique total d'une lignée cellulaire hybride homme-rongeur, laquelle lignée cellulaire comprend comme seules séquences d'origine humaine des séquences du chromosome 21.
Les produits d'amplification sont ensuite purifiés et marqués (marquage radioactif ou nonradioactif) par tous moyens appropriés, connus en euxmêmes.
L'amorce Alu TC65 ainsi que l'amorce Alu 517 sont décrites dans la publication de NELSON et al.
précitée.
Avantageusement, pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention, on utilisera la lignée cellulaire WAVR4, qui dérive de la lignée WAVRD4 dAl9 (NIGMS Human Genetic Cell Mutant Repository, Camden, USA, n'd'accès: GM 10332) laquelle résulte elle-même de la fusion de la lignée humaine W1-38 et de la lignée murine
A9.
A9.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, la réaction d'amplification est effectuée dans un milieu réactionnel comprenant, pour un volume de 50 Cil, entre 100 et 500 ng d'ADN génomique de l'hybride WAVR4, environ 1 FM d'amorce, environ 2,5 mM de
MgC12 .
MgC12 .
Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, l'amorce utilisée est l'amorce TC65, et après dénaturation de l'ADN génomique de WAVR4 pendant 6 minutes environ à 95 C environ, on effectue 35 cycles d'amplification, chaque cycle comprenant une étape de dénaturation de 1 minute environ à 94 C environ, une étape d'hybridation de 1 minute environ à 55 C environ, une étape d'élongation de 4 minutes environ à 72 ec environ, l'étape d'élongation du dernier cycle étant effectuée pendant 10 minutes environ à 72 C environ.
Selon une autre disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, l'amorce utilisée est l'amorce 517 et après dénaturation de l'ADN génomique de WAVR4 pendant 5 minutes environ à 95 'C environ, on effectue 30 cycles d'amplification, chaque cycle comprenant une étape de dénaturation de 1 minute environ à 94 'C environ, une étape d'hybridation de 2 minutes environ à 55 'C environ, une étape d'élongation de 4 minutes environ à 72 C environ, l'étape d'élongation du dernier cycle étant effectuée pendant 10 minutes environ à 72 'C environ.
Dans ce qui suit, on désignera par "sonde
TC65" le produit d'amplification obtenu en utilisant l'amorce Alu TC65, et par "sonde 517" le produit obtenu en utilisant l'amorce Alu 517.
TC65" le produit d'amplification obtenu en utilisant l'amorce Alu TC65, et par "sonde 517" le produit obtenu en utilisant l'amorce Alu 517.
L'Invention a également pour objet des sondes d'acide nucléique s'hybridant spécifiquement avec le chromosome 21 humain, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par un procédé conforme à l'invention, tel que décrit ci-dessus.
L'Invention englobe également l'utilisation desdites sondes pour la détection in vitro de séquences d'ADN spécifique du chromosome 21 dans des cellules humaines. Préférentiellement, la sonde TC 65 et la sonde 517 seront utilisées conjointement.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, la détection du chromosome 21 est effectuée sur des cellules en métaphase.
Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, la détection du chromosme 21 est effectuée sur des noyaux de cellules en interphase.
L'Invention concerne également des réactifs de diagnostic pour la détection du nombre de copies du chromosome 21 dans une cellule humaine, lesquels réactifs sont caractérisés en ce qu'il comprennent au moins une sonde d'acide nucléique conforme à l'Invention.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et d'utilisation des réactifs conformes à l'Invention.
Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
METHODES GENERALES
Lignée cellulaires
WAVR4 est une lignée cellulaire hybride somatique homme-souris contenant comme seul chromosome humain, le chromosome 21. Cette lignée dérive de la lignée WAVRD4dAî9 (NIGMS Human Genetic Cell Mutant
Repository, Camden, USA; n' d'accès : GM 10332) qui résulte de la fusion de la lignée humaine W1-38 et de la lignée murine A9. Cette lignée a été fournie par Mr. M.
Lignée cellulaires
WAVR4 est une lignée cellulaire hybride somatique homme-souris contenant comme seul chromosome humain, le chromosome 21. Cette lignée dérive de la lignée WAVRD4dAî9 (NIGMS Human Genetic Cell Mutant
Repository, Camden, USA; n' d'accès : GM 10332) qui résulte de la fusion de la lignée humaine W1-38 et de la lignée murine A9. Cette lignée a été fournie par Mr. M.
FELLOUS (INSTITUT PASTEUR DE PARIS).
Préparation chromosomique
Les chromosomes métaphasiques sont obtenus à partir de cultures de cellules de l'hybride cellulaire
WAVR4, et de lymphocytes humains stimulés par PHA et provenant de donneurs sains. La méthode de synchronisation par méthotrexate et 5-bromodésoxyuridine est celle de CAMARGO et CERVENKA [Hum. Genet. 54:47-53, (1980)].
Les chromosomes métaphasiques sont obtenus à partir de cultures de cellules de l'hybride cellulaire
WAVR4, et de lymphocytes humains stimulés par PHA et provenant de donneurs sains. La méthode de synchronisation par méthotrexate et 5-bromodésoxyuridine est celle de CAMARGO et CERVENKA [Hum. Genet. 54:47-53, (1980)].
Préparation de 1'ADN
L'ADN génomique de l'hybride somatique WAVR4 est préparé selon la méthode habituelle de MANIATIS et al. [Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring
Harbour, (1989)]. L'ADN placentaire (SIGMA) (utilisé comme compétiteur et comme sonde sur les chromosomes et noyaux de WAVR4) est traité successivement par la RNase (100 Rg/l) puis par protéinase K (200 Fg/l), extrait au phénol-chloroforme et soniqué en fragments de 200 à 600 pb.
L'ADN génomique de l'hybride somatique WAVR4 est préparé selon la méthode habituelle de MANIATIS et al. [Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring
Harbour, (1989)]. L'ADN placentaire (SIGMA) (utilisé comme compétiteur et comme sonde sur les chromosomes et noyaux de WAVR4) est traité successivement par la RNase (100 Rg/l) puis par protéinase K (200 Fg/l), extrait au phénol-chloroforme et soniqué en fragments de 200 à 600 pb.
L'ADN de souris (utilisé comme compétiteur) est extrait d'un culot de cellules de souris selon
MANIATIS et al. (ouvrage précité), et soniqué.
MANIATIS et al. (ouvrage précité), et soniqué.
EXEMPLE 1 - OBTENTION DES SONDES TC65 ET 517 SPECIFIQUES
DU CHROMOSOME 21
PROTOCOLE
Les sondes spécifiques du chromosome 21, TC65 et 517 sont obtenues d'après le protocole suivant
- Amplification de 1'ADN de la lignée hybride somatique interspécifique WAVR4 par PCR-Alu,
- Extraction et purification des produits d'amplification, puis marquage des produits d'amplification.
DU CHROMOSOME 21
PROTOCOLE
Les sondes spécifiques du chromosome 21, TC65 et 517 sont obtenues d'après le protocole suivant
- Amplification de 1'ADN de la lignée hybride somatique interspécifique WAVR4 par PCR-Alu,
- Extraction et purification des produits d'amplification, puis marquage des produits d'amplification.
1) AMPLIFICATION DE L'ADN DE L'HYBRIDE
SOMATIOUE WAVR4.
SOMATIOUE WAVR4.
a) Sonde TC65 : amnlification avec l'amorce
Alu TC65
La réaction a lieu dans un volume final de 50 1 qui comprend : 100 à 500 ng d'ADN de l'hybride somatique WAVR4, 1 RM d'amorce TC65, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KC1, 0.01% de gélatine, 2.5mM de MgC12, 250 WM de dXTP (dATP ; dCTP, dTTP; dGTP) et 2.5 U d'ADN polymérase de Thermus aquaticus (Taq).
Alu TC65
La réaction a lieu dans un volume final de 50 1 qui comprend : 100 à 500 ng d'ADN de l'hybride somatique WAVR4, 1 RM d'amorce TC65, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KC1, 0.01% de gélatine, 2.5mM de MgC12, 250 WM de dXTP (dATP ; dCTP, dTTP; dGTP) et 2.5 U d'ADN polymérase de Thermus aquaticus (Taq).
On mélange dans un tube "Microfuge tube colorless" (Robin scientific) de 0.6 ml
- 5 A1 d'ADN de l'hybride somatique WAVR4 (100 ng/Al)
- 5 A1 d'amorce TC65 (10 pM)
- 5 Fl de tampon 10x: 100 mM Tris-HCl ; 500 mM
KC1 ; 0.1% gélatine (Gene amp Reagent. 10x PCR buffer.
- 5 A1 d'ADN de l'hybride somatique WAVR4 (100 ng/Al)
- 5 A1 d'amorce TC65 (10 pM)
- 5 Fl de tampon 10x: 100 mM Tris-HCl ; 500 mM
KC1 ; 0.1% gélatine (Gene amp Reagent. 10x PCR buffer.
Perkin Elmer/Cetus)
- 5 W1 d'ions magnésium (Mgcl2 solution 25 mM
Perkin Elmer Cetus)
- 6.25 l de dXTP à 2 mM
- 0.5 A1 Thermus aquaticus ADN polymérase (Taq) à 5 U/F1
- Eau : 23,25 tL1.
- 5 W1 d'ions magnésium (Mgcl2 solution 25 mM
Perkin Elmer Cetus)
- 6.25 l de dXTP à 2 mM
- 0.5 A1 Thermus aquaticus ADN polymérase (Taq) à 5 U/F1
- Eau : 23,25 tL1.
La réaction est réalisée dans un appareil d'amplification d'ADN : DNA THERMAL CYCLER 480 Perkin
Elmer Cetus, de la façon suivante
Après une dénaturation de 6 minutes à 95', 35 cycles d'amplification sont effectués avec une dénaturation de 1 minute à 94', suivie d'une hybridation de 1 minutes à 55', puis d'une élongation à 72' pendant 4 minutes. La dernière élongation est de 10 minutes à 72'.
Elmer Cetus, de la façon suivante
Après une dénaturation de 6 minutes à 95', 35 cycles d'amplification sont effectués avec une dénaturation de 1 minute à 94', suivie d'une hybridation de 1 minutes à 55', puis d'une élongation à 72' pendant 4 minutes. La dernière élongation est de 10 minutes à 72'.
Le produit d'amplification obtenu donne après migration sur gel d'agarose à 1,3% un profil de migration d'une vingtaine de bandes allant de 500 pb à 3 kb (Figure la) - Pistes 1 et 3 : marqueurs de poids moléculaire pBR322/Taq et lambda/EcoRI/HindIII
Piste 2 : sonde TC65 ; les poids moléculaires sont exprimés en paires de bases.
Piste 2 : sonde TC65 ; les poids moléculaires sont exprimés en paires de bases.
b) Sonde 517 : amtlification avec l'amorce
Alu 517
La réaction a lieu dans un volume final de 50 A1 qui comprend : 500 ng d'ADN de l'hybride somatique
WAVR4, 1 FM d'amorce 517, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de
KC1, 0.01% de gélatine, 2.5 mM de MgC12, 250 RM de dXTP (dATP ; dCTP ; dTTP ; dGTP) et 2.5 U de Thermus aquaticus
ADN polymérase (Taq).
Alu 517
La réaction a lieu dans un volume final de 50 A1 qui comprend : 500 ng d'ADN de l'hybride somatique
WAVR4, 1 FM d'amorce 517, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de
KC1, 0.01% de gélatine, 2.5 mM de MgC12, 250 RM de dXTP (dATP ; dCTP ; dTTP ; dGTP) et 2.5 U de Thermus aquaticus
ADN polymérase (Taq).
On mélange dans un tube "Microfuge tube colorless" (Robin scientific) de 0.6 ml
- 5 Al d'ADN de l'hybride somatique WAVR4 (100 ng/ l)
- 5 Fl d'amorce 517 (10 WM)
- 5 Fl de tampon 10x: 100 mM Tris-HCl ; 500 mM
KCl ; 0.1% gélatine (Gene Amp Reagent. 10xPCR buffer.
- 5 Al d'ADN de l'hybride somatique WAVR4 (100 ng/ l)
- 5 Fl d'amorce 517 (10 WM)
- 5 Fl de tampon 10x: 100 mM Tris-HCl ; 500 mM
KCl ; 0.1% gélatine (Gene Amp Reagent. 10xPCR buffer.
Perkin Elmer/Cetus)
- 5 Fl d'ions magnésium (MgC12 solution 25 mM
Perkin Elmer Cetus)
- 5 Al de dXTP à 2,5 mM
- 0.5 Al de Thermus aquaticus ADN polymérase (Taq) à 5 U/pil
- Eau : 24,5 Rl.
- 5 Fl d'ions magnésium (MgC12 solution 25 mM
Perkin Elmer Cetus)
- 5 Al de dXTP à 2,5 mM
- 0.5 Al de Thermus aquaticus ADN polymérase (Taq) à 5 U/pil
- Eau : 24,5 Rl.
La réaction est réalisée dans un appareil d'amplification d'ADN : DNA THERMAL CYCLER 480 Perkin
Elmer Cetus, de la façon suivante
Après une dénaturation de 5 minutes à 95', 30 cycles d'amplification sont effectués avec une dénaturation de 1 minutes à 94', suivie d'une hybridation de 2 minutes à 55', puis d'une élongation à 72' pendant 4 minutes La dernière élongation est de 10 minutes à 72'.
Elmer Cetus, de la façon suivante
Après une dénaturation de 5 minutes à 95', 30 cycles d'amplification sont effectués avec une dénaturation de 1 minutes à 94', suivie d'une hybridation de 2 minutes à 55', puis d'une élongation à 72' pendant 4 minutes La dernière élongation est de 10 minutes à 72'.
Le produit d'amplification obtenu donne après migration sur gel d'agarose à 1,3% une série de bandes plus ou moins intenses dont la taille varie de 250 pb à 3 kb (Figure lb) - Pistes 1 et 3 : marqueurs de poids moléculaire Lambda/EcoRI/HindIII et pBR322/Taq
Piste 2 : sonde 517 ; les poids moléculaires sont exprimés en paires de bases.
Piste 2 : sonde 517 ; les poids moléculaires sont exprimés en paires de bases.
2) EXTRACTION ET PURIFICATION DES PRODUITS
D'AMPLIFICATION.
D'AMPLIFICATION.
L'ADN amplifié est extrait deux fois au phénol-chloroforme puis une fois au chloroforme selon le protocole classique (MANIATIS et al., Ouvrage précité).
Il est ensuite précipité à l'alcool éthylique. Pour cela on ajoute à la solution d'ADN du NaCl à 0.15 M final, puis 2,5 volume d'éthanol 100%.
- Précipitation toute la nuit à -20'C à - à -80'C 1/2 h.
- Centrifugation 1/2h à 15000 g à -20'C
- Le culot est ensuite lavé dans de l'éthanol 70%
- Centrifugation 5 à 10 mn.
- Le culot est ensuite lavé dans de l'éthanol 70%
- Centrifugation 5 à 10 mn.
- Sécher à reprendre dans 75 Fl de TE (Tris
HCl pH 8 : 10 mM ; EDTA : 1 mM).
HCl pH 8 : 10 mM ; EDTA : 1 mM).
- Quantification des produits d'amplification sur gel d'agarose à 1,3%.
3) MAROUAGE DES PRODUITS D'AMPLIFICATION
Le marquage des produits d'amplification est effectué par BioNick translation selon le protocole de
GIBCO BRL. On utilise pour cela le kit "Nick labeling system" de GIBCO BRL (réf: 8160SB).
Le marquage des produits d'amplification est effectué par BioNick translation selon le protocole de
GIBCO BRL. On utilise pour cela le kit "Nick labeling system" de GIBCO BRL (réf: 8160SB).
Dans un tube Eppendorf, mélanger
- 5 Rl de solution A4 [10 x dXTP (dATP, dCTP, dGTP à 0,2 mM)]
- X 1 de solution de 1'ADN à marquer (correspondant à 1 Rg d'ADN)
- 5 1 de solution d'enzyme 10x (DNA polymerase/DNAse 1)
- 2,5 Fl de dUTP-ll-biotinylé à 0,4 mM
- Y Fl d'eau distillée afin d'obtenir un volume final de 50 Ciel.
- 5 Rl de solution A4 [10 x dXTP (dATP, dCTP, dGTP à 0,2 mM)]
- X 1 de solution de 1'ADN à marquer (correspondant à 1 Rg d'ADN)
- 5 1 de solution d'enzyme 10x (DNA polymerase/DNAse 1)
- 2,5 Fl de dUTP-ll-biotinylé à 0,4 mM
- Y Fl d'eau distillée afin d'obtenir un volume final de 50 Ciel.
Incuber toute une nuit à 15. puis ajouter 5 Rl d'EDTA 300 mM pour arrêter la réaction.
Le taux d'incorporation du dUTP-11 biotinylé est évalué indirectement par mesure de l'incorporation de dATP 3 H. Pour cela, 5 FCi soit 5 Fl de dATP-3H (Amersham
TRK 633) sont ajoutés à la solution de marquage.
TRK 633) sont ajoutés à la solution de marquage.
Le dATP-3H est séché dans le tube Eppendorf où doit avoir lieu la réaction. Les différents réactifs sont ensuite ajoutés comme indiqué ci-dessus.
Le pourcentage d'incorporation du dATP 3 H est mesuré par précipitation au TCA 10% (voir MANIATIS et al.
1989).
4) ELIMINATION DES NUCLEOTIDES NON INCORPORES
Les nucléotides non incorporés sont éliminés par passage du mélange sur colonne de SEPHADEX G50 (PHARMACIA : 17-0044-01) de 5 ml.
Les nucléotides non incorporés sont éliminés par passage du mélange sur colonne de SEPHADEX G50 (PHARMACIA : 17-0044-01) de 5 ml.
La colonne est éluée avec du Tris-HCl 10 mM pH : 8, EDTA 1 mM. Le volume de la sonde est ajusté à 250R1. Une fois la sonde déposée sur la colonne, une quinzaine de fractions sont récupérées (7 à 8 gouttes = 150 à 200 Fl d'éluat par fraction.
La radioactivité de chaque fraction est mesurée (un aliquot de 2 Rl est prélevé par fraction), les fractions correspondant au pic d'ADN sont réunies et précipitées à l'alcool éthylique.
Pour cela on ajoute à la solution d'ADN, du
NaCl à 0,15 M final, 30 1 d'ADN de sperme de saumon (10 Ag/Rl) ou 1 Fl de glycogène (Appligene : 130011) pour favoriser la précipitation, puis 2 volumes d'éthanol 100%.
NaCl à 0,15 M final, 30 1 d'ADN de sperme de saumon (10 Ag/Rl) ou 1 Fl de glycogène (Appligene : 130011) pour favoriser la précipitation, puis 2 volumes d'éthanol 100%.
- Précipitation toute la nuit à -20 ou une 1/2 h à -80'
- Centrifugation 1/2 h à 12000 g (-20 'C)
- Le culot est lavé dans de l'éthanol 70%
- Centrifugation 5 à 10 mn
- Sécher et reprendre le culot dans du Tris HC1 pH : 7.4, EDTA 1 mM.
- Centrifugation 1/2 h à 12000 g (-20 'C)
- Le culot est lavé dans de l'éthanol 70%
- Centrifugation 5 à 10 mn
- Sécher et reprendre le culot dans du Tris HC1 pH : 7.4, EDTA 1 mM.
La sonde est prête pour l'hybridation, ou peut être conservée à -20' pendant au moins une année.
EXEMPLE 2 - HYBRIDATION IN SITU DES SONDES CONFORMES A L'INVNETION
Hvbridation sur lvmchocvtes humains
Les deux sondes obtenues ont été hybridées 36 à 48 heures à 37'C, en présence d'une concentration d'ADN placentaire humain au moins 100 à 200 fois supérieure, afin de saturer les séquences répétées dispersées dans le génome humain (type Alu et LINE).
Hvbridation sur lvmchocvtes humains
Les deux sondes obtenues ont été hybridées 36 à 48 heures à 37'C, en présence d'une concentration d'ADN placentaire humain au moins 100 à 200 fois supérieure, afin de saturer les séquences répétées dispersées dans le génome humain (type Alu et LINE).
Sur chromosomes métahasicnies et pour une concentration de sonde de 10 Rg/ml, les deux sondes donnent un signal sur le bras long du chromosome 21.
Aucun signal centromérique n'est observé.
Sur novaux interchaslaues, à la concentration de 50 Ag/ml de sonde, on observe deux signaux correspondant à des "domaines" bien individualisés. Le mélange des deux sondes à la concentration chacune de 30 à 50 Rg/ml permet d'observer sans ambiguités les domaines des chromosomes 21.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente
Invention.
Invention.
Claims (11)
1) Procédé de production de sondes spécifiques du chromosome 21 humain, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on effectue l'amplification de séquences d'ADN génomique d'une lignée cellulaire hybride homme-rongeur, laquelle lignée comprend comme seules séquences humaines les séquences du chromosome 21, en utilisant comme amorces, l'amorce Alu TC65 ou l'amorce Alu 517.
2) Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue l'amplification des séquences d'ADN génomique de la lignée cellulaire hybride homme-souris WAVR4.
3) Procédé selon l'une quelconque des
Revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la réaction d'amplification est effectuée dans un milieu réactionnel comprenant, pour un volume de 50 Fl, entre 500 ng d'ADN génomique de 1'hybride homme-rongeur, environ 1 WM d'amorce, environ 2,5 mM de MgC12.
4) Procédé selon l'une quelconque des
Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'amorce utilisée est l'amorce TC65, et après dénaturation de 1'ADN génomique de l'hybride pendant 6 minutes environ à 95 'C environ, on effectue 35 cycles d'amplification, chaque cycle comprenant une étape de dénaturation de 1 minute environ à 94 'C environ, une étape d'hybridation de 1 minute environ à 55 'C environ, une étape d'élongation de 4 minutes environ à 72 C environ, l'étape d'élongation du dernier cycle étant effectuée pendant 10 minutes environ à 72 'C environ.
5) Procédé selon l'une quelconque des
Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'amorce utilisée est l'amorce 517 et après dénaturation de 1'ADN génomique de l'hybride pendant 5 minutes environ à 95 'C environ, on effectue 30 cycles d'amplification, chaque cycle comprenant une étape de dénaturation de 1 minute environ à 94 'C environ, une étape d'hybridation de 2 minutes environ à 55 C environ, une étape d'élongation de 4 minutes environ à 72 'C environ, l'étape d'élongation du dernier cycle étant effectuée pendant 10 minutes environ à 72 C environ.
6) Sondes d'acide nucléique s'hybridant spécifiquement avec le chromosome 21 humain, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par un procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5.
7) Utilisation des sondes selon la
Revendication 6 pour la détection in vitro de séquences d'ADN spécifique du chromosome 21 dans des cellules humaines.
8) Utilisation selon la Revendication 7, caractérisée en ce que lesdites sondes sont utilisées conjointement.
9) Utilisation selon l'une quelconque des
Revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que la détection du chromosome 21 est effectuée sur des cellules en métaphase.
10) Utilisation selon l'une quelconque des
Revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que la détection du chromosome 21 est effectuée sur des noyaux de cellules en interphase
11) Réactifs de diagnostic pour la détection du nombre de copies du chromosome 21 dans une cellule humaine, lesquels réactifs sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une sonde d'acide nucléique selon la
Revendication 6.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9205082A FR2690460A1 (fr) | 1992-04-24 | 1992-04-24 | Préparation et utilisation de sondes d'acide nucléique spécifiques du chromosome 21. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9205082A FR2690460A1 (fr) | 1992-04-24 | 1992-04-24 | Préparation et utilisation de sondes d'acide nucléique spécifiques du chromosome 21. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2690460A1 true FR2690460A1 (fr) | 1993-10-29 |
Family
ID=9429238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9205082A Pending FR2690460A1 (fr) | 1992-04-24 | 1992-04-24 | Préparation et utilisation de sondes d'acide nucléique spécifiques du chromosome 21. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2690460A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2154506A1 (es) * | 1995-06-07 | 2001-04-01 | Estivill Palleja Xavier | Procedimiento de caracterizacion por una nueva tecnica de clonaje moleculalar (pcr alu-splice) de una secuencia genica del cromosoma 21 humano y nueva secuencia genica cscr1 de la region critica del sindrome de down de dicho cromosoma, caracterizada segun el mismo. |
-
1992
- 1992-04-24 FR FR9205082A patent/FR2690460A1/fr active Pending
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| GENE. vol. 49, 1986, AMSTERDAM NL pages 361 - 369 R.L.NEVE ET AL. 'Human chromosome 21-encoded cDNA clones' * |
| GENOMICS vol. 10, 1991, NEW YORK,USA pages 186 - 192 D.C.BICKNELL ET AL. * |
| HUMAN GENETICS vol. 86, no. 1, Novembre 1990, pages 1 - 6 C.LENGAUER ET AL. * |
| HUMAN GENETICS, vol. 86, no. 1, novembre 1990, pages 1-6; C. LENGAUER et al.: "Painting of human chromosomes with probes generated from hybrid cell lines by PCR with Alu and L1 primers" * |
| NUCLEIC ACIDS RESEARCH. vol. 13, no. 17, 1985, ARLINGTON, VIRGINIA US pages 6075 - 6088 P.C.WATKINS ET AL. 'Isolation of polymorphic DNA segments from human chromosome 21' * |
| PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA. vol. 85, Décembre 1988, WASHINGTON US pages 9664 - 9668 P.LICHTER ET AL. * |
| PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA. vol. 86, Septembre 1989, WASHINGTON US pages 6686 - 6690 D.L.NELSON ET AL. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2154506A1 (es) * | 1995-06-07 | 2001-04-01 | Estivill Palleja Xavier | Procedimiento de caracterizacion por una nueva tecnica de clonaje moleculalar (pcr alu-splice) de una secuencia genica del cromosoma 21 humano y nueva secuencia genica cscr1 de la region critica del sindrome de down de dicho cromosoma, caracterizada segun el mismo. |
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