FR2952071A1 - Procede d'hybridation soustractive entre deux populations d'acide nucleiques - Google Patents
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Abstract
La présente invention a essentiellement pour objet un nouveau procédé d'hybridation soustractive permettant d'enrichir en séquences spécifiques un répertoire d'acides nucléiques correspondant à un état donné ou « répertoire test », en comparaison avec un répertoire correspondant à un état de référence ou « répertoire de référence » , ainsi qu'un kit d'enrichissement.
Description
La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire, et en particulier les techniques d'hybridation soustractive. Plus précisément, la présente invention a essentiellement pour objet un nouveau procédé d'hybridation soustractive permettant d'enrichir en séquences spécifiques un répertoire d'acides nucléiques correspondant à un état donné ou « répertoire test », en comparaison avec un répertoire correspondant à un état de référence ou « répertoire de référence » , ainsi qu'un kit d'enrichissement. En particulier le procédé de l'invention fait appel à une méthode d'hybridation soustractive originale qui permet de réduire significativement le nombre de clones à analyser du fait de l'enrichissement en clones spécifiques d'un état donné. Elle repose sur les particularités de la forme génomique sous laquelle se présente le répertoire test, à savoir circulaire simple brin, et sur la capacité des cellules hôtes, réelles effectrices de la soustraction, à gérer différentiellement les molécules circulaires simple brin versus les molécules linéarisées.
Les banques de peptides aléatoires obtenues par insertion d'une séquence codante aléatoire pour présenter en surface le peptide correspondant, sont des outils puissants pour l'identification de peptides capables de mimer des interactions parmi une gamme de molécules biologiques. Les banques générées consistent en des millions de clones indépendants, chacun portant un peptide particulier. Cette approche a démontré son efficacité en identifiant des peptides qui interagissent spécifiquement avec une gamme de molécules telles que des anticorps, des récepteurs cellulaires, et de l'ADN. Dans le cas de répertoires moléculaires complexes, l'exploitation est difficile à mettre en pratique sans de lourds investissements pour le séquençage de clones, notamment pour l'identification de clones peu représentés dans le répertoire qui souvent sont les clones d'intérêt. La complexité est encore augmentée quand il s'agit de comparer deux répertoires correspondant à des sélections réalisées par exemple sur des tissus sains et pathologiques, où les nombreux clones d'intérêt sont ceux spécifiques des altérations caractérisant un état particulier, comme une maladie par exemple. L'hybridation soustractive est une expression générale qui recouvre un ensemble de technologies d'hybridation dont le but est d'amplifier les différences entre deux populations en éliminant les éléments communs et/ou en sélectionnant les éléments différents.
Les hybridations soustractives sont largement utilisées pour comparer deux répertoires d'acides nucléiques, mais elles sont essentiellement limitées à des fragments d'ADN relativement longs. La faible température de fusion des séquences d'ADN courtes (< 50 nt) rend difficile, voire impossible l'utilisation des techniques d'hybridation soustractive habituelles, et les étapes nécessaires pour soustraire physiquement les molécules communes entre les deux populations d'ADN en comparaison défavorise l'isolement des clones faiblement représentés. La présente invention permet notamment de résoudre ces problèmes en utilisant le répertoire test sous forme de génome circulaire simple brin.
L'invention permet en outre d'éviter toute extraction des molécules indésirables du mélange réactionnel du fait de l'utilisation d'une ou plusieurs enzyme(s) de restriction qui conduit à la linéarisation des hybrides qui sont parfaitement homologues entre les clones du répertoire test et du répertoire de référence (dits « homohybrides » car ils correspondent aux clones présents à la fois dans le répertoire test et le répertoire de référence). En effet, ces « homohybrides » ne peuvent pas être répliqués et propagés dans les cellules hôtes. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé d'hybridation soustractive permettant l'enrichissement en séquences spécifiques d'un répertoire d'acides nucléiques correspondant à un état donné dit « répertoire test », en comparaison avec un répertoire correspondant à un état de référence dit « répertoire de référence », comprenant les étapes consistant à : a) obtenir les ADNs des répertoires à comparer de manière à : - disposer d'au moins une portion d'ADN comprenant la cassette globale pour chacun des répertoires, - obtenir le répertoire test sous forme d'ADN circulaire simple brin, et - disposer au moins du brin anti-parallèle de celui du répertoire test à partir du répertoire de référence ; b) hybrider les ADNs des répertoires à comparer obtenus à l'étape a) dans des conditions de températures d'hybridation et de dénaturation supérieure à la température de fusion des domaines encadrant la cassette de séquence variable et inférieure à la température de fusion des « homohybrides » ; c) ajouter une ou plusieurs endonucléase(s) de restriction dont le site de clivage est présent dans la portion d'ADN comprenant la cassette globale pour chacun des répertoires qui est obtenue à l'étape a) ;
d) incuber le mélange d'hybrides dans des conditions où l'endonucléase de restriction est active pour conduire à l'hydrolyse des « homohybrides » ; e) transformer des cellules hôtes avec ledit mélange et cultiver les cellules transformées dans des conditions où les vecteurs qui contiennent les molécules du répertoire test peuvent se multiplier et se propager dans lesdites cellules hôtes ; f) récupérer les vecteurs «intègres » qui contiennent les molécules du répertoire test enrichi en clones spécifiques, et éventuellement concentrer lesdits vecteurs. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre à partir du moment où l'on veut comparer 2 répertoires correspondant à des états différents (par exemple sain versus pathologique, avant traitement versus avec traitement, différents stades développementaux, étapes de différenciation cellulaire, tumeur primaire versus tissus métastatiques, etc.... La présente invention trouve principalement application pour l'identification de séquences spécifiques d'un état donné, ce qui permet d'identifier des molécules impliquées dans le développement de différentes pathologies, désordres ou états particuliers et éventuellement utilisables pour leur diagnostic. Le procédé de l'invention fait appel à une méthode d'hybridation soustractive originale qui permet de réduire significativement le nombre de clones à analyser du fait de l'enrichissement en clones spécifiques d'un état donné pour trouver les peptides discriminateurs entre les deux populations à comparer. La mise en oeuvre du procédé de l'invention possède notamment une application particulièrement avantageuse en ce qui concerne des populations de séquences de petites tailles, et en particulier de longueur inférieure ou égale à 51 pb, et de relativement grande complexité (nombre > 200), difficilement exploitables par les approches habituelles ou nécessitant des investissements importants. La méthode d'hybridation soustractive du procédé selon l'invention est basée sur la forme sous laquelle les répertoires à comparer se trouvent, et en particulier sur la présence d'un répertoire test sous forme d'ADN circulaire simple brin, sachant que le répertoire de référence peut se présenter sous une forme quelconque (ADN linéaire ou circulaire, simple ou double brin). De plus, cette méthode fait appel à la soustraction d'une propriété biologique des hybrides entre répertoire test et répertoire de référence qui repose sur la capacité à être répliqués et propagés dans des cellules hôtes. Cette soustraction repose en particulier sur la linéarisation des hybrides qui sont
parfaitement homologues entre les clones du répertoire test et du répertoire de référence (dits « homohybrides »). Le procédé selon l'invention ne fait donc pas appel à une soustraction physique de ces « homohybrides » du mélange réactionnel, ce qui facilite de manière importante l'automatisation du procédé de l'invention et améliore l'efficacité de la soustraction, surtout pour les clones peu représentés. Par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le taux d'enrichissement en clones spécifiques de l'état donné obtenu après soustraction peut être de l'ordre de 1 000 à 100 000 fois. La spécificité des peptides ainsi identifiés comme spécifiques d'un état donné peut être vérifiée par réactivité discriminatoire en immuno-histochimie et PCR par exemple à partir d'échantillons de tissus tests et de référence (notamment sains/pathologiques). De nombreuses applications utilisant les peptides spécifiques de l'état donné analysé et identifiés grâce à l'invention sont ainsi envisageables, telles que l'observation des lésions spécifiques de l'état donné analysé par IRM, par microscopie intravitale, ou tout autre technique d'imagerie in vivo à l'aide des peptides identifiés une fois marqués. Au sens de la présente invention, on entend par « répertoire » un ensemble de clones caractérisés par une propriété commune. Cette propriété peut être par exemple leur capacité à se fixer sur l'échantillon biologique cible qui peut être une simple molécule, un type cellulaire, un tissu particulier, les deux derniers cas pouvant être utilisés ex vivo ou in vivo. Par le terme « cassette globale » utilisé dans le cadre de la présente invention, on entend définir les séquences variables ou « cassette de séquence variable » et les séquences constantes qui encadrent ces séquences variables et qui contiennent au moins un site de restriction d'au moins une endonucléase en 5' et/ou 3' de la séquence variable, sachant que la longueur de chacune des séquences constantes située de part et d'autre de la cassette de séquence variable peut être différente (figure 1).
Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par l'expression « répertoire correspondant à un état test » ou « répertoire test » un ensemble de clones caractéristiques d'un échantillon test. Par l'expression « répertoire correspondant à un état de référence » ou « répertoire de référence », on entend un ensemble de clones caractéristiques d'un échantillon de référence. D'une manière générale, le répertoire test est choisi comme étant celui dont
l'enrichissement en clones spécifiques est recherché par la mise en oeuvre du procédé de l'invention, indépendamment de l'état biologique examiné. De préférence, on recherche un enrichissement en clones spécifiques d'un échantillon test qui correspond à un tissu pathologique, un tissu après traitement, un stade différencié, un tissu métastatique, etc, par comparaison avec un échantillon de référence qui correspond respectivement à un tissu sain, un tissu avant traitement, un stade indifférencié, une tumeur primaire, etc. Dans ce cas, on obtiendra un enrichissement en clones qui sont spécifiquement présents dans l'échantillon test.
A l'inverse, pour la compréhension biologique d'un état étudié, la disparition de certaines cibles est informative et il est également possible à l'aide du procédé selon l'invention de rechercher plutôt les séquences qui sont spécifiquement absentes dans l'échantillon de référence. Ainsi, la comparaison des deux répertoires effectuée dans le cadre de l'invention couvre de multiples situations telles que : état sain/état pathologique, état avant/état après traitement, état stade X/état stade X+n pour des pathologies évolutives par exemple, divers stades physiologiques de différenciation, différents stades développementaux, tumeur primaire versus tissus métastatiques, etc. Dans le cadre de la présente invention, les vecteurs renfermant les répertoires à comparer peuvent être tout vecteur capable de réaliser de la présentation de peptides, c'est-à-dire d'exprimer des protéines d'intérêt en surface d'une entité biologique du type virion, bactérie, cellule eucaryote d'origine animale ou végétale, telles que les levures par exemple. Ces vecteurs dits « vecteurs de présentation » sont par conséquent des vecteurs opérationnels dans divers systèmes biologiques pour réaliser la présentation des peptides d'intérêt à la surface de virions (dans le cas des vecteurs viraux tels que les virus du genre inovirus, les bactériophages tels que M13, T4, T7, lambda, les adénovirus, les AAV (adenovirus-associated virus), les lentivirus , les vecteurs hybrides type phagemides (genre pBluescript, etc.), à la surface de cellules bactériennes ou à la surface de cellules eucaryotes. Dans le cas particulier des virus, il y a généralement coïncidence entre le vecteur et l'entité biologique d'expression (ou hôte). Dans le cas des bactéries et des cellules eucaryotes, le vecteur permettant l'expression de la protéine recombinante est le plus souvent porté sous forme épisomique, ou bien il est intégré au génome de l'hôte, dans des cas comme celui de lentivirus ou du bactériophage lambda en phase de lysogénie.
Ainsi, les vecteurs contenant les répertoires à comparer peuvent être des vecteurs de « phage display », de « bacterial display », de « cellular display », etc. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de la présente invention, les répertoires à comparer sont présents dans des vecteurs de « phage display», en particulier pour l'identification de ligands spécifiques d'un état donné où les cibles ne sont pas a priori connues et donc disponibles pour des sélections in vitro. De préférence, on utilise des vecteurs de « phage display» à base de génome de phages filamenteux du genre inovirus, et par exemple de phage M13. Parmi les banques de « phage disp/ay» disponibles dans le commerce, on peut notamment citer la banque d'heptapeptides linéaires Ph.D.7 (Ph.D.®-7 Phage Display Peptide Library Kit E8100S) distribuée par NEB (New England Biolabs), de dodécapeptides Ph.D.12, Ph.D.TM-C7C (Phage Display Peptide Library primary clones), PDL002 (Phage Display Peptide Library fd-PIII-6mer primary clones), PDL003 (Phage Display Peptide Library fd-pIII-15mer primary clones), PDL004 (Phage Display Peptide Library fd-pVIII-15mer primary clones), PDL005 (Phage Display Peptide Library fd-pVIII-CysO primary clones), PDL006 (Phage Display Peptide Library fd-pVIII-Cys1 primary clones), PDL007 (Phage Display Peptide Library fd-pVIII-Cys3 primary clones), PDL008 (Phage Display Peptide Library fdpVIII-Cys4 primary clones), PDL009 (Phage Display Peptide Library fd-pVIII-Cys5 primary clones), PDL010 (Phage Display Peptide Library fd-pVIII-Cys6 primary clones). Dans le cas de vecteurs de « bacterial display» et « cellular display », les constructions permettant l'expression de la protéine recombinante peuvent être par exemple choisies parmi pFliTrx' Peptide Display Vector, #V1126-01, et pDisplayTM Vector, #V660-20, Invitrogen. En particulier, le répertoire test est présent dans tout type de vecteur qui présente une forme simple brin circulaire à un moment quelconque de sa propagation. Aussi, le répertoire test peut éventuellement être présent dans tout type de vecteur sous forme d'ADN double brin, circulaire ou linéaire, que l'on transforme en molécule simple brin par dégradation élective d'un des brins d'ADN et que l'on circularise si la forme de départ est linéaire. De préférence, le répertoire test est présent dans un vecteur inoviral et dans ce cas, on utilisera de préférence le bactériophage M13. Le répertoire test peut également être présent dans un vecteur 35 phagemidique et dans ce cas, on utilisera de préférence le phagemide pBluescript.
Le répertoire de référence peut se trouver dans n'importe quel vecteur duquel on purifiera le fragment correspondant à la cassette globale, que l'on utilisera sous forme double brin ou éventuellement en isolant le brin négatif. Le répertoire de référence peut se trouver dans un vecteur phagemidique, cloné de sorte que la forme simple brin circulaire purifiée à partir des pseudo-virions porte la cassette globale orientée de façon négative. La seule nécessité de l'invention réside dans le fait de disposer d'un répertoire portant les séquences, de l'échantillon test sous forme de molécules circulaires simple-brin, dans une orientation que l'on qualifie de façon arbitraire de positive, et d'un répertoire portant les séquences de l'échantillon de référence (sous forme de molécules simple ou double brin, linéaires ou circulaires), dans une orientation anti-parallèle à celle du répertoire test, que l'on qualifie de façon arbitraire de négative. Bien évidemment, toute séquence commune entre les répertoires test et référence en dehors de la cassette globale doit être strictement de même polarité pour éviter les hybridations interférentes. Par conséquent, les deux répertoires à comparer peuvent être présents dans des vecteurs différents tant qu'ils partagent la même cassette globale, et que l'on dispose au moins du brin anti-parallèle à celui du répertoire test dans le matériel de départ issu du répertoire de référence. La présence du brin parallèle à celui du répertoire test dans le matériel de départ issu du répertoire de référence (en plus du brin anti-parallèle) n'est pas pour autant problématique. Par « même cassette globale », il faut entendre que les cassettes de séquence variable des deux répertoires doivent avoir la même taille (nombre identique de nucléotides multiple de trois pour avoir des triplets mais séquence variable par définition) et que les domaines qui encadrent les cassettes de séquence variable doivent être identiques en séquence (séquences constantes par définition) sans variation de nombre de nucléotides. Il est possible, si les vecteurs porteurs des répertoires test et référence sont différents, que l'ADN représentant le répertoire de référence soit étendu au delà de la cassette globale, à condition que les séquences supplémentaires ne puissent pas hybrider avec l'ADN du vecteur portant le répertoire test. Selon un mode de réalisation particulier, les deux répertoires sont obtenus par sélection de clones à partir de la même banque et suivant la nature du vecteur le répertoire test peut être présent dans un vecteur inoviral ou dans un phagemide
en orientation positive. Dans ce cas, la cassette globale du répertoire de référence peut elle être présente dans un phagemide en orientation négative (ou mixte). L'ADN des deux répertoires est obtenu à partir des virions ou pseudovirions. La partie englobant la cassette globale du répertoire de référence ne peut s'hybrider à celle englobant le répertoire test. Si l'on travaille avec le même vecteur elles sont toutes les deux de même polarité, si l'on travaille avec des vecteurs différents elles sont de même polarité et ne partagent pas de séquences communes, en tout cas pas de séquences comportant les séquences spécifiques des endonucléases de restriction caractérisant les domaines encadrant la cassette codant les peptides. Dans le cas de figure encore plus particulier selon lequel les deux répertoires (test et référence) sont présents dans des phagemides, la mise en oeuvre de l'invention permet d'obtenir une double soustraction simultanée permettant d'enrichir le produit final en séquences spécifiques pour l'un et l'autre répertoire. De préférence, les deux répertoires à comparer sont obtenus par sélection de clones au sein d'une même banque, et en particulier d'une banque de phage display. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de la présente invention, on utilise de préférence des répertoires sous forme de banques avec des inserts, c'est-à-dire une cassette de séquence variable, d'une longueur inférieure ou égale à 51 nucléotides, et de préférence de 12 à 60 nucléotides. De manière particulièrement préférée, la taille des inserts est de 18 à 51 nucléotides, et de manière encore plus préférée de 21 nucléotides.
Concernant l'étape a), toute méthode classique qui permet d'obtenir la portion d'ADN comprenant au moins la cassette globale, peut être utilisée dans le cadre du procédé de l'invention, et de préférence l'amplification par PCR. Il est également possible d'obtenir l'ADN par amplification in vivo du vecteur contenant le répertoire, d'isoler l'ADN, par exemple par simple extraction comme pour un plasmide, et d'isoler la cassette globale par hydrolyse de restriction suivie d'une étape de purification, par exemple une chromatographie d'exclusion. De préférence, l'ADN du répertoire test est obtenu par amplification in vivo. Par conséquent, quelle que soit la nature du vecteur utilisé pour la sélection du répertoire de référence, on obtiendra la cassette globale sous forme d'ADN double brin, par PCR ou toute autre technique adéquate, et éventuellement
on éliminera le brin positif. De préférence, l'ADN du répertoire de référence est obtenu par amplification par PCR de la cassette globale. Dans les cas où l'ADN représentant le répertoire de référence, qu'il soit double ou simple brin, est obtenu par une autre méthode que la PCR, il est suffisant de s'assurer que, au minimum le brin anti-parallèle au répertoire test est disponible. Dans tous les cas, les conditions seront choisies de manière à ce que les produits obtenus contiennent la cassette globale. N'importe quelle endonucléase de restriction peut être choisie, du moment que son site de clivage est externe à la cassette de séquence variable. Le site de clivage de l'endonucléase peut éventuellement être interne aux amorces PCR. De préférence, l'endonucléase utilisée possède une séquence spécifique de clivage d'au moins six paires de bases, afin de minimiser le risque de coupure à l'intérieur de la séquence variable. Dans le cas de l'utilisation de la technique PCR lors de l'étape a), l'amplification peut être réalisée à l'aide d'un couple d'amorces qui encadrent la cassette globale. Dans ce cas, les produits d'amplification obtenus se présenteront sous forme d'ADN linéaire double-brin. Selon un mode de réalisation alternatif, l'amplification peut être réalisée à l'aide d'une seule amorce qui amplifiera uniquement le brin de polarité négative. Dans ce cas, les produits d'amplification seront sous forme d'ADN linéaire simple-brin. De préférence, les amorces utilisées pour réaliser cette étape d'amplification seront choisies de manière à ce que la température de fusion estimée de la séquence entre l'extrémité 5' de l'amorce sens et l'extrémité proximale de la cassette de séquence variable soit inférieure à 85°C, et en particulier inférieure à 78°C. En tous les cas, cette température sera forcement supérieure à la température de fusion de l'amorce, au cas limite où l'amorce se termine au dernier nucléotide constant ; dans ce cas la séquence de l'endonucléase de restriction est forcement interne à l'amorce. Le choix des amorces détermine la taille des séquences constantes qui encadrent la cassette de séquence variable.
Dans le cas d'une amplification à l'aide d'une amorce unique pour amplifier uniquement le brin de polarité négative, on utilisera une amorce en 3' par rapport à la cassette de séquence variable. Pour la production du fragment correspondant à la cassette globale, il est nécessaire de définir l'extrémité 3' du fragment qui sera obtenu par une hydrolyse de restriction. Dans le cas d'une molécule double brin on procède à la digestion avec l'endonucléase de restriction qui, en clivant en 5' de la
cassette globale, définira l'extrémité 3' du fragment obtenu par le procédé d'amplification. Si la molécule est simple brin, on produit une portion double brin couvrant le site de restriction nécessaire pour l'hydrolyse de restriction. Parmi les exemples d'amorces utilisables pour obtenir l'ADN du répertoire de référence par PCR, on peut notamment citer dans le cas du phage M13 le couple d'amorces +18 (TGC CAA TTC CTT TAG TGG TA) décrite dans RNA Biol. 2005 Jan; 2(1):28-33 par Kolb G. et Boiziau C., et -28 (GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C) du kit de banque de phage display Ph.D.-7C7TM commercialisé par la société New England Biolabs sous la référence E#8120S.
Il est également possible d'utiliser l'amorce -28 comme seule amorce pour obtenir uniquement le brin de polarité négative. L'amplification du répertoire de référence peut être réalisée après extraction de l'ADN à partir du lysat des vecteurs qui contiennent le répertoire (virus, bactérie, cellules eucaryotes, etc) ou bien directement dans le lysat cellulaire sans extraction préalable de l'ADN. Dans ce dernier cas, l'amplification de l'ADN est ainsi réalisée directement après l'étape de lyse, par exemple de 10 à 20 min, à une température de 95-100°C. Après obtention de l'ADN du répertoire de référence, les produits peuvent être utilisés directement pour l'hybridation avec l'ADN du répertoire test (étape b)), qu'ils soient sous forme d'ADN linéaire ou circulaire, double ou simple brin. Dans le cas de produits obtenus sous forme d'ADN double brin, il est également possible, mais non nécessaire, de purifier uniquement les brins de polarité négative préalablement à l'étape d'hybridation b). De préférence, seuls les brins de polarité négative seront utilisés pour réaliser l'étape d'hybridation.
Pour séparer les brins de polarités négative et positive et ne récupérer que les brins de polarité négative, l'une des deux amorces utilisées pour amplifier l'ADN du répertoire de référence peut être marquée à l'aide d'un marqueur détectable, l'objectif étant de pouvoir récupérer les brins de polarité négative. Une des méthodes préférées est de marquer les brins de polarité positive.
L'amorce marquée peut l'être à différents endroits, du moment que le marquage n'interfère pas avec le procédé d'amplification. Le marquage peut donc être effectué notamment à l'extrémité 5' ou 3' de l'amorce. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, c'est l'amorce sens qui est marquée, de préférence à l'extrémité 5', à l'aide d'un marqueur détectable permettant de purifier le brin de polarité négative non marqué.
Parmi les exemples de marqueurs détectables qui peuvent être utilisés, on peut notamment citer la biotine, la fluorescéine, etc. La séparation/purification des brins de polarité négative peut être réalisée par n'importe quelle technique, comme la séparation sur colonne d'affinité par exemple, pour autant que les outils utilisés soient adaptés au marqueur détectable présent sur l'amorce marquée. Par exemple, on peut utiliser des anticorps affins pour le marqueur choisi ou bien si on utilise une amorce sens marquée à la biotine on peut purifier les brins de polarité négative non marqués par capture des brins de polarité positive marqués à la biotine sur des billes recouvertes de streptavidine.
Le procédé d'obtention d'ADN du répertoire test et du répertoire de référence (étape a)), n'est pas limitatif et peut consister en n'importe quelle technique classique bien connue de l'homme du métier, du moment qu'elle est adaptée à la nature du vecteur utilisé pour la sélection des répertoires. Par exemple, dans le cas de l'utilisation d'un vecteur inoviral, on peut obtenir l'ADN à partir des virions naturellement produits, récoltés dans le surnageant d'une culture bactérienne infectée par les virus-vecteurs. Dans le cas de l'utilisation d'un vecteur phagemidique, on peut obtenir l'ADN à partir des pseudovirions produits, récoltés dans le surnageant d'une culture bactérienne hébergeant les phagemides et infectée par un virus transcomplémentant pour la réplication du phagemide sous forme simple brin circulaire et son encapsidation dans des pseudovirions libérés dans le milieu de culture. L'ADN peut également être obtenu par préparation d'ADN simple brin à partir d'ADN double brin, soit directement circulaire, soit circularisé par ligation assistée par un oligonucléotide.
Concernant le mode de réalisation particulièrement préféré selon lequel les deux répertoires à comparer sont obtenus par sélection de clones au sein d'une même banque de phage display, l'ADN encapsidé dans les virions est directement utilisé pour représenter le répertoire test et la cassette globale du répertoire de référence est isolée par PCR, notamment en utilisant les amorces +18 et -28 pour la banque Ph.D. C7C. Lors de l'étape b), on mélange l'ADN du répertoire test qui se présente sous forme d'ADN circulaire simple brin avec l'ADN du répertoire de référence. Quelle que soit l'origine des ADNs représentant les répertoires test et de référence, le mélange des ADNs issus des deux répertoires à comparer conduit à la formation d'« hybrides parfaits » ou « homohybrides » qui correspondent aux
clones présents à la fois dans le répertoire test et le répertoire de référence, et des « hybrides partiels » ou « hétérohybrides » constitués d'ADN circulaire simple brin de clones spécifiques du répertoire test et de brins linéaires spécifiques ou non du répertoire de référence, avec la partie correspondant à la séquence variable non- hybridée (figure 2). Ce mélange est incubé dans des conditions de température qui favorisent la formation d«< homohybrides » stables et d«< hétérohybrides » instables. Le différentiel de stabilité entre « homohybrides » et « hétérohybrides » est le fait de la continuité des domaines hybridés, l'interruption particulière aux hétérohybrides étant due à l'absence d'hybridation au niveau de la cassette de séquence variable. Pour cela, le mélange des ADNs issus des deux répertoires à comparer est incubé dans des conditions de température où les « homohybrides » restent sous forme d'ADN double brin, c'est-à-dire hybridés, mais pas les « hétérohybrides ». Ces conditions de température sont notamment déterminées en fonction des caractéristiques de la cassette globale. En effet, ces conditions correspondent aux températures de fusion des différentes espèces moléculaires en présence, c'est-à-dire à la température de fusion de la cassette globale ou température de fusion des « homohybrides » et à la température de fusion des domaines encadrant la cassette de séquence variable ou température de fusion des « hétérohybrides ».
C'est la plus longue des séquences constantes qui est en amont ou en aval de la cassette de séquence variable dans la portion d'ADN amplifiée de la cassette globale qui permet de déterminer la température de fusion des « hétérohybrides ». De préférence, la plus longue des séquences constantes est d'au moins 6 nt plus longue que la taille de la cassette de séquence variable et inférieure à 35 nt. En particulier, elle est de 28 nt. En particulier, les conditions d'hybridation correspondent à une température qui est supérieure d'au moins 5°C, de préférence de 15 à 20°C, et idéalement de 15°C, à la température de fusion des « hétérohybrides» et à une température qui est inférieure de 10 à 15°C, de préférence de 10°C, à celle de fusion des « homohybrides». Ces conditions d'hybridation de l'étape b) consistent de préférence à incuber le mélange à une température unique, dite température d'hybridation/dénaturation, qui est déterminée de manière précise en choisissant une température qui est à la fois, comme indiqué ci-dessus, supérieure à la
température de fusion des domaines encadrant la cassette de séquence variable, et inférieure à la température de fusion des « homohybrides ». Selon ce mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la température est également choisie pour être de préférence aussi proche que possible de la température de fusion des « homohybrides » moins 20°C, afin de pouvoir bénéficier de la vitesse maximale pour la réaction d'hybridation. Selon une méthode alternative, ces conditions d'hybridation correspondent à des cycles de variation de température entre une température d'hybridation et une température de dénaturation, et non à une température unique qui est déterminée précisément. L'utilisation d'une température d'hybridation/dénaturation unique pour l'étape b) comme indiqué ci-dessus représente un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé selon la présente invention. En effet, l'étape b) du procédé peut dans ce cas être réalisée à l'aide d'un simple bain marie, ce qui permet d'éviter d'utiliser un dispositif particulier, du type thermocycleur par exemple, pour effectuer les cycles de variation de température. L'étape d'hybridation b) est de préférence réalisée à une température unique qui est à la fois supérieure d'au moins 5°C, et en particulier de 15°C à la température de fusion des domaines encadrant la cassette de séquence variable et inférieure d'environ 10°C à la température de fusion des homohybrides. Les températures de fusion des « homohybrides » et des « hétérohybrides » peuvent notamment être estimées soit approximativement par calcul en fonction de la séquence (en utilisant la méthode des proches voisins décrite par Breslauer K.] et al., PNAS, 1986, vol. 83 no. 11, 3746-3750), soit évaluée expérimentalement. Le calcul théorique en fonction de la séquence est de préférence utilisé pour déterminer les températures pour réaliser l'étape b) à l'aide de cycles de température, alors que l'approche expérimentale sera préférée pour la détermination d'une température unique d'hybridation/dénaturation. Une des approches expérimentales qui peut être utilisée pour déterminer une température unique d'hybridation/dénaturation consiste notamment à effectuer une série d'expériences où l'on hybride deux brins positif et négatif issus de deux clones (notés a et b par exemple) dont la cassette de séquence variable est différente en séquence, à des températures différentes, par exemple de 68 à 86 °C, par 2°C. L'hybridation des brins se fait de manière à disposer d'hybrides correspondant à des « homohybrides » et des « hétérohybrides »). Par exemple, un
brin circulaire du clone a avec un brin anti-parallèle du clone a obtenu par PCR (correspondant à un « homohybride ») et un brin circulaire du clone a avec un brin anti-parallèle du clone b obtenu par PCR (correspondant à un « hétérohybride »). Les produits d'hybridation sont digérés par l'enzyme de restriction ad hoc et la température pour laquelle on n'observe pas de digestion des « hétérohybrides » est choisie comme température d'hybridation. Un témoin utilisant les brins positifs et négatifs d'un même clone est utilisé, dans les mêmes conditions, pour valider que 100 % de digestion est obtenue. Selon une variante de l'étape b), les conditions d'hybridation peuvent se présenter sous la forme de plusieurs cycles (n cycles) d'incubation aux températures d'hybridation et de dénaturation respectives déterminées comme indiqué ci-dessus. Le nombre de cycle est fixé notamment par les limites de dégradation et de linéarisation de l'ADN circulaire utilisé (hydrolyse spontanée). La vitesse de dégradation est fonction du milieu réactionnel et des températures utilisées. Elle peut être déterminée expérimentalement par analyse du taux de dégradation spontanée (notamment par analyse densitométrique après électrophorèse sur gel d'agarose, en utilisant un standard d'ADN équivalent, dosé par spectrophotométrie). On peut tolérer divers taux de dégradation mais il est impératif de pouvoir récupérer suffisamment d'ADN circulaire non dégradé pour qu'il soit représentatif de la complexité du sous-répertoire issu de la soustraction. Par exemple, plus de 100 ng d'ADN circulaire doit rester après la soustraction pour des répertoires dont la complexité initiale est estimée à 10 000 clones indépendants, c'est-à-dire qu'il faut conserver environ 10 % d'ADN circulaire simple brin dans un état fonctionnel. Le nombre de cycles nécessaires étant fonction de la complexité des deux répertoires à comparer, le nombre de cycle est de préférence le nombre le plus faible produisant un maximum d«< homohybrides ». Par exemple, le nombre de cycle peut être inférieur à 4, mais peut aller jusqu'à 50. Le temps d'hybridation mis en oeuvre à l'étape b) est également fixé par les limites de dégradation de l'ADN circulaire simple brin utilisé qui dépendent du milieu réactionnel et des températures utilisées (hydrolyse spontanée). Le temps maximum d'hybridation correspondra en particulier à la durée pendant laquelle il est encore possible de disposer d'au moins 10 % d'ADN circulaire simple brin dans un état fonctionnel. Pour réaliser l'étape b), le rapport molaire utilisé entre l'ADN du répertoire de référence et l'ADN du répertoire test est fonction de la complexité des répertoires
à comparer, et l'homme du métier saura adapter les conditions en conséquence selon les pratiques courantes mises en oeuvre dans le domaine. Ce rapport peut notamment varier de l'équimolarité lorsque les répertoires ne sont pas trop complexes (de l'ordre d'une centaine de clones) à un excès de 1000X de l'ADN du répertoire de référence si les répertoires sont très complexes (>105 clones). Il est cependant préférable d'utiliser un rapport molaire inférieur à 1000X car dans ce cas il sera nécessaire de compenser en transformant un plus grand nombre de cellules hôtes pour éviter d'arriver à une saturation d'entrée de la quantité d'ADN dans les cellules hôtes (pour exemple, on utilise généralement 108 bactéries compétentes par 10 ng d'ADN). De préférence, l'hybridation est réalisée en présence d'un excès moyen d'ADN du répertoire de référence de l'ordre de 10X par rapport à l'ADN circulaire du répertoire test, c'est-à-dire selon un rapport molaire 1 : 10 (répertoire test : répertoire de référence).
Après la réaction d'hybridation, les « homohybrides » peuvent ainsi être digérés par une ou plusieurs endonucléase(s) de restriction. L'hydrolyse conduit à la linéarisation de la molécule circulaire et la rend vulnérable à l'action des exonucléases présentes dans les cellules hôtes dans lesquelles le mélange sera transformé.
L'hydrolyse de restriction du mélange d'hybrides obtenus à l'issue de l'étape b), c'est-à-dire des « hétérohybrides » dénaturés et des « homohybrides » non dénaturés, est réalisée à l'aide d'une ou plusieurs endonucléase(s) de restriction adéquate(s). N'importe quelle endonucléase convient pour réaliser cette étape, du moment qu'elle correspond à un site de clivage présent dans la cassette globale des répertoires à comparer. L'activité de l'enzyme permet d'obtenir l'hydrolyse des ADN double brin, essentiellement composés des « homohybrides » qui sont les seuls à être toujours hybridés et donc hydrolysables par une endonucléase de restriction qui n'agit que sur de l'ADN double brin. Les « hétérohybrides » étant dénaturés lors de l'étape b), ceux-ci ne pourront pas être clivés par l'endonucléase. Les séquences communes (qu'elles encadrent ou non les inserts d'intérêt) servent ainsi de substrat à une ou plusieurs endonucléase(s) de restriction pour dégrader les molécules simple brin circulaires hybridées sur toute la longueur de la cassette globale , laissant
fonctionnelles pour la réplication chez l'hôte adéquat du vecteur, majoritairement les molécules porteuses de séquences spécifiques du répertoire test. Sans que ceci soit obligatoire, plusieurs endonucléases peuvent être utilisées lors de cette étape. Ce mode de réalisation particulier sera notamment choisi pour réduire la quantité globale de protéines et ainsi améliorer l'étape de transformation dans les cellules hôtes, et/ou pour réduire le temps d'incubation et par conséquent limiter les hydrolyses non spécifiques des molécules d'intérêt. Tout ceci permettra in fine d'augmenter l'efficacité de la soustraction. En fonction de l'endonucléase de restriction utilisée pour réaliser l'étape c), les étapes b) et c) peuvent être réalisées séquentiellement ou simultanément. Dans le cas d'une endonucléase de restriction thermorésistante, c'est-à-dire que conformément à l'invention cette enzyme ne sera pas inactivée de manière irréversible à la température d'hybridation choisie pour effectuée l'étape b), les étapes b) et c) peuvent éventuellement être réalisées simultanément, c'est-à-dire que l'étape b) peut être réalisée directement en présence de cette enzyme. L'étape d) devra toutefois être réalisée ensuite pour adapter les conditions de température, et éventuellement de tampon dans le cas où l'étape b) n'aurait pas été réalisée directement dans ce tampon, à celles qui sont nécessaires pour que l'endonucléase soit active.
Par exemple, on utilisera de préférence l'enzyme thermorésistante KpnI pour réaliser l'étape c). Dans ce cas, l'étape b) peut idéalement être réalisée en présence de l'enzyme (étape c)), puis la température est diminuée jusqu'à 37°C (étape d)) qui correspond à la température « idéale ou optimale » pour que Kpnl puisse se restructurer et être active.
Ce mode de réalisation mettant en oeuvre les étapes b) et c) de manière simultanée est préféré dans le cadre de la présente invention. Dans le cas d'une endonucléase de restriction qui n'est pas thermorésistante (par exemple Eagl), les étapes b) et c) sont réalisées séquentiellement, c'est-à-dire que les ADNs issus des deux répertoires à comparer obtenus à l'étape a) sont tout d'abord mélangés dans les conditions de température décrites ci-dessus pour effectuer l'étape b) sans l'enzyme, puis dans un second temps l'endonucléase est ajoutée (étape c)). Le mélange est ensuite incubé dans les conditions de température « idéale ou optimale » d'activité de cette enzyme (étape d)).
Lors de la réalisation séquentiellement ou simultanément des étapes b) et c), l'étape b) d'hybridation des ADNs issus des deux répertoires à comparer peut être réalisée directement dans le tampon d'activité de l'enzyme qui sera utilisée ou dans toute autre solution d'hybridation tant que celle-ci ne produit aucune interférence défavorable à l'hybridation des ADNs des deux répertoires. Par exemple, on peut notamment utiliser une solution de SSC 0,1x. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'étape b) est réalisée directement dans le tampon d'activité de l'enzyme qui sera utilisée à l'étape c) et pour linéariser les « homohybrides » lors de l'étape d). Ceci permet en effet de minimiser les interventions expérimentales. De manière avantageuse, l'incubation du mélange des ADNs issus des deux répertoires à comparer est réalisée directement en présence de l'enzyme de restriction qui devra agir ultérieurement (étape d)) et dans une solution tamponnée qui correspond au tampon d'activité de cette enzyme. Par exemple, pour l'utilisation de l'enzyme Kpnl, le tampon 10x de composition suivante peut être utilisé : 10 mM Bis Tris Propane-HCI, 10 mM MgCl2, 1mM DTT pH 7,0 37 °C. Dans le cas où l'étape b) n'est pas effectuée directement dans le tampon d'activité de l'enzyme, il sera nécessaire d'ajouter ce tampon ultérieurement, et notamment lors de l'ajout de l'enzyme elle-même (étape c)).
L'ensemble des espèces moléculaires présentes à la fin de la réaction d'hydrolyse est transformé dans des cellules hôtes adéquates. Les cellules hôtes devront en particulier être choisies et/ou adaptées en fonction du type de vecteur portant le répertoire test, pour être capables de répliquer et de propager les molécules circulaires et de détruire les molécules linéaires, par action des exonucléases notamment. Dans ces conditions, la transformation peut être réalisée à l'aide de n'importe quelle technique connue de l'homme du métier et adaptée en fonction de l'hôte et du vecteur utilisés. Si la cellule hôte n'est pas apte à produire la transformation de molécules circulaires simple brin en double brin, il est possible de pallier cette déficience en réalisant cette étape in vitro, par extension d'amorce de polarité négative suivie d'une ligation. Dans le cas particulier défini ci-dessus où les deux répertoires sont présents dans des phagemides, on prendra soin que les deux populations moléculaires (test et référence) diffèrent par le marqueur de sélection utilisé pour pouvoir départager
la population des cellules hôtes les hébergeant. Par exemple, dans le cas de l'utilisation de marqueurs de résistance à un antibiotique, les deux marqueurs utilisés devront être différents, par exemple l'un pour une résistance à l'ampicilline et l'autre à la tétracycline. Dans ce cas particulier, la soustraction est symétrique, permettant d'enrichir le produit final en séquences spécifiques pour l'un et l'autre répertoire (double soustraction). Si l'hôte utilisé est constitué de bactéries, on pourra procéder à la transformation de bactéries chimiocompétentes ou électrocompétentes. Dans le cas de l'électroporation, la transformation nécessitera généralement de purifier l'ADN préalablement à l'électroporation proprement dite, afin d'éliminer des sels, protéines, endonucléase de restriction et autres composés contenus dans le milieu réactionnel, obtenus à l'issue de l'étape d) qui peuvent diminuer l'efficacité d'électroporation. De préférence, on procède directement à la transformation du mélange obtenu à l'issue de l'étape d) dans des bactéries chimiocompétentes, ce qui permet notamment d'éviter la perte de clones rares présents dans le répertoire test. Parmi les bactéries sensibles aux phages du genre inovirus, on peut par exemple utiliser les bactéries E. coll. Les cellules une fois transformées sont cultivées dans des conditions standard et adaptées en fonction du type choisi. Lors de cette étape, seules les molécules circulaires peuvent servir in vivo pour l'obtention d'ADN circulaire double brin. Les vecteurs « intègres », par opposition aux vecteurs dégradés, sont ensuite récupérés par extraction à partir des cellules hôtes.
Dans le cas des inovirus et des phagemides en co-infection avec un phage trans-complémentant par exemple, les virions ou pseudo-virions produits (vecteurs « intègres ») sont présents dans le surnageant de culture des bactéries transformées. Ils peuvent être récupérés, après simple centrifugation de la culture bactérienne par exemple, et éventuellement concentrés par précipitation en présence de PEG/NaCI. Par exemple, par addition de 20% (w/v) polyéthylène glycol-8000, 2.5 M NaCl pour 1/6 du volume du surnageant, puis incubation à 4°C pendant 4 h, centrifugation à 12 000 g pour récupérer les virions ou pseudo-virions dans le culot, et resuspension dans une solution tamponnée. Ce tampon sera notamment choisi en fonction de l'utilisation qui est envisagée. Par exemple pour la conservation, on peut notamment utiliser une
solution PBS-azide, pour une utilisation en immunohistochimie, on pourra par exemple utiliser une solution de Tris-NaCI, pour une extraction d'ADN on pourra choisir un tampon de lyse, pour une injection chez l'animal du sérum physiologique par exemple, etc.
Si l'enrichissement en clones spécifiques du répertoire test n'est pas jugé satisfaisant, il est possible de répéter l'hybridation soustractive en utilisant le sous-répertoire test obtenu à l'issue du premier tour. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de l'invention comprend les étapes consistant à : 1) amplifier par PCR une portion du répertoire de référence qui comprend la cassette globale, 2) obtenir l'ADN du répertoire test sous forme d'ADN circulaire simple brin, 3) mélanger les ADNs des deux répertoires à comparer obtenus à l'étape 1) en présence d'une endonucléase thermorésistante et directement dans le tampon d'activité correspondant à cette enzyme, 4) incuber le mélange d'hybrides à une température unique d'hybridation/dénaturation 6) incuber le mélange d'hybrides obtenus à la température à laquelle l'endonucléase utilisée est active, 7) transformer directement le mélange dans des cellules hôtes chimiocompétentes et culture desdites cellules transformées, 8) récupérer les vecteurs « intègres ». De préférence, l'endonucléase de restriction choisie est Kpnl. Selon un autre mode de réalisation particulier, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend les étapes consistant à : 1) amplifier par PCR une portion du répertoire de référence qui comprend la cassette globale, 2) obtenir l'ADN du répertoire test sous forme d'ADN circulaire simple brin par amplification in vivo dans des bactéries, ledit répertoire étant présent dans un phage, 3) mélanger les ADNs des deux répertoires à comparer obtenus directement dans le tampon d'activité correspondant à Kpnl sans la présence de l'endonucléase, 4) incuber le mélange d'hybrides à une température unique d'hybridation/dénaturation de 85°C,
5) ajouter l'enzyme KpnI au mélange d'hybrides et l'incuber à 37°C, 6) transformer directement le mélange dans des bactéries chimiocompétentes et cultiver lesdites bactéries transformées, 7) récupérer les virions dans le surnageant de culture.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a également pour objet l'utilisation de deux répertoires d'acides nucléiques correspondant respectivement à un échantillon test et un échantillon de référence, pour effectuer une comparaison par hybridation soustractive, dans laquelle : - les répertoires à comparer contiennent la même cassette globale - le répertoire test est sous forme d'ADN circulaire simple-brin - la cassette globale du répertoire de référence est dans une orientation antiparallèle à celle du répertoire test. Tout comme mentionné ci-dessus concernant le procédé de l'invention, toute séquence commune entre les répertoires test et référence en dehors de la cassette globale doit être strictement de même polarité pour éviter les hybridations interférentes. Cette utilisation peut en outre être caractérisée par le fait qu'une endonucléase de restriction dont le site de clivage est présent dans la cassette globale est utilisée pour linéariser les « homohybrides » uniquement et conserver les « hétérohybrides ». Selon l'invention, la soustraction proprement dite est donc réalisée par les cellules hôtes utilisées sur la base d'une propriété biologique, puisque seules les molécules qui sont différentes entre les deux répertoires à comparer (« hétérohybrides » qui ne sont pas linéarisées) conservent la capacité de se propager dans les cellules hôtes choisies et peuvent donc être propagées dans les cellules hôtes. Dans le cadre de l'utilisation selon l'invention, les deux répertoires à comparer sont de préférence issus de la même banque, et en particulier sont présents dans des inovirus.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le répertoire test est présent dans un vecteur inoviral ou dans un phagemide et le répertoire de référence est présent dans un vecteur de « bacterial display». Enfin, un autre mode de réalisation peut également consister à comparer un répertoire présent dans un vecteur inoviral et l'autre présent dans un virus de cellules eucaryotes, par exemple du genre AAV, lentivirus ou adénovirus.
Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet un kit destiné à l'enrichissement en séquences spécifiques d'un répertoire d'acides nucléiques correspondant à un état donné dit « répertoire test », en comparaison avec un répertoire correspondant à un état de référence dit « répertoire de référence », ledit kit comprenant : - un vecteur capable d'exprimer des peptides en surface, - un couple d'amorces pour l'obtention in vitro, par exemple par PCR, de la portion d'ADN comprenant la cassette globale du répertoire de référence, et - une ou plusieurs endonucléase(s) de restriction qui possède(nt) un site de clivage dans la cassette globale des répertoires test et de référence à comparer, et le tampon nécessaire à son activité optimale. Le vecteur du kit selon l'invention peut contenir déjà la banque de peptides (séquences variables), ou être proposé pour servir pour la construction d'une banque de peptides. Dans le premier cas, il se présente préférentiellement sous la forme d'une suspension de virions prêts à l'emploi si le vecteur est un virus. Dans le deuxième cas, il se présente préférentiellement sous forme d'ADN double brin, digéré par les enzymes de restriction qui sont utilisées pour la construction de la banque et qui permettent le clonage orienté de la cassette de séquence variable. Bien entendu, le clonage peut intéresser n'importe quel sous-ensemble (répertoire), issu de sélections à partir d'autres types de vecteurs/présentations, tant que les deux répertoires à comparer contiennent la même cassette globale. Ainsi, l'utilisation du procédé ou du kit selon l'invention permet d'identifier notamment des séquences spécifiques d'un état donné (pathologique, après traitement, stade d'évolution, divers stades de différentiation, différents stades développementaux, tumeur primaire versus tissus métastatiques, etc), de détecter et/ou de suivre l'évolution des composés correspondants à ces séquences dans le cadre du diagnostic et/ou du suivi de cet état. La présente invention est décrite plus en détails dans les exemples non limitatifs qui suivent et qui se réfèrent aux figures annexées dans lesquelles : La figure 1 représente un schéma de la cassette globale selon l'invention. La figure 2 représente les différents types d'hybrides qui peuvent être obtenus lors de la mise en oeuvre de l'étape b) du procédé selon l'invention. La figure 3 représente l'estimation de la fréquence de trois clones spécifiques de l'état EAE (phi36, phi46 et phi48) dans le répertoire test Ph.D.-EAER3
(état pathologique EAE) et dans le sous-répertoire « enrichi » Ph.D.-EAEAHR3 (test moins référence) obtenu après mise en oeuvre du procédé selon l'invention. La figure 4 représente l'estimation de l'enrichissement de trois clones phi36, phi46 et phi48 spécifiques de l'état EAE après mise en oeuvre du procédé selon l'invention. EXEMPLES EXEMPLE 1: enrichissement en clones spécifiques d'un état donné (encéphalomyélite auto-immune expérimentale) par mise en oeuvre du procédé d'hybridation soustractive selon l'invention Considérons un répertoire de référence (Ph.D.-HR3) obtenu à partir de tissu (système nerveux central (SNC)) issu de rats sains, et un répertoire test (Ph.D.-EAER3) obtenu à partir de tissu (SNC) pathologique issu de rats atteints d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE)). Le répertoire Ph.D.-HR3 est soustrait du répertoire Ph.D.-EAER3 à l'aide du procédé selon l'invention, ce qui permet ainsi d'isoler les clones spécifiques des tissus lésés EAE. Les deux répertoires issus de SNC de rats sains et de rats atteints d'EAE (rats EAE) ont été obtenus de la même manière. Sauf indication contraire, le protocole a été réalisé selon les instructions du fournisseur correspondant au kit de phage display Ph.D.-7C7TM commercialisé par la société New England Biolabs sous la référence E#8120S. Les rats ont été anesthésiés à l'aide de pentobarbital, au premier jour des signes cliniques pour les rats EAE. Sélection : une injection i.v. de 2 X 10E11 phages M13 du kit E#8120S de NEB cité ci-dessus a été réalisée dans la queue et laissée en circulation pendant 45 minutes, puis un lavage par perfusion intracardiaque avec 20 ml de PBS a été réalisé. Récupération du SNC : 2 g de tissu nerveux ont été récupérés. Le tissu a été dilacéré, écrasé puis lavé avec 5 ml de PBS-BSA 1% froid. Une centrifugation pendant 5 min à 1500 rpm, 4°C a ensuite été réalisée et le surnageant a été éliminé. 1 ml de NP40 1% a été ajouté au culot correspondant au tissu dissocié et lavé), laissé incubé pendant 5 min dans la glace, puis 9 ml de bactéries E col/ souche ER2738 (DO-600nm = 0.5) ont été ajoutés. Le mélange a été incubé pendant 40 min à 37°C. Un petit prélèvement a été effectué pour la titration de la sélection. 50 ml de LB préchauffé à 37°C ont été ajoutés, et le mélange a été incubé pendant 4h supplémentaires à 37°C, pour préparer le matériel qui va être ré- injecté dans les animaux pour le deuxième tour de sélection.
Un nouveau tour de sélection (deuxième sélection) a ensuite été effectué comme indiqué ci-dessus au paragraphe Sélection (injection i.v. des phages dans la queue, 45 minutes de circulation, puis un lavage par perfusion intracardiaque avec 20 ml de PBS a été réalisé).
Après une nouvelle récupération du SNC et préparation du matériel à ré-injecté comme indiqué ci-dessus, une troisième sélection a été effectuée comme indiqué ci-dessus au paragraphe Sélection mais en réalisant un lavage par perfusion intracardiaque avec 50 ml de PBS. Le répertoire Ph.D.-EAER3 a été amplifié in vivo, par infection de E. col), comme suit : à 5 ml d'une culture en phase exponentielle de croissance d'E. coli, souche ER2738 ont été ajoutés 10E+6 virions du répertoire Ph.D.-EAER3, le mélange a été incubé pendant une heure à 37°C sous agitation (300 rpm), puis 45 ml de milieu LB préchauffé ont été ajoutés et la culture poursuivie dans les mêmes conditions pendant 4 h supplémentaires. Le surnageant de la culture a été récupéré après centrifugation à 8000 g pendant 10 min, et additionné de 1/6ème d'une solution de 20% (p/v) polyéthylène glycol-8000, 2,5 M NaCl, puis incubé à 4°C pendant 16 h pour faciliter la précipitation des virions. Les virions du répertoire Ph.D.-EAER3 ont été récupérés par centrifugation (14000 g 15 min), le surnageant attentivement éliminé et le culot repris dans 5 ml d'une solution 10 mM Tris-HCI (pH 8), 1 mM EDTA, 4 M NaI fraichement préparée, incubée 10 min à température ambiante puis l'ADN simple brin a été récupéré sous forme de culot après centrifugation (14000 g 10 min). L'ADN a été solubilisé dans 500 pl de tampon TE (10 mM Tris-HCI (pH 8), 1 mM EDTA), dosé par spectrophotométrie et ajusté à lpg/pl.
Le répertoire Ph.D.-HR3 a été amplifié par PCR, à l'aide des amorces -28 (GTA TGG GAT TTr GCT AAA CAA C) et +18 (TGC CM TTC CTT TAG TGG TA), le produit PCR a été purifié par chromatographie d'exclusion (Sephadex G-50), concentré par précipitation alcoolique et repris en tampon TE, ajusté à 0,1 pg/pl. L'amorce +18 utilisée est celle décrite dans RNA Biol. 2005 Jan; 2(1):28-33 par Kolb G. et Boiziau C., et l'amorce -28 utilisée est celle du kit de la banque de phage display utilisé (Ph.D.-7C7' commercialisé par la société New England Biolabs sous la référence E#8120S). Les ADN Ph.D.-EAER3 (répertoire test) et Ph.D.-HR3 (répertoire de référence) ont été mélangés dans un rapport molaire de 1:10 (1 pg Ph.D.-EAER3, dans le tampon d'activité de Kpnl, à raison de 1 pg d'ADN Ph.D.-EAER3 par 50 pl).
Le mélange a été incubé 2 min à 95 °C, pour dénaturer les ADN double brin (préparation des matrices du répertoire de référence et du répertoire test), puis 2 h à 85 °C (t° unique d'hybridation/dénaturation) pour permettre la formation des homohybrides, enfin refroidi à 4 °C pour conservation. 100 U de Kpnl ont été ajoutées par microgramme d'ADN Ph.D.-EAER3 utilisé et la réaction d'hydrolyse de restriction a été réalisée à 37 °C pendant 1 h. Une culture d'E. colt, souche ER2738, en phase exponentielle de croissance (DO à 600 mn = 0,5) a été utilisée pour préparer des bactéries chimiocompétentes, en utilisant le kit RapidTransit Transformation (Sigma, R-2653), suivant les instructions du fournisseur. Dix aliquotes de 100 pl de la suspension des bactéries compétentes ont reçu chacune l'équivalent de 1/10ème de la quantité d'ADN Ph.D.-EAER3 initialement utilisé pour la réaction d'hybridation de mélange d'ADN issu de la réaction d'hybridation, incubées à 4 °C pendant 10 min, incubées à 42 °C pendant 30 sec, puis reçu chacune 900 pl de Recovery Medium préchauffé à 37 °C. Les cultures bactériennes ont été incubées à 37 °C sous agitation (-250 rpm), puis 9 ml d'une culture d'E, col% souche ER2738, en phase exponentielle de croissance (DO à 600 mn = 0,5) à 37 °C ont été ajoutés et la culture poursuivie sous agitation pendant 4 h. Les bactéries ont été séparées des virions produits par centrifugation à 5000 g, 10 min, suspendues dans 10 ml de milieu LB additionné de glycérol (15% v/v) et conservées à -80 °C. Le surnageant, contenant les clones constituant le sous-répertoire Ph.D.-EAEAHR3 a été additionné 1/6ème d'une solution de 20% (p/v) polyéthylène glycol-8000, 2,5 M NaCl, puis incubé à 4°C pendant 16 h. Les virions ont été récupérés par centrifugation (14000 g, 15 min), le surnageant attentivement éliminé et le culot repris dans 5 ml d'une solution 10 mM Tris-HCI (pH 8), 1 mM EDTA, 10% (v/v) DMSO et des aliquotes ont été conservées à -20°C. EXEMPLE 2: vérification de l'enrichissement en clones spécifiques de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans le sous-répertoire Ph.D.-EAEAHR3 obtenu selon l'invention.
Pour estimer l'efficacité de la soustraction procurée par la mise en oeuvre de la présente invention, trois clones (phi 36, phi 46 et phi 48) caractérisés par ailleurs et connus pour marquer les lésions propres au tissu utilisé pour la constitution du répertoire Ph.D.-EAER3 ont été étudiés pour mesurer la fréquence de ces clones spécifiques de l'état EAE dans le répertoire Ph.D.-EAER3 et dans le sous-répertoire Ph.D.-EAEAHR3 « enrichi » obtenu après mise en oeuvre du procédé
selon l'invention tel que décrit à l'exemple 1. Les résultats sont regroupés dans la figure 3 annexée. Des amorces spécifiques de ces trois clones, GCT TGT TCT TAT AAG GCT AGG pour phi 36 (SED ID NO : 1), GTA CGA ATA CTT CGA ATT TGG G pour phi 46 (SED ID NO : 2) et TCT ACG GCT TCT AAT AGT TGC pour phi 48 (SED ID NO : 3) et les amorces génériques +18 (TGC CAA TTC CTT TAG TGG TA) et -96 (CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG) ont été utilisées pour réaliser la quantification par PCR (95°C 30 sec; 40 cycles, 94 °C 30 sec, 55 °C 30 sec, 72 °C 30 sec; 72 °C 2 min) des trois clones dans les répertoires Ph.D.-EAER3 et Ph.D.-EAEAHR3. L'amorce -96 utilisée est celle décrite dans RNA Biol. 2005 Jan; 2(1):28-33 par Kolb G. et Boiziau C. L'enrichissement des clones pris individuellement est estimé par le rapport C(clone)Ph.D.-EAEAHR3/C(clone)Ph.D.-EAER3 (ou Ph.D.-EAELHR3/ Ph.D.-EAER3) qui représente la "concentration" dans le sous-répertoire « enrichi » sur la "concentration" dans le répertoire test.
La concentration relative de chacun des clones est exprimée par rapport à l'ensemble des clones du répertoire correspondant (test, référence et produit par la soustraction) sur la base du modèle mathématique pour la quantification relative par PCR en temps réel proposé par Michael Pfaffl, Nuc/eic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 9 e45, où la séquence dosée est le produit PCR spécifique pour chaque clone (amorce spécifique & -96) et la séquence de référence est le produit PCR de l'ensemble du répertoire, obtenu avec les amorces +18 & -96. Les résultats sont regroupés sur la figure 4. Les enrichissements suivants ont été observés : N5 10E+3 pour phi36, -10E+5 pour phi46, et N4 10E+3 pour phi48.
Le procédé selon l'invention permet ainsi d'obtenir des enrichissements des clones spécifiques de l'état donné analysé de l'ordre de 1000 à 100000 fois dans le sous répertoire obtenu après soustraction du répertoire de référence. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.30
Claims (18)
- REVENDICATIONS1. Procédé d'hybridation soustractive permettant l'enrichissement en séquences spécifiques d'un répertoire d'acides nucléiques correspondant à un état donné dit « répertoire test », en comparaison avec un répertoire correspondant à un état de référence dit « répertoire de référence », comprenant les étapes consistant à : a) obtenir les ADNs des répertoires à comparer de manière à : - disposer d'au moins une portion d'ADN comprenant la cassette globale pour chacun des répertoires, - obtenir le répertoire test sous forme d'ADN circulaire simple brin, et - disposer au moins du brin anti-parallèle de celui du répertoire test à partir du répertoire de référence ; b) hybrider les ADNs des répertoires à comparer obtenus à l'étape a) dans des conditions de températures d'hybridation et de dénaturation supérieure à la température de fusion des domaines encadrant la cassette de séquence variable et inférieure à la température de fusion des « homohybrides » ; c) ajouter une ou plusieurs endonucléase(s) de restriction dont le site de clivage est présent dans la portion d'ADN comprenant la cassette globale pour chacun des répertoires qui est obtenue à l'étape a) ; d) incuber le mélange d'hybrides dans des conditions où l'endonucléase de restriction est active pour conduire à l'hydrolyse des « homohybrides » ; e) transformer des cellules hôtes avec ledit mélange et cultiver les cellules transformées dans des conditions où les vecteurs qui contiennent les molécules du répertoire test peuvent se multiplier et se propager dans lesdites cellules hôtes ; f) récupérer les vecteurs «intègres » qui contiennent les molécules du répertoire test enrichi en clones spécifiques, et éventuellement concentrer lesdits vecteurs.
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les répertoires à 30 comparer sont présents dans des vecteurs de « phage display».
- 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits vecteurs de « phage display» sont à base de génome de phages filamenteux du genre inovirus.
- 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les répertoires à comparer sont sous forme de banques avec des cassettes de séquence variable d'une longueur inférieure ou égale à 51 nucléotides.
- 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ADN du répertoire de référence est obtenu par amplification par PCR de la cassette globale.
- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ADN du répertoire test est obtenu par amplification in vivo.
- 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les conditions d'hybridation de l'étape b) consistent à incuber le mélange à une température unique d'hybridation/dénaturation qui est supérieure à la température de fusion des domaines encadrant la cassette de séquence variable, et inférieure à la température de fusion des « homohybrides ».
- 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les étapes b) et c) sont réalisées simultanément.
- 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'endonucléase de restriction utilisée pour réaliser l'étape c) est Kpnl.
- 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée directement dans le tampon d'activité de l'enzyme qui sera utilisée à l'étape c) et pour linéariser les « homohybrides » lors de l'étape d).
- 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on procède directement à la transformation du mélange obtenus à l'issue de l'étape d) dans des bactéries chimiocompétentes.
- 12. Utilisation de deux répertoires d'acides nucléiques correspondant respectivement à un échantillon test et un échantillon de référence, pour effectuer une comparaison par hybridation soustractive, dans laquelle : - les répertoires à comparer contiennent la même cassette globale - le répertoire test est sous forme d'ADN circulaire simple-brin - la cassette globale du répertoire de référence est dans une orientation antiparallèle à celle du répertoire test.
- 13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que une endonucléase de restriction dont le site de clivage est présent dans la cassette globale est en outre utilisée pour linéariser les « homohybrides » uniquement et conserver les « hétérohybrides ».
- 14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que les deux répertoires à comparer sont issus de la même banque, et en particulier sont présents dans des inovirus.
- 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que le répertoire test est présent dans un vecteur inoviral ou dans un phagemide et le répertoire de référence est présent dans un vecteur de « bacterial disp/ay ».
- 16. Kit destiné à l'enrichissement en séquences spécifiques d'un répertoire d'acides nucléiques correspondant à un état donné dit « répertoire test », en comparaison avec un répertoire correspondant à un état de référence dit « répertoire de référence », ledit kit comprenant : - un vecteur capable d'exprimer des peptides en surface, - un couple d'amorces pour l'obtention in vitro, par exemple par PCR, de la portion d'ADN comprenant la cassette globale du répertoire de référence, et - une ou plusieurs endonucléase(s) de restriction qui possède(nt) un site de clivage dans la cassette globale des répertoires test et de référence à comparer, et le tampon nécessaire à son activité optimale.
- 17. Kit selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit vecteur contient déjà la banque de peptides.
- 18. Kit selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit vecteur sert pour la construction d'une banque de peptides.
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| EP1394254A1 (fr) * | 2002-08-16 | 2004-03-03 | Hartung, Thomas, Dr.rer.nat. Dr.med. | Méthode pour la production d'antigènes, antigènes et leur utilisation |
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Non-Patent Citations (2)
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| RIVOLTA MARCELO N ET AL: "A novel and simple methodology to generate subtracted cDNA libraries", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 23, no. 13, 1995, pages 2565 - 2566, XP002586435, ISSN: 0305-1048 * |
| SHARMA SHIWANI ET AL: "Identification of novel bovine RPE and retinal genes by subtractive hybridization", MOLECULAR VISION, vol. 8, no. 32 Cited August 13, 2002, 16 July 2002 (2002-07-16), pages 251 - 258 URL, XP002586436, ISSN: 1090-0535 * |
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