JPH03503357A

JPH03503357A - 反芻哺乳動物、特にウシ亜科および特にウシ属の雄性ゲノムに特異的な分子プローブと、これらプローブを増幅させるための隣接配列と、前記プローブの用途

Info

Publication number: JPH03503357A
Application number: JP88507066A
Authority: JP
Inventors: ビシヨツプ　コラン; コテイノ　コリーヌ; フエルー　マルク; キルスゼンボーム　マレク; ヴエマン　マルセル
Original assignee: アンステイチユ　ナシオナル　ド　ルシエルシユ　アグロノミック（イーエヌエールアー）; アンステイチユ　パスツール; コミサリア　ア　レネルジー　アトミック　（セーウーアー）
Priority date: 1987-08-27
Filing date: 1988-08-25
Publication date: 1991-08-01
Also published as: AU2321888A; AU621556B2; FR2619819B1; DK51690A; IN167595B; EP0377624A1; NZ225953A; WO1989001978A1; DK51690D0; FR2619819A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】反ｎ＠乳動物、特にウシ亜科および゛特にウソ属の雄性ゲノ１１に特異的な分子プローブと、これらプローブを増幅させるための隣接配列と、前記プローブの用途。

この発明は、反邦動物、特にラン亜科、なかでもウシ属の胚または胎児の性別または雌雄鑑別の決定に有用で、雄性に特異的なＴ）ＮＡ塩基配列を有する特異的ＤＮＡ分子プローブ、並びにこれらプローブの遺伝的増幅のための隣接する配列または、プライマー配列に関する。またこの発明は、上記隣接配列により好ましく増幅された上記プローブの用途、特に上記反鍔動物の胚の性別及び胎児の性別決定のための上記プローブの用途、ならびに精子集団中のＹ染色体の存在を検査するためと、人工受精のためにＹ染色体とＸ染色体の各々から構成される二つのグループに１−記集団を分離するための」−記ブローブの用途を包含する・５Ａｌｋ　１ｎｓＬｉＬｎＬｅ　ＢｉｏＬｅｅｈｎｏｌｏｇｙ　１ｎｄｕｓｔｒｔａｌ＾５ｓｏｅｉａＬＱ８名での１９８５年５月３１日付は米国特許順算７３９８１７号の優先権を主張して、１９８６年５月３０日付けで出願された国際出願Ｐ　ＣＴ　ｌ！６１０７０９５号には、ウシ属の、特にヘラホード種及びポルスタイン種の雄の出生前性別鑑別のための核酸プローブが記載されている。ウシ属の上記の１つの品種の雄の全ＤＮＡと有意に雑種形成する核酸から形成されているという特性を有するこれらのプローブは、次のようなもので構成されている。すなわちａ）プラスミドｐＥ５５（２）の最小Ｐｓｔ　Ｉ　フラグメント、もしくはプラスミドＰＥ３８の最小のＰｓＬ　ｌ　フラグメント、もしくはλ−ＥＳ６゜Ｏのゲノムの６．２ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントと実質的に同じ配列を有するセグメント、またはｂ）　ａ）に列挙されたセグメントのうち２０ｂｐ以上の長さのセグメント、またはｅ）　ａ）及びｂ）に列挙された１つのセグメントのストランドのいずれか、またはｄ）上記ａ）、ｂ）及びＣ）に列挙されたセグメントの１つと同配列を有する１Ｉ！Ｉ１　Ｆ？、　Ｎ　Ａまたは二ｉｌｔ鎖ＲＮＡで構成されている。

しかしながら、上記のＰＣＴ国際出顆出願記ｄ）参照）にはＲＮＡが記載されているのであるが、好ましい核酸はＤＮＡであり、λ−ＥＳ６．Ｏのゲノムの６．２ｋｂｐ、　４．０ｋｈｐまたは２．２ｋｂｐのＥｅｏＲＩフラグメントで構成されているようである。

上記の国際出願によれば、ウシ属の胚または胎児の雌雄鑑別法は次のような構成になっている。すなわち１）［１１形成の条件下で、胚または胎児の細胞のＤＮＡに、検出しうるように各々標識をつけた」−記定義の１または数種の雑種形成プローブを接触さけておき、２）胚細胞または胎児細胞のＤＮＡと１つまたは複数の雑種形成プローブとの間に有意な雑種形成がなされることを証明することからなる方法である。

上記ＰＣＴＣ７国際出土れば、雑種形成プローブは、ニックトランスレーンジンにより得られ、胚または胎児のＤＮへの少なくとも４Ｉ！Ｉの胚細胞から得られ、好ましくは少なくとも１０個の胚細胞から得られる。

ＰＣＴ国際出願８６１０７０９５号には、さらに当該種の雄のゲノムバンクからえら゛れるＤＮＡクローンの分離法□が記載されているが、その方法は次のような構成である。すなわち、１）１１　（５ｐｅｃｉｅｓ）の全雄性ＤＮＡと全雌性ＤＮＡとからなる雄性特異的プローブと核酸とで雑種形成することによりで、ゲノムライブラリィ−をスクリーニングして、雄性に特異的なりＮＡセグメントを含むフラグメントと雑種形成するＤＮＡからなるライブラリィ−のクローンを同定し、上記スクリーニングは、ヌク１ノオチドの平均長さが約２０または１０００であるようにランダムに切断された種の全雌性のＤＮＡで予め雑種形成された固体支持体上で行われ、次いで２）上記スクリーニング中に同定され、上記種の全雌性ＤＮＡとよりもかなら多くこの種の全雄性ＤＮＡと雑種形成するＤＮ実際には、性別すべき胚または胎児から取り出した少数個の細胞から得られる歩出の胚ＤＮＡと検出可能な雑種形成ができるようにするには、プローブとして用いられる核酸が放射性原子で標識されるのが好ましく、また上記定義のプローブを２つ結合させて用いるのが好ましい。

３Ｎの雄性に特異的なプローブが得られ、その第１は雄性ウシＤＮＡの５〜６　ｋｂｐのＲｓ＾１フラグメントに相当し、その第２は雄性ウシＤＮＡの４　ｋｂＰのＲｓａｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントに相当し、第３は雄性ウシＤＮＡの２．２ｋｂＰのＥｃｏＲ１フラグメントに相当し、ヌクレオチド中におけるそれらの配列は少なくとも部分的に同定されている。

しかし、プローブ自身の長さのために、このプローブの合成を計画することは困難であり、結局上記ＰＣＴ国際出願には、”特別に°雄性の特異的であり、実際に胚の性別鑑別法に有用であり、明白には同定されなかったこれら配列のセグメントが何であるかについては、何も示されていない。

本願出願人は、哺乳類−特にウシ属−の雄性ゲノムに特異的なりＮＡゲノムの特異的ＤＮＡ分子プローブを単離し、本願発明者はその外に上記分子プローブの合成に成功し、その雑種形成プロフィール（ＥｃｏＲＩで消化された雄性ゲノムＤＮＡと上記プローブとのハイブリッド形成により測定）は、ウシ属の雄性ゲノムに特異的な約７ｋｂのＤＮＡバンドの存在を示し、（及び雌性ゲノムＤＮ、Ａからのバンドは存在せず）・、そのプローブは、ｂ、ｃ、１２の名称で承認されており、４９対の塩基から構成され、その塩基ヌクレオチドの配列は下記（Ａ）の配列かまたは少なくとも１１のヌクレオチドからなる上記配列の７ラグメントである。

このプローブは、本発明者等が１９８６年２月２８日付でフランスで出願したフランス特許順算８６０２８１１号に開示されており、またその用途は、上記出願に開示され、一方１９８６年９月９日付けでフランスで出願したフランス特許順算８６１２６１６号に添付し゛た証明書中にも開示されている。

雄性ゲノムのｔＪ、識の特異性が、フランス特許顎第Ｂ６０２８１１号のプローブを構成する４９のヌクレオチドの配列のセグメント中に同定できるか否かをのべるのを目的とする研究を遂行中に、本頓発明者等は、この配列内で、いくつかの連続したヌクレオチドのセグメントまはフランスが１９８６年２月出願の前記特許出願に記載の雑種形成プロフィールを示し、ウシ属の雄性ゲノムに特異的であることを確認した。長さの短いヌクレオチド配列から構成されるプローブを入手できる可能性があるということは非常に興味深い。何故なら工業的に受容な価格でこのようなプローブの合成が自由にできるからであり、従って、このプローブは完全に純粋でバックグラウンドのノイズの原因とならない。

さらに、本願発明者らは、上記プローブの隣接セグメントの同定に成功し、その結果、隣接セグメントがプローブを増幅することができて、プローブの感度を増し、１００％のオーダーの信頼性で胚の性別の決定を確実に行い、さらにこの決定に必要な時間を短縮することができることを見出した。さらに、本願発明者らは、自らが同定し、合成した雄性に特異的な、長さの短いＤＮへのセグメントまたはフラグメントが、プローブと、隣接セグメントもしくはプライマーとの両方の役割を果たしうろことを確認することができた。

この発明の目的は、それ自体公知の下記式（Ａ）：の４９塩基対のヌクレオチドの配列からなり、反卿哺乳動物の特にウシ属の動物の雄性ゲノムの特異的ＤＮＡセグメントを構成する分子プローブのフラグメントによって構成され、上記フラグメント自体が、前記配列（Ａ）の少なくとも１０の塩基を有し、これらの塩基の中には前記配列（Ａ）の少なくとも５つの連続した塩基が存在することを特徴とする合成オリゴヌクレオチド類およびその相補体または前記ヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有するフラグメントを提供することにある。

この発明の有利な具体例によれば、この発明の合成のオリゴヌクレオチドは、１７の塩基からなり、その中で少なくとも５つの連続した塩基が存在する前記分子プローブ（Ａ）のフラグメントで構成され、かつそれらは下記式（＋）〜（８）に相当することを特徴とする合成オリゴヌクレオチド調並びにそれらの相補体または前記オリゴヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有するフラグメントである。

この発明の他の有利な具体例では、この発明による合成的オリゴヌクレオチドは、各々２０の塩基からなる、下記式（９）〜（ｌで表わされるヌクレオチド配列を有する分子プローブから構成されている合成オリゴヌクレオチド類並びにそれらの相補体、または少なくとも５つの連続ヌクレオチドを有する前記配列のフラグメントまたは前記配列と少なくとも６０％の相同性を有するフラグメントである。

配列（９）は、式（Ａ）の４９ｂｐのプローブのフラグメントで塩基１から塩基２０まで延長したものに相当し、配列（１Ｇ）は式（Ａ）の４９ｂｐのプローブのフラグメントで塩基２１から塩基４０まで延長したものに相当し、配列（！ｌ）は、上記プローブのフラグメントで塩基１１から塩基３０まで塩基したものに相当することを強調する。

１９８５年５月３１日付けで最初に出願された米国特許願の優先権を主張して１９８６年５月３０日に５ａｌｋ　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｄｕｓＬｒｉａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｉａｃ、　（／’５ＩＢＩ＾°と略す）が出願した国際特許１１ＰＣＴ第８６１０７０９５号には、上記のようにウシの細胞から抽出された全く染色体の＞ＤＮＡの一部分の配列が記載され、特にウシ雄性Ｄｌｌ＾の５〜６　ｋｂｐのＲａｍ　Ｉフラグメント及び４　ｋｂｐのＥｅｏＲＩフラグメントのそれぞれからなる配列が記載され、上記の出願は、これら２つのフラグメントからなる部分配列を゛提示した。

本願発明者等は、いくつかのウシＤＩＩＩＡ配列フラグメントを合成し、一方では、これらのフラグメントは、雄性に特異的であり、胚の性別鑑別のための分子プローブを構成するのに適切であり、他方ではプライマーもしくは隣接セグメントの役目をし、その結果、プローブ、特に分子プローブ（Ａ）の役目をするＤＩｌＡ配列のフラグメントを増幅するのに適切であり、またこれらのフラグメントは、フラグメント（１）から（８）及びフラグメント（９）から（１１）のケースで・あって、その各々が、プライマーまたはこれらフラグメントの他のフラグメントの隣接セグメントの役目をうまく果たすことができるが、それらフラグメントは、プローブとして特に上記フラグメントの各々により増幅されるプローブの一部として用いられることを確認することができた。

この発明によれば、ウシＤＮＡ配列の上記フラグメントは下式（１％式％）：５雷ＡＴＣＴＣＡＣＧＣＧＣＴＧＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＣＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣｔＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＡＡＡＦ（２２ンで表されろヌクレオチド配列を有することを特徴とする。

この発明の目的はまた補乳類、特に反茹動物、さらにウシ亜科特にウシ属の雄性ゲノムに特異的なりＮＡの分子プローブの遺伝的増幅法を提供することであり、そのプローブは式（Ａ）のヌクレオチド及び上記（１）〜（２９）の配列の一つを有し、その増幅法は、雑種彩成と、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素延長法ついで変性法を適用し、次いでＰＣｎサイクルと呼ばれるこの雑種形成−延長−変性のサイクルを、用いたサイクル回数に対して指数比率で、スターティング分子プローブを構成する配列の飛を増加させるのに十分な回数（り返すことによって、上記分子プｃ７−ブの両端の各々に上記定義した式（１）〜（２９）の［）ＭＡフラグメント中から適切に選択された隣接配列を固定させる方法である。

上記の補乳類の雄性ゲノムに特異的なりＮＡの分子プローブまたはこれらプローブの隣接セグメントとして有用なウソＤＮＡフラグメント順は、上記のように固定されるが、必要に応じて本発明に従って有利に増幅され、及び放射性同位元素または適切な非放射性物質で適当に標識することができ、フランス特許畷第８６０２１１！１号及び／またはフランス特許願第８６１２８！６号に追加した証明書に記載のように用いて胚または胎児の雌雄鑑別するかまたは精子集団中のＸ染色体の存在をチェックするかまたは人工受精でそれらを利用するためにＸ染色体及びＸ染色体を夫々含Ｈする２つの精子集団に精子を分離することができる。

また、この発明の目的は、式（１）〜（２９）のウシＤＮＡフラグメントまたは式（Ａ）のプローブとｗ＆種杉成によりチェックされ、ＩＮまたは数種のプライマーまたは式（１）〜（２９）の隣接配列に上り増幅されたＸ染色体またはＸ染色体を有する精子フラグメントでげつｔＪｌｉ哺乳類を免疫化することによるモノクローナルまたはボリクａ−ナル抗体の製造法を提供することである。

さらにこの発明の目的は、前記方法で得られた抗体で構成されることを特徴とする免疫試薬であって、この記試薬を得るのに役立ちかつ精子の表面で発現される染色体ＸもしくはＹにょ−て検査される抗にを決定基を認識する特異的な免疫試薬を提供することである。

この発明は、上記特徴の外に、その外の特徴が以下の説明から明らかになる。

またこの発明は、この発明の実施例を参照した以下の説明によって一層よく理解されるであろう。

しかしこれらの実施例は、この発明を例示するためにのみ開示され、この発明を限定するものではないことは理解されねばならない。

分子ブ（１−ブ（Ａ）の少なくと６５−ノの連続塩基を有し′％　Ｆ記載（１）〜（８）のそれぞれ相当するこれら８種の各１７塩基対のオリゴヌクレオチドは、０７５記ヌクレオチドの組成（Ａ）を有する４９ｂｐのセグメントのフラグメントである。

それらの化学合成は、固相ホスホルアミダイト法により、自動合成機’Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｇｔｅ＠ｔｘ”Ｃ”行ツタ□その反応は、各段階で９５〜９７％の効率であるが、中間体のオリゴヌクレオチドの最終生成物（サブフラグメント（１）〜（８））を精製する必要がある。６０ｕＱの水中のオリゴヌクレオチド混合物的７ｗｇが、２０％ポリアクリルアミドゲル＋８Ｍ尿素の電気泳動法（７００Ｖ、３８ｍＡ、３時間）によって分電された。＋７ｓｅｔに対応するバンドを２５４ｎ請の蛍光を発するシリカゲルでコートしたアルミニウムホイル（Ｍｅｒｃｋ）でマークをつけた。

この部分のゲルを切り取り、ＤＮＡを、１．５１の０．５Ｍ　ＣＩｌ、Ｃｏ。

Ｎ１１．溶液＋５５ｌｌＥＤＴＡ中、３７℃で１６時間撹拌して溶離した。

上澄液を約３００μＱまで濃縮し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ１７，５＋　ｌ　ｄｌＥＤＴＡ緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−５０の１０ｃｍＸ　Ｉ　Ｃ＠のカラムのクロマトグラフィによって尿素を除去する。

このようにして単離したＤＮＡを凍結乾燥して一２０℃にて保管する。

フラグメント（１）〜（８）のフラグメントの１０〜２０ｐＭを含有ずろ３ｕＱを、１００ｍＭジチ第１・レイトール（２，５ｕｔ）　、　　１０鋤謔スペルミジン（２，５μＱ）、５００−一トリスー１１Ｃ１温置＠街液（ｐＨ１７，Ｓ）　＋　Ｉ　ＯＯｄ　ＭｇＣＩｔ　（２，５１Ｊ（り、１００ｕＣｉ（ｙ−”ｐ）アデノシン三リン酸−Ａ　’ｒ　Ｐ　３０００　Ｃｉ　／　ａｍｏｌｅ（＾−ｅｒｓｈ＊ｓ）および２０ＵＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で構成された反応混合物２３ｇ１２に添加する。３７℃で３０分間温装した後１反応を２ｄの４００ＭＭ　ＥＤＴＡで停止さｔｔ−Ｆｌｌ識されたオリゴヌクレオチドを、セファデックスＧ−２５のカラムのクロマトグラフィを用いてＡ　’１’　Ｐから分離する。

予備雑種形成と雅種彩フ４）レターもしくはブ（７−）トを、０．９Ｍ　ＮａＣｌ、　５０　園Ｍ　Ｎａ’１ｌＰＯ４ｐｌ＋７．４．５　ｓＭ　ＥＤＴＡ　ＰＨ７，４，５×デンハート、０．３度ｇ／履Ｑの音波処理をして加水分解したサケの精液のＤＮＡおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５ｘＳＳＰＥの混合液で、４２〜６５℃にて１〜４時間予備雑種彩成する。雑種形成は同じ混合物内で行う。”Ｐで放射能標識がつけられ、１００℃で２分間変性された各プローブを雑種形成溶液中に１〜６　Ｘ　Ｉ　Ｏ＠ｐｍ／ｚＱで添加する。

雑種形成は、４０〜６５℃で少なくとも１時間行う。［形成を行った後、フィルターを、２ＸＳＳＣＩＩ衝液＋０．５％ＳＤＳ中、４５℃にて３０分間、１回もしくは２回洗浄する。次にフィルターを’　ＣＲＯＮＥＸ’　（ＤＵＦＯＮＴ）補力器（ｉｎＬｅｎｓｉｒｉｅｒ）付きの力　。

セット内に入れ、オートラジオグラフィ用のコダックＸＡＲ−５フィルムに一７０℃で１−１６時間接触させろ。

下記式（９）〜（１１）に各々に相当するこれら３つの２０塩基対のオリゴヌクレオチドは、式（Ａ）の４９塩基対の配列のフラグメントであり、配列（９）は配列（八）の１〜２０の塩基からなり、配列（１０）は前記配列（Ａ）の２１〜４０の塩基からなり、配列（ｌｌ）は前記配列（Ａ）のＩＩ〜３０の塩基で構成されている。

フラグメント（９）〜（１１）の合成は、配列（Ａ）をモデルにして行った。

Σ、　　　　　　　　　Σ。

Ａ？ＣＡＧτＧＣＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＡ？　　　　（９）Σ、　　　　　　　　　Σ。

ＧＴＧＣ？ＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧ？！で＾？　　　　　　　（１０）この化学合成は、’Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｌＢ１１５ｙｓＬｅ自動合成機を用い固相ホスホルアミダイト法で行った。

反応は各プローブについて９５〜９７％の効率であったが、中間体のオリゴヌクレオチドから最終生成物（サブフラグメント（９）〜（１１）　−２０＊ｅｒ）を精製する必要があった。６０μＣの水中のオリゴヌクレオチド混合物的７ｍｇが２０％ポリアクリルアミドゲル＋８Ｍ尿素の電気泳動法（７００Ｖ、３８餉Ａ、　３時間）によって分離された。２０＊ｅｒに対応するバンドを、２５４　ｎｓの蛍光を発するシリカゲルでコートしたアルミニウムホイル（箇ｅｒｃｋ　）で印を付けた。この部分のゲルを切り取り、ＤＮＡを１．５ＭＩＱの０．５Ｍ　Ｃｌｌ５ＣＯＯＮｌｌ、＋　６ｔＭ　ＥＤＴＡ中、３７℃で１６時間撹拌して溶離する。

上澄液を約３００μＣまで濃縮し、ｌ０ｓｌｉ）リス−〇〇ＩＰ１１７．５＋　Ｉ　ａｍ　ｇｏｒＡｓｉ衝液で平衡化したセファデックスＧ−５０（Ｐｈａｒｇｌａｃｉａ）のｌ０ｃｓＸＩｃｓ＋のカラムのクロマトグラフィによって尿素を除去する。このようにして単離したＤＮＡを凍結乾燥して一２０℃で保管する。

合成の＜−Ｖａ鎖）フラグメント（９）〜（１０）の放射能標識化（”Ｐ）フラグメント（９）〜（１８）のフラグメントの１０＝２　ｏｐ謔を含有ｔ４３ｕＱ＋、１００ｍ１ＨＪチｆ　トレ４　）−ｋ　（２，ｈａ）、１０會謔スヘルミジン（２，５ｕ１２）　、５００ｇ＋Ｍ）　！Ｊ　Ｘ　−１１，Ｃｌ　ｍＫ緩衝液（ｐＨ７，５）　＋　１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　（２，Ｓｕ＆）、ｔ　Ｏ０ｇＣ１（”ｐ　）アデノシン三リン酸−Ａ　Ｔ　Ｐ　３０００Ｃｉ／　ｇａｏｌｅ　（Ａａｅｒｓｈａ＠）および２０ＵＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で構成された反応混合物２３μｅに添加する。３７℃で３０分間温装した後、反応を２μｇの４００ｔＭ　ＥＤＴＡで停止させ、標識されたオリゴヌクレオチドを、セファデックスＧ−２５のカラムのクロマトグラフィを用いてＡＴＰから分離する。

フィルターもしくはブＣ７−ＩＴトを、０．９Ｍ　ＮａＣ１，５０ｓＭ　ＸａｌｌＰＯ−ｐＨ７，４，５ｔＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，４，５ｘデンハート、０．３ｍｇ／履Ｑの音波処理をして加水分解したサケの精液のＤＮＡおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５ｘＳＳＰＨの混合物で、５５℃にて４時間予１１１１１Ｎ形成をさせた。雑種形成は同じ混合物で行う。

ＩＰで放射能標識がつけられ、１００℃で２分間変性された各フラグメントを雑種形成溶液中に１〜２ＸＩＯ＠ｃｐ鋤／酎で添加する。

雑種形成は、５５℃で少なくとも置時間行う。雑種形成を行った後、フィルターを、６　ｘ　ＳＳＣ＋０．１％５ＤＳＩＩＩ衝液中、６５℃にて２０分間、１回もしくは２回洗浄する。次にフィルターを”ＣＲＯＮＥＸ″　（ＤＵＰＯＩＩＴ　）補力１！　（１ｎｔｅｎｓＨｉｅｒ）付きのカセット内に入れ、オートラジオグラフィ用のコダックｘＡＲ−５フィルムに一７０℃で７〜３６時（１！１接触させる。

衷講−ｆＲＩ　３−衣Ω■砂」道力生魚球オリゴヌクレオチド佑ワλ」（（ビ噴 −実施−Ｈに記載の方法で式（１２）〜（２９）のＤ　Ｎ　Ａフラグメントを製造する。

Ａ、細胞の製造使用した細胞は、懐胎期間７〜Ｂ　Ｃｌ令のウシ胚由来のものである。ｄｉｓｓＨｕａＬｅシた後、細胞をスライド上にデポジットさせ、アルコール−酢酸混合物（３：Ｉ　ｖ／ｖ）のような固定溶液中に１０〜１５分間保持し、空気乾燥する。得られたスライドを直ちに使用するか、または後で性別決定する場合には、４℃でちりがかからないようにして保管する。

Ｂ１式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントのビオチニル化前記フラグメントのビオチニル化は、ビオチニル化ｄ　１ｌＴＰまたは他のビオチニル化デオキンヌクレオチドを、末端転移酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によって、３°末端に付加することによって行う。前記の合成フラグメントのそれぞれ１０〜２０ｐ− を、Ｉ４０餉誦のカコジル酸ナトリウム、３〇−謔トリス−ＩＩＣＩ　ｐＨ７，ｓ、０．１１１菫ジチオトレイトール、Ｉ　ｓＭ　ＣｏＣ１１＋　０．０２ｓｋｌのビオチニル化ｄＵＴＰおよび１ｍ２単位の末端転移酵素で構成された反応混合物１００ｗＧに添加する。

３７℃で１時間温置した後、標識をつけたオリゴヌクレオチドをスーパーファインセファデックス２５のカラムのクロ゛マドグラフィで分離する。

Ｃ，スライド上で雑種形成法スライドを９〜１００ｕ１２の雑種形成液とともに装置し、プラスチックフィルＪ１でコートオろく蒸発をさけろため）。１００℃のオーブン内で１０分間かけて変性した後、スライドを湿り室内におき、５５℃で＋６６時間温置る。

雑Ｎ彩成液の最終組成は次のとおりである。

０．９ｍ　ＮｍＣｌ５５Ｍ　ＥＤＴ＾Ｓｏｄ　！１ａｌｌＰｏ、　ｐＨ７，４５ｘデンハート０．５％ＳＤＳ［５×デンハート＝０．１％ＢＳ＾もしくはＯ，ｊ％脱脂粉乳＝０．１％ポリビニルピロリドン：０．１％フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）　］プラスチックフィルムを取外した後、スライドを、６ＸＳＣＣ溶液（２Ｘ３０分、５５℃）、次ｔ、：ｏ、ｔ％ｖ／ｖノ）リド７Ｘ−１００とＯ，Ｓ％（Ｐ／Ｖ）の脱脂粉乳（ＲｅｇｉｌｓｉＬ）で補充したＰＢＳ　ｐｌ（７，４で順に洗浄する。

Ｄ、展開余分の液体を除去した後、まだ濡れているスライドを、ヤギ抗体アンチビオチンまたはラビット抗体アンチビオチンとともに３７℃で１時間温置ずろ。この抗体を、アフイニテイクロマトグラフィー（Ｖｅｃｔｏｒ　ＬａｂｏｒａＬｏｉｅｓ　ｒｅｒ、　５Ｐ−３０００）で精製し、ＰＢＳ　ＰＨ７，４＋Ｏ，１％　（Ｖ／Ｖ）　ト’）　ト：／Ｘ　−＋００＋０．５％　（Ｐ／Ｖ）脱脂粉乳でＩ：３５０に希釈して我々の試験に用いる。

ＰＢＳ　ｐ）ｌ？、４＋０．１％　（Ｖ／Ｖ）　）　ＩＪ　）　：／Ｘ　−１００＋０．５％　（Ｐ／Ｙ）脱脂粉乳中で、室温にて１５分Ｕ洗浄した後、スライドをＰＢＳｐ８７．４＋　）リドン０．１％＋０．５脱脂粉乳で１＝４０に希釈したベルオキダーゼ（Ｂｉｏｓｙｓ　ｒｅｒ、　Ｂ！　２４０３）を結合させた通常のラビット抗ヤギ抗体または抗ラビットヤギとともに１時間３７℃で装置する。

次にスライドを、０．１％（Ｖ／Ｖ）のトウイーン２０を含有のＰＢＳｐ８７．４中で１５分間２回洗浄し、最後にＰＢＳ　ｐＨ７，４中で５分間洗浄する。

室温で５〜８分間温置装た後、さらにＨｏｏｔ　０．０１％を含有するＰＢＳ　ｐＨ７，４による０、５＋ｇ／ｇ１２のジアミノベンジジン溶液（ＤＡＢＳＩＧＭＡ　Ｒｅｒ、　Ｄ８Ｇ０１）で処理する。

ペルオキシダーゼの作用でＤＡＢ上に形成された沈澱を、ＢＵＲ）ｉｓらが報告した方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　１９８Ｓ年、３５巻、　１０８５〜１０９２頁）によって金と銀の塩の連続沈澱法で増幅する。

最初の段階では、Ｎａ　（ＮａＡｕＣＩ　ＢＤＩＩ　ｒｅｒ、　３０１２５２Ｒ）の２．５ｍＭ溶液をスライド当り５〜１ｏｏｕ１２のせて、５分間室温で放置する。

蒸留水で５分間洗浄後、スライドを硫化ナトリウム（ＳＩＧＩＩＡ　Ｒｅｒ。

３２００Ｂ）の５Ｏ−１００ｕ１７とともに室温で５分間保持し、蒸留水で５分間すすぎ、次いで１００〜３００ｕＱの銀試薬とともに４〜８分間保持する。銀試薬の組成は次のとおりである。

Ａ　　炭酸ナトリウム　　　　　０．２４Ｍ　（ＳＩＧＭＡ　ｒｅｒ、　３４１３２）ＢＩＩｉｌ！酸アンモニウム　　　　１３＋＋Ｍ　（ＳＩＧ−＾ｒｅｒ、＾９６４２）Ｂ２　硝酸銀　　　　　　　　　６ｍＭ　（ＢＤＩＩ　ｒｅｒ、　３０３８７３Ｎ）Ｂ３　ドデカタングストケイ酸　１．５ｍＭ　（ＢＤＩＩ　ｒｅ（３０Ｓ４５３Ｒ）Ｂ４　ホルムアルデヒド３７％　　０．６ｕＱ／ｘＱ　（ＳＩＧＭＡ　ｒｅｒ、　ＦＩ６３５）銀試薬は、溶液［３ｍ　−８２−８３−８４を撹拌しながら順に混合して製造する。得られた混合物を溶液Ａに１：ｌで添加し、えらたれ試薬を直ちに使用する。

スライドを銀試薬で処理した後、蒸留水で１５分間洗浄し次いで１％（Ｖ／Ｖ）の酢酸中で１５分間、２回洗浄し、ビロニンＹ　（ｒ’ｙｒｏｎｉｎ　Ｙ）　（Ｓｉｇｇ＋ａ　ｒｅｒ、　ｒ’７０１７）　１％水溶液中で１分間染色し、蒸留水で数秒間ですずき、熱風乾燥し、ＤＰＸに取付ける。

ウシ精子集団の分離性能の制御細胞の製造使用した細胞は、液体窒素中で凍結し保管したウシの精子である。ひとつの小フレークを解凍して約１３．ｏｏｏ、ｏｏｏの生きた精子が得られる。フレークは３０秒間３７℃で再加熱し、次−１で精子を１１の滅菌ＰＢＳで希釈する。凍結剤を最大限に取除くために一連の遠心分離を行う。まず精子のＰＢＳによる懸濁物を、１０分間５００＠で遠心分離し、上澄み液を吸引して取出し、精子を再びＩｚＱのＯ，１１Ｍクエン酸ナトリウムに入れる。得られ゛た液を１０分間５００ｇに遠心分離する。上澄み液を吸引して取出し、再度０．１１Ｍクエン酸ナトリウム＋５％ＤＩＩＳＯの１１１２中に入れ、　５００ｇで１０分間遠心分離する。上澄み液を吸引して取出し、精子を０．１１Ｍクエン酸ナトリウム＋１５％ＤＭＳＯのＩＲａ中に再懸濁させる。得られた液を１０分間５００９で遠心分離する。上澄み液を吸引して取出し、精子を０．１１Ｍクエン酸ナトリウム＋５０％ＤＩＩＳＯのＩ＋ｙＱに再懸濁する。これを１０分間５００９で遠心分離する。

上澄み液を吸収してのぞく。精子をＯ，ｌ１Ｍクエン酸ナトリウム（トリス−１１ｃＩ　Ｏ，ＩＭ　ｐＨ７，４中）の１１に再懸濁させＩＯ＠ｉｎ５００ｇで遠心分離するゎ上澄み液を吸引して除き、精子を上記と同じ緩衝液２５０μＱに再＠濁させる。

この段階で、細胞は、スライド上にデポジットされ（スライド当り３０〜４０μ Ｑの精子懸濁液）、その場で、式（１）〜（２９）のビオチニル化プローブの１っでｖ１ｆ！Ｉｉ形成させろ処理を行うか、またはフィルター−（二にデポジットさけ、放射性ヌクレオチドで標識をつけた式０）〜（２９）のプローブの１つでドツトプロット法により雑種形成を行う。

生体外での遺伝子の増幅法は、オリゴヌクレオチドの“ブライマー゛によるプローブの雑種形成の逐次サイクルに基づいた方法である（この“プライマー”は隣接セグメント（ｆｌａｎｋｉｎｇｓａｇ＠ｅｎＬ　）であり、具体的にいえば、この式（１）〜（２９）のフラグメントいずれかひとつであり、これはＤＮＡボリメラー′ゼ酵素と変性、例えばＰ　ＣＩｉ　（１’ｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）と１デばれる方法による前記“ブライマー２からのエクステンション（ｅｘｔｃｎｉｉｏｎ）である。なお上記ＰＣＲはＣＥＴＵＳ　Ｃ０ＲＰ（’ＩＲＡＴＩＯＩＩ　ＣＯＭＰ＾ＮＹが発表している（Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　５ｙｓｐｏｓｉａｏｎ　ＱｕａｎｔｉＬｓＬｉｎｅ　ｌｌｉｏｌｏｇｙ　　Ｉ　−Ｉ　Ｑ、１９８６年、２６３〜２７２頁を特に参照）。

生検細胞を、１０μｌのＰｎＳの入った微小管内にデポジットし、３５μｍの水を加え、次いで微小管を９５℃で１０分間静置し、細胞を溶解し、ＤＮＡを変性する。得られたライゼートに、５５μｍのｐｃｒｔｇ衝液（５０ｍＭ　ＫＣｌ、　　Ｉ　ＯｍＭ　トリスｐ−ｔ１８．３．８ｍＭ　　ＭｇＣｌ＊、プローブの一方の末端に固定されるブライマーＡの１ＮＭ１プローブの他方端に固定されるプライマーＢのＩ　μｍＭ、１．５ｍＭのＡＴＰ、１．５ｍＭのｄＣＴＰ、１．５ｍＭのｄＴ’ｌ’Ｐ、１．５ｍＭのｄ　Ｇ　ＴＰ　）を添加する。次に試料を２分間適切な温度にして、プライマーを固定する。ストランドのエクステンションは、４単位の°Ｔａｑポリメラーゼ°（ＣＥＴＵＳ　Ｃｏ）ＩＰＯＲＡＴＩＯＮ）を加え、６９℃で２分間温度することによって開始される。このサイクルを３０〜４０回繰り返す。

得られた試料を０．４Ｎ　　Ｎａ０Ｉ１．２５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液で変性し、ナイロン膜上に、手動かまたはドツトプロット法でデポジットさせる。このサイクルを３０〜４０回繰り返すと、適正なプローブを構成する開始配列の飛がｌＸｌ０’１倍に増加する・。次に膜を中和し、８０℃で乾燥し、緩衝液５ｘＳＳＩ ’Ｅ、５×デンハート及びポリヌクレオチド−キナーゼ酵素によりＸ／＋γ゛３ ′ＰＡ　ｉ”　Ｐで５°末端に放射性標識をつけたプローブを含有ずろ０゜５％ＳＤＳを用いて、プライマーによって４０℃もしくは６５℃で予備雑種形成と雑種形成が行われる。プローブ（４９ｓｅｒもしくは１７＊ｅｒもしくは２０＊ｅｒ）は放射性がまたはビオチンもしくは他の非放射性の化合物で標識がつけられている。雑種形成は４０〜６０℃にて１時間行われる。次いで膜を室温にて２ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄し、次に同じ緩衝剤で１０分間４５℃で洗浄される。放射性プローブについて、補力スクリーンで、３０分間〜１０時間− ８０”Ｃで、オートラジオグラフィを実施する。非放射性のプローブについては、＊　Ｎ形成の証明は、上記実施例３に記載された一連の免疫細胞化学反応によって行われる。

ブライマーＡとＢがそれぞれ下記式（７）と（１）のフラグメントである具体例の場合は、ＰＣＲサクイルは次のしかたで進行する。

前述のように、生検細胞を、１０μｌ２ＰＢＳの入った微小管内にデポジットさせて水３５μＣを加える。しかしこの管は９５℃に２分間だけ保持し、試料を５５℃で２分間に変えること以外は置を６９℃で２分間行いこのサイクルを４０回繰り返す。他のブライマーによる場合−Ｔａｑ　Ｐｏ！ｙｍｅｒａｓｅ”との温度は、例えば約３７℃の低温で行うか、またはあるサイクルをこの温度で温度し他のサイクルは５５℃で温度され、その期間は、使用するプライマーによって適切にわずかに長くするか短くする。

用いられるプローブは、式（１）〜（２９）のプローブもしくはフラグメントから選択されたプローブである。例えば、式（７）と（１）のプライマーとともに下記式（４）のプローブを用いることができる。・・５’　　　　　　　　　５＠ＡＧＡＴＧ？ＧＣ？ＣＣＡＡＧＧＡＧ　　（４上記の場合、予備雑種形成は、雑種形成と同様に６５℃で実施される。この系では、非常に弱い雌性のシグナルとは別のひとつの非常に強い雄性シグナルが得られ、これはオートラジオグラフィで３０分後に１２５ピコグラムのＤＮＡ　（すなわち２５の細胞と当ＩＩ）から始まり直接には５０の雄性細胞を有する細胞から始まる。

例えば、プローブとしては、式（２）と（３）のフラグメントを、式（８）と（５）のそれぞれのブライマーと用いることにより、同様のしかたで、特異的な雄性シグナルが１２５ピコグラムのＤＮＡからマ曙られる。

上記の説明では、ウシ胚の性別の決定、精子集団中のＹ染色体の存在の検査および精子集団を人工受精用に利用するためにこれをＹ染色体とＸ染色体をそれぞれ含有する２グループ゛に分離することを目的として、式（１）〜（２９）のプローブが演じる役割を特に考慮したが、その外の動物が前記ウシ胚のＤＮＡ配列と同様の雄性の特異的なりＮＡ配列を示す場合は、上記の役割はこれらの動物に拡大できることは容易に理解されるであろう。

同様に先に説明した式（１）〜（２９）のプローブの役割は、単に非限定の実施例として述べただけで、雄性の他の特異的な配列の検査に拡げることかできろ。

したがつて先に述べたように、この発明はこれらの実施！！３＋様とより明確にのべた用途にのみ限定されるものではなく、当業者がこの発明の範囲を逸脱することなく行える改変はすべて包含するものである。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）／平成２年　２月２７日イ特許庁長官　吉　１）文　教　殿！、特許出願の表示ＰＣＴ／ＦＲ８８１００４２７／的な分子プローブと、これらプローブを増幅させるための隣接配列と、　　前記プローブの用途。２３、特許出願人住　所　　フランス、　７５００７　　パリ、ルユ　ドウ　グルネル　１４９− ５、補正書の提出年月日＋１　ｔｔ峯　”ＩＪ、ｚ’ｌａ６、添付書類の目録補正書の翻訳文７、前記以外の特許出願人（１）住　所　　フランス、７５７２４　　パリ　セデス　１５、フエデラシオン　２９−３３　　　　　　−名　称　　　コミサリア　ア　レネルジー　アトミック請求の範囲の４９塩屑対のヌクレオチドの配列からなり、反鐸哺乳動物の特にウシ属の動物の雄性ゲノムの特異的ＤＮＡセグメントを構成する分子プローブのフラグメントによって構成され、上記フラグメント自体が、前記配列（八）の少なくともＩＯの塩基を有し、これらの塩基の中には前記配列（Ａ）の少なくとも５つの連続した塩基が存在することを特徴とする合成オリゴヌクレオチド類およびその相補体または前記ヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有するフラグメント。

２．１７の塩基からなり、その中で少なくとも５つの連続した塩基が存在する前記分子プローブ（Ａ）のフラグメントで横に相当することを特徴とする請求項目こよる合成オリゴヌクレオチド類並びにそれらの相補体または前記オリゴヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有するフラグメント。

３、各々２０の塩基からなる、下記式（９）〜（１１）で表わされるヌクレオチド配列を有する分子プローブから構成されている請求項里または２による合成オリゴヌクレオチド類並びにそれらの相補体、または少なくとも５つの連続ヌクレオチドを有する前記配列のフラグメントまたは前記配列と少なくと６６０％の相同性を有するフラグメント。

４、増幅を目的として、請求項１〜３のいずれか１つのヌクレオチドの両端に連結されろよう構成された、反部哺乳類の特にウシ属の雄性ゲノムに特異的なりＮＡフラグメントで＋ＭＩｉＲされ、前記フラグメントが下記式（Ｉ２）〜（２９）　：で表わされるヌクレオチド配列を有することを特徴とする合成オリゴヌクレオチド類。

５、プローブが、上記請求項１〜４のいずれか菖つのヌクレオチド配列（Ａ）または式（１）〜（２９）の１つを有し、哺乳類の特に反部動物、さらに詳しくはウシの亜科、具体的にウシ属の雄性ゲノムに特異的なりＮＡ分子プローブの遺伝子増幅法であって：請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントから適切に選択された隣接配列を、雑種形成法、次いでＤＮＡポリメラーゼによる酵素延長法、次に変性法を適用して、前記分子プローブの各両端それぞれに固定し、ＰＣＲという名称で知られている上記の１１？！形成−延長−変性のサイクルを、利用するサイクルの数に対して指数比率で、スターティング分子プローブを構成する配列の量を増大するのに充分な回数繰返すことを特徴とする増幅法。

６、放射性同位元素または適切な非放射性物質によって有利に標識をつけた請求項１〜４のいずれか１つの式（１）＝（２９）の１）　Ｎ　Ａフラグメントの、反ｖ６Ｉｉ！ｉ乳動物、特にウシ亜科、および特にウシ属の胚もしくは胎児の性別を決定する分子プローブとしての用途。

７、放射性同位元素または適切な非放射性物質によって有−１に標識を付けた請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、精子集団中のＸ染色体の存在を検査するための分子プローブとしての用途。

８、放射性同位元素またはａ切な非放射性物質によって有利に標識を付けた請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、人口受精に用いるのを目的とした、Ｘ染色体とＸ染色体をそれぞれもっている２つの精子集団への精子の分離を検査するための分子プローブとしての用途。

９゜有利にかつ適切にＷＡ議をつけられ、かつ請求項Ｉ〜４のいずれ力臼っの式（＋）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの１つもしくはいくつかによって増幅された請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、反部哺乳動物、特にウシ亜科および特にウシ属の胚らしくは胎児の性別を決定するための用途。

１０、有利にかつ適切に標識をつけられ、かつ請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの１つもしくはいくつかによって増幅された請求項１〜４のいずれか！っの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、精子集団中のＸ染色体の存在を検査するための用途。

目、有利にかつ適切に標識をつけられ、かつ請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの１つらしくはいくつかによって増幅された請求項１〜４のいずれか１つの式Ｏ）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、人口受精に用いるのを目的とした、Ｘ染色体とＸ染色体をそれぞれもっている２つの精子集団に精子を分離するための用途。

１２、請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントによる雑種形成によって検査されたＹもしくはＸの染色体を存する精子の画分でげつＩａｌｌ？乳動物を免疫化することによる、Ｙ染色体とＸ染色体をそれぞれ有する２つの精子集団に精子を分離ケるのを検査するために用いるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の製造方法。

１３、請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントによる雑ｔｉ影成、または請求項１〜４のいずれか１−ンの式（１）〜（２９）の１つもしくはいくつかのＤＮＡフラグメントで増幅された式（Ａ）のプローブで検査されたＹもしくはＸ染色体を有する精子画分によって、げつ歯補乳動物を免疫化することによる、Ｙ染色体とＸ染色体をそれぞれ有する２つの精子集団に精子を分離するのを検査するために用いるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の製造方法。

１４、請求項！２もしくは１３の方法により、必要に応じて精強して得られることを特徴とする、Ｙ染色体とＸ染色体をそれぞれ有する２つの精子集団に精子を分離するのを検査するために用いろモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体。

＋５．請求項１４のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体によって構成されていることを特徴とする免疫試薬であって、前記試薬を得るのに役立らかつ精子の表面で発現される染色体ＸもしくはＹによって検査されろ抗原決定基を、認識する特異的な免疫試薬。

国際調査報告ｍｌ　幻＃ａｔｗｓ　Ｈａにτ／ＦＲＢＢ１００４２７　　　　　　．２国際調査報告ＦＲ８８００４２７Ｓ＾　２４０６９

Claims

【特許請求の範囲】１．それ自体公知の下記式（Ａ）：【配列があります】（Ａ）の４９塩基対のヌクレオチドの配列からなり、反芻哺乳動物の特にウシ属の動物の雄性ゲノムの特異的ＤＮＡセグメントを構成する分子プローブのフラグメントによって構成され、上記フラグメント自体が、前記配列（Ａ）の少なくとも１０の塩基を有し、これらの塩基の中には前記配列（Ａ）の少なくとも５つの連続した塩基が存在することを特徴とする合成オリゴヌクレオチド類およびその相補体または前記ヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有するフラグメント。２．１７の塩基からなり、その中で少なくとも５つの連続した塩基が存在する前記分子プローブ（Ａ）のフラグメントで構成され、かつそれらは下記式（１）〜（８）（１）【配列があります】（５）【配列があります】（２）【配列があります】（６）【配列があります】（３）【配列があります】（７）【配列があります】（４）【配列があります】（８）【配列があります】に相当することを特徴とする請求項１による合成オリゴヌクレオチド類並びにそれらの相補体または前記オリゴヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有するフラグメント。（３）各々２０の塩基からなる、下記式（９）〜（１１）（９）【配列があります】（１０）【配列があります】（１１）【配列があります】で表わされるヌクレオチド配列を有する分子プローブから構成されている請求項１または２による合成オリゴヌクレオチド類並びにそれらの相補体、または少なくとも５つの連続ヌクレオチドを有する前記配列のフラグメントまたは前記配列と少なくとも６０％の相同性を有するフラグメント。４．反芻哺乳類の特にウシ属の雄性ゲノムに特異的なＤＮＡフラグメントで構成され、前記フラグメントが下記式（１２）〜（２９）：【配列があります】（１２）【配列があります】（１３）【配列があります】（１４）【配列があります】（１５）【配列があります】（１６）【配列があります】（１７）【配列があります】（１８）【配列があります】（１９）【配列があります】（２０）【配列があります】（２１）【配列があります】（２２）【配列があります】（２３）【配列があります】（２４）【配列があります】（２５）【配列があります】（２６）【配列があります】（２７）【配列があります】（２８）【配列があります】（２９）で表わされるヌクレオチド配列を有することを特徴とする合成オリゴヌクレオチド類。５．プローブが、上記請求項１〜４のいずれか１つのヌクレオチド配列（Ａ）または式（１）〜（２９）の１つを有し、哺乳類の特に反芻動物、さらに詳しくはウシの亜料、具体的にウシ属の雄性ゲノムに特異的なＤＮＡ分子プローブの遺伝子増幅法であって：請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントから適切に選択された隣接配列を、雑種形成法、次いでＤＮＡポリメラーゼによる酵素延長法、次に変性法を適用して、前記分子プローブの各両端それぞれに固定し、ＰＣＲという名称で知られている上記の雑種形成−延長−変性のサイクルを、利用するサイクルの数に対して指数比率で、スターティング分子プローブを構成する配列の量を増大するのに充分な回数繰返すことを特徴とする増幅法。６．放射性同位元素または適切な非放射性物質によって有利に標識をつけた請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、反芻哺乳動物、特にウシ亜料、および特にウシ属の胚もしくは胎児の性別を決定する分子プローブとしての用途。７．放射性同位元素または適切な非放射性物質によって有利に標識を付けた請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、精子集団中のＹ染色体の存在を検査するための分子プローブとしての用途。８．放射性同位元素または適切な非放射性物質によって有利に標識を付けた請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、人口受精に用いるのを目的とした、Ｙ染色体とＸ染色体をそれぞれもっている２つの精子集団への精子の分離するための分子プローブとしての用途。９．有利にかつ適切に標識をつけられ、かつ請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの１つもしくはいくつかによって増幅された請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、反芻哺乳動物、特にウシ亜料および特にウシ属の胚もしくは胎児の性別を決定するための用途。１０．有利にかつ適切に標識をつけられ、かつ請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの１つもしくはいくつかによって増幅された請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、精子集団中のＹ染色体の存在を検査するための用途。１１．有利にかつ適切に標識をつけられ、かつ請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの１つもしくはいくつかによって増幅された請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントの、人口受精に用いるのを目的とした、Ｙ染色体とＸ染色体をそれぞれもっている２つの精子集団に精子を分離するための用途。１２．請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントによる雑種形成によって検査されたＹもしくはＸの染色体を有する精子の画分でげつ歯哺乳動物を免疫化することによる、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体の製造方法。１３．請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）のＤＮＡフラグメントによる雑種形成、または請求項１〜４のいずれか１つの式（１）〜（２９）の１つもしくはいくつかのＤＮＡフラグメントで増幅された式（Ａ）のプローブで検査されたＹもしくはＸ染色体を有する精子画分によって、げつ歯哺乳動物を免疫化することによる、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体の製造方法。１４．請求項１２もしくは１３の方法により、必要に応じて精製して得られることを特徴とする、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体。１５．請求項１４のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体によって構成されていることを特徴とする免疫試薬であって、前記反応を得るのに役立ちかつ精子の表面で発現される染色体ＸもしくはＹによって検査される抗原決定基を、認識する特異的な免疫試薬。