CN108368538B - 用于生成邻近探针的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了多对邻近探针以及其生产方法，每对能够结合至不同的靶标分析物，其中每对探针的第一和第二邻近探针包括缀合至其分析物结合部分的通用寡核苷酸，并且与通用寡核苷酸杂交的是不同的标签寡核苷酸，其包括对所有标签寡核苷酸共同的通用补体结构域和对每个标签寡核苷酸唯一的单一结构域。

Description

用于生成邻近探针的方法
本发明涉及制造探针(邻近探针)的方法，该探针用于样品中的分析物的基于邻近探针(proximity probe)的检测试验。具体而言，本发明涉及用于生产具有不同靶标分析物结合特异性并且包括不同核酸结构域的多种邻近探针对的改进的方法。
邻近探针通常配对使用，例如第一和第二邻近探针，并且配对的每个邻近探针通常包括对靶标分析物具有特异性的分析物-结合结构域，和功能结构域，例如偶联至其的核酸结构域。然而，存在其中可以组合使用多于两种例如三种邻近探针的邻近试验(proximity assay)版本。分析物-结合结构域可以是例如核酸“适配体”(Fredriksson etal(2002)Nat Biotech 20:473-477)或可以是蛋白质的，比如单克隆或多克隆抗体(Gullberg et al(2004)Proc Natl Acad Sci USA101:8420-8424)。每个邻近探针对的各自的分析物-结合结构域可以针对分析物上不同的结合位点具有特异性，该分析物可以由单个分子或相互作用分子的复合物构成，或可以具有相同的特异性，例如在靶标分析物作为多聚体存在的情况下。
邻近试验依赖于“邻近探测”的原理，其中通过多种(即，两种或更多种，通常两种或三种)探针的结合检测分析物，当该探针通过结合至分析物而邻近时(因此是“邻近探针”)，使得生成信号。邻近试验中信号的生成涉及核酸结构域和/或被添加至样品或由其它探针(一种或多种)携带的进一步的功能部分之间的相互作用。当邻近探针对(或组)变得彼此紧密邻近时，这主要当两种(或所有)都被结合至相同分析物分子、或复合物中不同分析物分子上的其各自的位点时发生，功能结构域(例如核酸结构域)能够直接地或间接地相互作用，以生成可检测的信号(即在样品中先前不存在的核酸序列)，其可以被检测以指示样品中靶标抗原的存在。因而信号生成取决于探针(更具体地通过由它们携带的核酸或其它功能部分/结构域)之间的相互作用，并且通常需要形成一种或多种核酸双链体，例如通过核酸结构域的直接或间接相互作用，其使得能够进行连接反应(核酸结构域彼此的连接反应，或其中核酸结构域(一个或多个)模板化(template)一个或多个单独添加的寡核苷酸的连接)和/或延伸反应(例如核酸结构域中的至少一种的延伸反应)，从而生成可检测的信号。信号因此仅当两个(或所有)必需探针都已经结合至分析物时出现，从而将改进的特异性赋予检测系统。近年来已经发展了邻近探测的概念，并且现在许多基于此原理的试验是本领域熟知的，例如基于邻近探针的检测试验包括邻近延伸试验(PEA)、邻近连接试验(PLA)(US 6878515、WO 01/61037)、原位PLA(WO9949079)(其是用于以局部方式原位检测细胞或组织样品中的分子的PLA，其中环状核酸分子由连接一个或多个(通常2个)添加的寡核苷酸——该连接由一个或多个核酸结构域模板化——形成，其中环状分子通过滚环扩增——其由核酸结构域启动——被扩增，从而以将扩增产物定位至邻近探针并且因此定位至分析物)，和邻近HCR PCT/EP2015/052340。
制造用于基于邻近的检测试验的探针需要缀合(即偶联或连接)核酸结构域(或部分)至分析物结合结构域。核酸结构域(即功能结构域，其与样品中的另一个核酸结构域或核酸分子相互作用以产生可检测的信号)通常被缀合(例如通过共价键)至分析物结合结构域以形成邻近探针。然而，由于核酸结构域(功能结构域)通常被直接附加至其各自的分析物结合结构域，包括特定核酸和分析物结合结构域的每个邻近探针的制造通常需要活化核酸分子和其随后缀合至其各自的分析物结合结构域。因而，无论何时需要新的邻近探针，新的寡核苷酸分子将被活化并且缀合至需要的分析物结合结构域。这增加与生成用于基于邻近的检测试验的新试剂相关联的时间和成本，并且是遏制高通量(例如多重)邻近检测试验的扩展的重大因素。
另外，已知活化寡核苷酸的效率(并且因而将核酸结构域缀合至其分析物结合结构域的效率)变化。由于每次制造探针时，寡核苷酸被独立地活化并且缀合至其各自的分析物结合结构域，难以确保不同的邻近探针(例如缀合至不同核酸结构域的分析物结合结构域)包括类似水平的寡核苷酸。邻近检测试验中不同靶标分析物的检测效率将因而是可变的，其妨碍样品中不同水平的分析物之间的任何比较。
出于类似的原因，还难以在经由此方法生产的单独批次的探针之间取得一致性，因而影响邻近检测试验的再现性和限制可以进行的研究规模。
当前的制造方法还不能提供直接方式以改变基于指定给检测试验的特异性的序列(即以改变被缀合至用于检测试验的特定邻近探针的分析物结合结构域的核酸结构域)，例如使得探针(或探针对)可以以不同的邻近检测格式使用，或连同不同的检测试剂使用，或以便制作不同的探针组合。目前，生成新的邻近探针，即分析物结合结构域和不同的核酸结构域，需要活化和缀合具有新序列的新的寡核苷酸分子至分析物结合结构域。如上面记载的，这增加与生成用于基于邻近的检测试验的新试剂相关联的时间和成本。
本发明试图克服制造用于基于邻近的检测试验的探针中的上述限制，并且因而提供了用于制造邻近探针的改进的方法。更具体地，本发明提供了用于制造邻近探针对——其可以被用于基于邻近的检测试验——的改进的方法。
最宽泛地，本发明提供了制造邻近探针对的方法，所述对包括第一和第二邻近探针，其中每个邻近探针包括分析物结合结构域和部分双链核酸结构域并且对中的每个邻近探针可以同时结合至靶标分析物，并且其中在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，邻近探针对的核酸结构域能够直接地或间接地相互作用，所述方法包括：
a.将第一通用寡核苷酸缀合至第一分析物结合部分以形成第一通用缀合物；
b.将第二通用寡核苷酸缀合至第二分析物结合部分以形成第二通用缀合物；
c.使第一标签寡核苷酸——其包括与第一通用寡核苷酸互补的第一通用补体结构域和不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交的第一单一结构域——与第一通用缀合物的第一通用寡核苷酸杂交，从而以形成第一邻近探针；
d.使第二关联(cognate)标签寡核苷酸——其包括与第二通用寡核苷酸互补的第二通用补体结构域和不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交的第二单一结构域——与第二通用缀合物的第二通用寡核苷酸杂交，从而以形成第二邻近探针；
其中所述第一和第二单一结构域能够介导彼此相互作用——直接地或间接地，从而使得第一和第二邻近探针的核酸结构域能够相互作用；
e.选择第一和第二邻近探针，从而提供邻近探针对。
选择步骤(e)是将探针对匹配在一起以制作(或提供)邻近探针组合的步骤。可选地表达的，步骤(e)可以是将第一邻近探针与关联的第二邻近探针配对的步骤。如下面进一步讨论的，关联的邻近探针包括能够彼此相互作用的核酸结构域。步骤(e)因而可以被视为组合第一和第二邻近探针以制作或获得邻近探针对的步骤。然而，在这方面将理解组合可以在理论上完成，并且未必需要或涉及物理组合邻近探针的两个成员(例如以进行第一和第二邻近探针的物理混合物)。当进行使用探针的邻近试验时，第一和第二邻近探针在使用中可以被组合(例如作为物理混合物)。在另一个实施方式中，第一和第二邻近探针的组合对可以被一起用于邻近试验，而未必以物理掺合物被提供或使用。换句话说，它们都可以被用于邻近试验，但是可以被单独地提供或添加至测试样品。因而，在邻近探针的组合或对中，两个探针不需要以掺合物被提供，而是可以被单独地提供。进一步，邻近探针对可以被提供为较大的邻近探针组或群组(例如文库)的一部分。例如组或文库中的邻近探针对可以被设计一起使用，例如作为根据本发明的邻近探针对。
同样，标签寡核苷酸组或文库中的第一和第二标签寡核苷酸对可以被设计一起使用，或在理论上配对，例如用作根据本发明的邻近探针对的一部分。
因而，本发明还提供了邻近探针对，所述对包括第一和第二邻近探针，其中每个邻近探针包括分析物结合结构域和部分双链核酸结构域并且对中的每个邻近探针可以同时结合至靶标分析物，并且其中在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，邻近探针对的核酸结构域能够直接地或间接地相互作用，其中：
a.第一所述邻近探针包括缀合至第一分析物结合部分的第一通用寡核苷酸和与第一通用寡核苷酸杂交的第一标签寡核苷酸，其中第一标签寡核苷酸包括与第一通用寡核苷酸互补的第一通用补体结构域和不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交的第一单一结构域；和
b.第二所述邻近探针包括缀合至第二分析物结合部分的第二通用寡核苷酸和与第二通用寡核苷酸杂交的第二关联标签寡核苷酸，其中第一标签寡核苷酸包括与第二通用寡核苷酸互补的第二通用补体结构域和不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交的第二单一结构域，
其中所述第一和第二单一结构域是能够介导彼此相互作用——直接地或间接地——的关联结构域，从而当所述邻近探针已经结合至其靶标分析物时，使得第一和第二邻近探针的核酸结构域能够相互作用。
在本发明的方法和试剂盒中，第一和第二通用寡核苷酸可以是相同的或不同的。
这样的邻近探针对还可以称为“杂交探针”，即标签寡核苷酸与通用缀合物杂交的探针。
如本文描述的邻近探针对包括针对特定靶标分析物具有特异性的第一和关联的第二邻近探针，并且包括当所述探针已经结合至其靶标分析物时能够相互作用的核酸结构域。然而，如上面记载的，第一和第二邻近探针未必被物理地组合例如在它们的制造之后，并且单独地被制造和/或选择或获得的第一和第二邻近探针被认为包括邻近探针对。因此可以单独地选择和提供邻近探针对中的每个(例如作为单独的等分试样或在单独的容器中)，同时其仍被认为是根据本发明的邻近探针对的组成。
当考虑改造大量基于邻近的检测试验以多重进行，即用于同时或并行检测样品中的多于一种靶标分析物(参见例如WO2012/057689的方法)时，与上面概述的邻近探针的制造相关联的问题是复杂的。样品中多种靶标分析物的检测需要生成多种不同的可检测的信号，其每个在样品内可以被单独地检测。这通常通过使用多对邻近探针来实现，每对邻近探针具有不同的靶标分析物结合特异性，并且包括具有至少一个单一寡核苷酸序列(即其在用于检测试验的另一个探针的核酸结构域中不存在或指示用于检测试验的另一个探针的核酸结构域)的核酸结构域。
这样的方法通常需要制造多对邻近探针，并且因而当前需要多个不同寡核苷酸分子的单独的化学活化，以及将多个不同活化的寡核苷酸分子单独地缀合至多个不同的靶标结合部分。如上面记载的，与生成邻近探针相关联的时间和成本随着需要的探针的数目增加。因此，将明显的是，这代表对增加基于邻近的检测试验的多重方面的显著障碍。
因此，本发明的方法可以以多重被用于提供用于生成多对邻近探针的改进的方法。不同于将不同的寡核苷酸分子缀合至多个第一分析物结合部分(结构域)中的每个和多个第二分析物结合部分(结构域)中的每个(其将需要化学活化多个不同的寡核苷酸结构域)，单个第一通用寡核苷酸和单个第二通用寡核苷酸可以被分别缀合至多个第一和第二分析物结合结构域中的每个。如果第一和第二通用寡核苷酸是相同的，仅单个种类的通用寡核苷酸需要被活化。此方法因而减少制造多个邻近探针对需要的活化和缀合反应的数目，这是由于它仅需要单个通用寡核苷酸(其中第一和第二通用寡核苷酸是相同的)或两个不同的第一和第二通用寡核苷酸分子的化学活化。此方法因而克服与制造多对邻近探针相关联的障碍中的许多，并且提供了用于制造多对邻近探针的高效、低成本、和高质量制造方法。
本发明因此根据上面概述的方法提供了制造多对邻近探针的方法，其中邻近探针中的每对包括第一和第二邻近探针，并且其中每对能够结合至不同的靶标分析物，所述方法包括：
a.将第一通用寡核苷酸缀合至多个第一分析物结合部分中的每个，以形成第一通用缀合物组；
b.将第二通用寡核苷酸缀合至多个第二分析物结合部分中的每个，以形成第二通用缀合物组；
c.使多个不同的第一标签寡核苷酸中的一个与第一通用缀合物组的第一通用寡核苷酸杂交，每个不同的第一标签寡核苷酸包括第一通用补体结构域，其对所有第一标签寡核苷酸是共同的并且其与第一通用寡核苷酸互补；和第一单一结构域，其对每个不同的第一标签寡核苷酸是唯一的并且其不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交，从而形成多种第一邻近探针；
d.使多个不同的第二关联标签寡核苷酸中的一个与第二通用缀合物组的第二通用寡核苷酸杂交，每个不同的第二标签寡核苷酸包括第二通用补体结构域，其对所有第二标签寡核苷酸是共同的并且其与第二通用寡核苷酸互补；和第二单一结构域，其对每个不同的第二标签寡核苷酸是单一的并且其不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交，从而形成多种第二邻近探针；
e.从所述多种第一邻近探针选择多个第一邻近探针和从所述多种第二邻近探针选择多个关联的第二邻近探针，从而以提供多对邻近探针。
本发明因而提供了用于生产多对邻近探针的方法，其中仅一个或两个通用寡核苷酸需要被同时地和并行地化学活化并且单独地缀合至多个不同的靶标分析物结合部分中的每个，每个具有不同的靶标分析物结合特异性。因而，不同于缀合多个不同的寡核苷酸(分析物结合结构域对的核酸结构域)，仅一个或两个通用寡核苷酸被缀合，以形成一对(第一和第二)通用缀合物。通过使不同的标签寡核苷酸与通用缀合物杂交，这些通用缀合物可以然后被用于制备具有不同核酸结构域的多个不同的邻近探针。由于需要较少的单独活化反应(即仅1次或2次)，这可以以大批量发生，因而允许针对将寡核苷酸分子缀合至邻近探针而实现的大得多程度的一致性。由于每个分析物结合结构域将以基本上相同的程度被偶联至其通用寡核苷酸，因而可以提高批次间抑制性和多个寡核苷酸内一致性二者。与将等价的寡核苷酸缀合至分析物结合结构域将需要的寡核苷酸的量相比，还可以使用小得多量的寡核苷酸进行标签寡核苷酸与通用寡核苷酸的杂交，并且因而与使用现有方法可能的规模相比，可以以更小的规模进行标签寡核苷酸中的每个的合成。这进一步降低与邻近探针生产相关联的成本。
术语“分析物结合部分”和“分析物结合结构域”具有相同的含义并且在本文可交换地使用。然而，在一个实施方式中，分析物结合部分可以被视为通用寡核苷酸被附加(缀合)至其以形成邻近探针的分析物结合结构域的部分。分析物结合结构域可以因而被视为分析物结合部分，其被附加至通用寡核苷酸或邻近探针的核酸结构域。
另外，本发明允许在检测试验中采用的与特定靶标分析物检测试验相关联的核酸结构域的直接‘切换’。由于标签寡核苷酸——其包括单一结构域——仅经由与通用寡核苷酸的互补区通过杂交而非通过共价缀合结合至分析物结合结构域，将认为提供如下条件是不重要的：该条件将破坏标签寡核苷酸和通用寡核苷酸之间的杂交(例如通过加热)，从而以允许标签寡核苷酸与分析物结合结构域解离。相反，进一步不同的标签寡核苷酸可以随后被允许与通用结构域杂交。这可以被完成，例如以改变指定给特定试验的序列特异性(例如如果序列被发现难以检测在样品中存在的不同的非关联序列或与其相互作用)，或为了改变可以被进行以检测特定分析物的试验，例如从邻近延伸试验改变为邻近连接试验。下面更详细地讨论了可以使用通过本发明的方法制造的探针进行的试验，并且技术人员将理解标签寡核苷酸的单一结构域可能被如何设计，以便适合用于给定的试验。
通用寡核苷酸可以被视为通用连接物(即第一和第二通用连接物)以允许包括单一和特异性序列的标签寡核苷酸(例如多个标签寡核苷酸之一)与第一或第二通用缀合物杂交。多个第一和第二标签寡核苷酸中的每个——每个包括单一结构域和通用结构域——可以从而与缀合至第一或第二分析物结合结构域的第一或第二通用寡核苷酸组中的每个杂交，其产生多对探针，每对具有不同的靶标分析物结合特异性，并且包括在结合邻近探针对至其各自的靶标分析物之后能够直接或间接相互作用的核酸结构域。通用补体结构域(以及通过推论，通用寡核苷酸)可以被视为通用杂交位点。
在进一步的方面，本发明提供了如上面限定的多对邻近探针，其中每对邻近探针包括第一和第二邻近探针并且其中每对能够结合至不同的靶标分析物，其中：
a.多个第一邻近探针中的每个包括缀合至第一分析物结合部分的第一通用寡核苷酸和与第一通用寡核苷酸杂交的多个不同的第一标签寡核苷酸中的一种，其中每个不同的第一标签寡核苷酸包括第一通用补体结构域，其对所有第一标签寡核苷酸是共同的并且其与第一通用寡核苷酸互补；和第一单一结构域，其对每个不同的第一标签寡核苷酸是唯一的并且其不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；并且
b.多个第二邻近探针中的每个包括缀合至第二分析物结合部分的第二通用寡核苷酸和与第二通用寡核苷酸杂交的多个不同的第二关联标签寡核苷酸中的一种，其中每个不同的第二标签寡核苷酸包括第二通用补体结构域，其对所有第二标签寡核苷酸是共同的并且其与第二通用寡核苷酸互补；和第二单一结构域，其对每个不同的第二标签寡核苷酸是唯一的并且其不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；
其中每对邻近探针的所述第一和第二单一结构域是能够直接地或间接地介导彼此相互作用的关联结构域，从而使得当所述邻近探针已经结合至其靶标分析物时，第一和第二邻近探针的核酸结构域能够相互作用。
邻近探针对能够同时结合至靶标分析物，从而使得其核酸结构域邻近。邻近探针对的第一和第二邻近探针可以因此被视为是配对的，或视为是彼此关联的。可选地表达的，邻近探针对的第一和第二成员可以被描述为是“匹配的”。因而可以关于其关联的或匹配的邻近探针，即配对——其具有能够结合至样品中的相同靶标分析物的分析物结合结构域——中的第二邻近探针，提及第一邻近探针。显著地，这些不需要为了被认为是邻近探针‘对’而被物理地组合，并且因而第一邻近探针和单独的、关联的第二邻近探针代表邻近探针对。因而，如本文使用的，术语“关联的”或“匹配的”简单地意思是邻近探针形成将一起用于邻近试验的功能对，或是将一起用于邻近试验的功能对的一部分。更具体地，“关联的”或“匹配的”核酸结构域、标签寡核苷酸或单一结构域能够彼此直接或间接相互作用，即是相互作用的结构域或寡核苷酸对。换句话说，它们可以彼此直接或间接相互作用以生成，或导致生成信号，更具体地，借助其可以检测靶标分析物(为邻近试验的靶标的分析物)的信号。
根据本文描述的方法选择(或获得)第一和第二(或多个第一和第二中的每个)邻近探针，从而以获得关联的(或多个关联的)邻近探针对。然而，根据本发明的匹配的邻近对不需要为了被认为是关联的邻近探针对而被物理地组合(例如通过掺合)；因而可以单独地选择和提供根据本发明的第一和第二邻近探针(即包括第一和第二通用结构域和缀合至其的核苷酸结构域)(例如作为单独容器中单独的等分试样)。邻近探针对可以，例如，被单独地选择并且仅在使用中由希望检测样品中特定靶标分析物的人组合。然而，第一和第二邻近探针应当被认为是邻近探针对，而不管它们是否被物理地组合。
多个第一或第二邻近探针中的每个可以被类似地单独选择或提供，并且仍然分别代表多个第一邻近探针或多个第二邻近探针。
邻近探针的分析物结合结构域可以是能够选择性地结合至靶标分子的任何分子。例如，结合结构域可以选自蛋白质，比如抗体，该术语在本文被广泛地使用以包括任何类型的抗体或抗体衍生分子并且因而包括单克隆或多克隆抗体、嵌合抗体、抗体片段(例如Fab或Fv)或其衍生物(例如scFv或双抗体)、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自的噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生蛋白、肽、碳水化合物、核酸比如适配体或包括靶标核酸的互补序列的核酸分子、或其组合。在本发明的优选实施方式中，分析物结合结构域是蛋白质，优选地抗体或其衍生物或片段。
在本发明的具体方面，在本发明的多对邻近探针——其包括能够结合至样品中两个或更多个不同的靶标分析物的邻近探针对——之中，多对邻近探针中的每对邻近探针将优选地具有朝向不同靶标分析物的结合特异性。换句话说，每个第一邻近探针和其关联的第二邻近探针将能够结合至不同的靶标分析物，并且多个邻近探针对之中仅一个第一邻近探针和其关联的第二邻近探针将能够结合特定靶标分析物。
本文描述的邻近探针的核酸结构域(即包括通用寡核苷酸和标签寡核苷酸)经由通用寡核苷酸被缀合至邻近探针的分析物结合结构域。通用寡核苷酸可以通过其5’或3’末端被缀合至分析物结合结构域，并且因而通用寡核苷酸的3’或5’末端可以根据需要自由地与标签寡核苷酸中的其互补序列杂交(即标签寡核苷酸可以根据需要包括游离的3’或5’末端)。
标签寡核苷酸包括通用补体结构域，其与通用寡核苷酸互补，并且可以从而经由沃森-克里克或类似的碱基配对以反平行方式与通用寡核苷酸杂交。在本发明的一方面，第一和第二通用寡核苷酸可以是不同的，即第一通用寡核苷酸可以被缀合至第一分析物结合部分，并且第二不同寡核苷酸可以被缀合至第二分析物结合部分。因而，在将第一和第二通用寡核苷酸缀合至各自的分析物结合部分之后，第一和第二通用缀合物可以包括不同的通用寡核苷酸。在这样的方面，第一和第二标签寡核苷酸的通用补体结构域也将是不同的，并且将分别与第一和第二通用寡核苷酸互补。
然而，在本发明的另一方面，第一和第二通用寡核苷酸可以是相同的，即相同的通用寡核苷酸可以被缀合至第一和第二分析物结合结构域。换句话说，在将通用寡核苷酸缀合至分析物结合部分之后，第一和第二通用缀合物可以包括相同的通用寡核苷酸。因此，在这样的方面，第一和第二标签寡核苷酸的通用补体结构域也将是相同的，并且将与相同的通用寡核苷酸序列互补。
标签寡核苷酸进一步包括不能够与通用寡核苷酸杂交的单一结构域。通用补体结构域可以因此朝向标签寡核苷酸的5’末端或3’末端定位，这取决于需要标签寡核苷酸如何在检测试验中起作用(即是否需要单一结构域位于标签寡核苷酸的3’或5’末端)。邻近探针的核酸结构域因而是部分双链的，即它包括双链区(包括与标签寡核苷酸的通用补体结构域杂交的通用寡核苷酸)和单链区(包括具有游离的3’或5’末端的标签寡核苷酸的单一结构域)。换句话说，邻近探针可以被视为包括游离的单链末端(标签寡核苷酸的单一结构域)，其可用于与在样品中存在的另一个寡核苷酸分子相互作用(例如另一个邻近探针的核酸结构域，或共同的杂交模板等)，如下面更详细讨论的。
如下面将更详细描述的，单一结构域可以包括多于一个结构域或“功能区”。因而，单一结构域可以包括多个不同的结构域或区(例如2、3、4或更多个不同的结构域)。这可能取决于其中使用探针的邻近试验的性质，如何检测邻近探针相互作用，是否扩增邻近探针相互作用的产物，是否以多重进行试验等。例如，单一结构域可以包含一个或多个共同或通用结构域/区(共同或通用序列)，例如通用引物的引物结合位点或用于固定化的序列等，和一个或多个单一区或单一序列(例如标签序列)。通过代表性实例，单一结构域可以包含一个共同或通用序列和两个单一序列。
在进一步的实施方式中，标签寡核苷酸可以包含一个或多个另外的结构域，其可以是单一结构域和/或通用或共同结构域。
如上面记载的，邻近探针对的核酸结构域被设计以相互作用并且因此邻近探针对的第一和第二标签寡核苷酸也可以被视为彼此‘关联的’或‘匹配的’(或配对的)。换句话说，在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，均能够结合至共同的靶标分析物的关联的或匹配的邻近探针对包括当彼此邻近时能够直接或间接相互作用的第一和第二标签寡核苷酸。
第二邻近探针的第二标签寡核苷酸可以因而被视为‘关联的’或‘匹配于’，或‘配对于’配对内的第一邻近探针的第一标签寡核苷酸，并且标签寡核苷酸将仅与其对应的关联配偶体相互作用并且将不与来自另一个邻近探针的标签寡核苷酸，即不是其关联配偶体的寡核苷酸，相互作用(直接地或间接地)。虽然核酸可以被描述为‘关联的’，但是这未必意思是各自的寡核苷酸是同源的或以任何方式彼此相关，或共享任何特征(例如结构或序列特征)；而是，术语‘关联的’意思是标签寡核苷酸能够与邻近探针对中另一个邻近探针的标签寡核苷酸相互作用。然而，在一些实施方式中，如下面将更详细描述的，核酸结构域，或更具体地其单一结构域可以彼此互补，以便它们可以彼此杂交。
在本发明的具体方面中，第一邻近探针的标签寡核苷酸将仅能够与其关联配偶体——即结合至相同靶标分析物的第二邻近探针——的标签寡核苷酸相互作用。标签寡核苷酸可以因此在一个实施方式中不能够与在样品中存在的邻近探针的进一步的核酸结构域相互作用。
在多个邻近探针之中，可能期望的是，邻近探针的标签寡核苷酸将不与来自非关联的邻近探针的标签寡核苷酸——即来自能够结合至不同靶标分析物的邻近探针的标签寡核苷酸——相互作用(直接地或间接地)。因而，第一标签寡核苷酸可以优选地仅能够结合至其关联的邻近探针的第二标签寡核苷酸，或关联的探针对的标签寡核苷酸可以仅能够结合至特异于(例如特定于或专用于)该探针对的互补核酸分子或寡核苷酸(例如杂交模板)，并且不结合至为不同的邻近探针对提供的互补核酸分子或寡核苷酸。换句话说，第一标签寡核苷酸可以仅与其关联的第二标签寡核苷酸相互作用。因而，在一个实施方式中，在多对邻近探针之中，每个第一标签寡核苷酸仅能够与单个第二标签寡核苷酸相互作用。
然而，在多对邻近探针之中，在某些实施方式中可能期望的是，特定的第一标签寡核苷酸能够与多于一种第二标签寡核苷酸相互作用或反之亦然，或实际上多个第一标签寡核苷酸能够与多个第二标签寡核苷酸相互作用。因而，可选地，多个第一标签寡核苷酸可以能够与相同的第二标签寡核苷酸相互作用。类似地，多个第一标签寡核苷酸中的每个可以能够与多个第二标签寡核苷酸相互作用。换句话说，在多对邻近探针之中，至少一个第一标签寡核苷酸可以能够与多于一个第二标签寡核苷酸相互作用。这可能是有用的，例如在如下情况下：其中靶标分析物是相互作用物(interaction)或复合物(例如2种蛋白质或蛋白质的2个亚基之间)并且不同的相互作用物/复合物是可能的，并且期望检测或测定已经相互作用或复合的不同蛋白质或亚基的数目。可以使用多个邻近探针，每个能够结合至复合物或相互作用物的一个可能的成员，并且所述探针可以配对于(或关联于)大量(多个)第二邻近探针——其能够结合至相互作用物或复合物的不同的或可选的可能成员。还可能存在其它情况，其中可能期望的是，邻近探针配对于或关联于多个其它(例如第二)邻近探针。在这样的情况下可能期望的是，区分哪个探针(例如特异于复合物或相互作用物的哪个分析物/分析物结合位点/成员)已经与哪个其它或第二探针(换句话说，哪个探针已经结合至邻近的靶标分析物)配对。因而，在这样的情况下，标签寡核苷酸的单一结构域可以包括共同序列，或共同结构域，以及单一序列。换句话说，单一结构域作为整体可以不是唯一的。
因此，标签寡核苷酸的单一结构域可以包括共同序列和单一序列。在具体的实施方式中，共同序列(或共同结构域)可以介导第一和第二标签寡核苷酸(并且因此核酸结构域)之间的相互作用，并且单一序列可以被用于区分或鉴定(即标示)邻近探针。单一序列可以因而被视为标签序列(或结构域)或视为识别序列(或结构域)。
因而，在本发明的具体实施方式中，在多对邻近探针之中，每个第一标签寡核苷酸可以在其单一结构域中包括共同序列，并且每个第二标签寡核苷酸可以在其单一结构域中包括共同序列，该共同序列(优选地位于各自的单一结构域的游离端)能够介导标签寡核苷酸之间的相互作用。
本发明的标签寡核苷酸可以以相同的方式被视为本领域已知的邻近探针的核酸结构域，即通过常规手段制造的探针，通过将功能核酸分子直接缀合至分析物结合结构域。标签寡核苷酸可以因此通过其游离端以与本领域已知的邻近探针的核酸结构域相同的方式相互作用。
邻近探针对的核酸结构域的游离端(即标签寡核苷酸的游离端)之间的相互作用可以是直接的或间接的。例如，在一些实施方式中，标签寡核苷酸的游离端可以包括彼此互补区，即它们能够通过沃森-克里克或其它碱基配对以反平行方式彼此杂交，从而以形成双链体区。可选地，核酸结构域可以间接相互作用，即它们的相互作用可以由添加至样品的进一步的核酸分子(例如寡核苷酸)介导，并且该进一步的核酸分子能够与核酸结构域中的一个或多个杂交。进一步的或添加的核酸分子可以因此在一个实施方式中被视为核酸结构域的共同模板，更具体地共同杂交模板(例如两个核酸结构域，或更具体地其标签寡核苷酸/单一结构域可以与其杂交的共同分子)。共同模板可以作用以模板化连接反应，例如核酸结构域(标签寡核苷酸)彼此的连接。可选地，核酸结构域可以一起充当用于连接一个或多个添加的寡核苷酸的连接模板，具体而言分子内或分子间连接以形成环状核酸分子，其可以通过使用RCA反应的扩增被检测。在进一步的实施方式中，一个或多个核酸结构域(标签寡核苷酸)可以模板化连接并且一个核酸结构域可以以另一种(或另外的)方式有助于或介导相互作用，例如通过充当RCA的引物。如下面更详细讨论的，因此可以基于需要本发明的邻近探针的检测方法选择介导标签寡核苷酸之间的相互作用的手段。
在一个实施方式中，至少一个标签寡核苷酸的单一结构域具有游离的3’末端，当探针结合至邻近的靶标分析物时，其能够与配对中的另一个邻近探针的标签寡核苷酸的单一结构域内的互补区直接或间接(即由进一步的寡核苷酸分子介导)杂交，从而形成双链体。所述游离的3’末端可以经由互补区彼此直接杂交。
其它杂交形式也是可能的，例如其中一个邻近探针的标签寡核苷酸具有游离的3'末端并且另一个具有游离的5'末端，其中标签寡核苷酸(或更具体地部分标签寡核苷酸)可以彼此杂交或与共同的杂交模板杂交，或具有游离的3'末端的两个标签寡核苷酸(或更具体地其部分)与共同的杂交模板(例如添加的寡核苷酸分子)杂交，在每种情况下，在杂交之后存在至少一个可用的3'末端。WO 2012/104261中显示了探针可能如何相互作用的多种实例，其在此通过引用以其全部并入。
在优选的实施方式中，在杂交之后，可以通过聚合酶催化的链延伸反应延伸杂交分子中的一个或多个(例如标签寡核苷酸/单一结构域)并且可以检测延伸产物。这样的相互作用形成所谓的邻近延伸试验(PEA)的基础。因而，本发明的邻近探针或根据本发明制造的邻近探针被优选地用于PEA。在WO2012104261、WO0161037和WO2013113699中更详细描述了PEA。
如上面记载的，本发明的探针还可以被用于基于连接的邻近依赖性试验(即邻近连接试验或PLA)(即其中至少第一和第二邻近探针包括核酸结构域并且它们之间的相互作用涉及连接反应)。一般地看，探针的核酸结构域可以介导(例如参与，直接地或间接地)连接反应。这样的连接反应可以涉及邻近探针的核酸结构域的连接，和/或核酸结构域(一个或多个)可以模板化连接反应。
在一种形式中，核酸结构域可以结合至一个或多个夹板(splint)寡核苷酸(共同的模板)，其介导它们的相互作用(具体地在连接的情况下，与结构域杂交的夹板寡核苷酸可以充当连接反应的模板)并且夹板帮助或介导此相互作用。在其它形式/实施方式中，夹板可以被提供为第三邻近探针的核酸结构域。核酸结构域可以被彼此直接或间接连接。在直接连接的情况下，结构域的末端与彼此相邻的夹板杂交，以便它们可以彼此直接连接。在间接连接的情况下，结构域的末端在其间存在缺口的情况下与夹板杂交，该缺口可以通过杂交进一步的缺口寡核苷酸——核酸结构域的末端被分别连接至其——被填充，或在连接之前，缺口可以通过延伸核酸结构域的杂交的3’末端被填充。因而，PLA可以包括延伸反应并且还可以至少部分被视为PEA。多种PLA实施方式，包括这样的“缺口-填充”实施方式，在文献中被很好描述，例如在WO 01/61037或在WO 2007/107743、WO9949079、WO03012119中。
在进一步具体的实例中，邻近探针的核酸结构域中的一个或多个(具体地核酸结构域的单一结构域(或游离端))可以作用以模板化多个添加的寡核苷酸之一的连接。在一个这样的实施方式中，第一个添加的寡核苷酸可以与两个核酸结构域杂交，并且可以添加一个或多个进一步的寡核苷酸，其与结构域中的仅一个杂交，例如核酸结构域中的一个至每个，每个与第一个寡核苷酸的每个末端相邻，其可以在由核酸结构域模板化的反应中被连接至第一个寡核苷酸。
在可选的实施方式中，添加的寡核苷酸(一个或多个)可以通过连接反应被环化。因而，以邻近探针对的核酸结构域举例，其经由通用寡核苷酸被附加至各自的探针的分析物结合结构域，可以分别与添加的线性寡核苷酸(类似于“挂锁探针”)的(i)5'和3'末端，以及(ii)所述末端之间的区互补。通过结合至所述添加的寡核苷酸(一个或多个)，探针据说间接相互作用。当邻近探针对的两个探针由于结合至相同的分析物而邻近时，各自的探针的核酸结构域能够与添加的寡核苷酸的各自的部分杂交。与添加的寡核苷酸的5'和3'末端互补的核酸结构域模板化并列杂交，并且所述末端的连接(添加适当的连接酶)导致添加的寡核苷酸的环化。然后通过使用另一个核酸结构域作为引物的滚环扩增(RCA)检测此环化的寡核苷酸；配对的另一个探针的核酸结构域，其与连接的末端之间添加的寡核苷酸的区杂交，具有游离的3'末端。
将领会单个添加的寡核苷酸可以被替换为可以被连接在一起以形成环的两个寡核苷酸(这样的连接可以由一个或两个核酸结构域模板化，但是结构域中的一个将具有游离的3'末端以充当引物)。
在本发明的具体实施方式中，邻近探针对的标签寡核苷酸中至少一个的单一结构域可以包括二级结构的一个或多个区，例如茎-环结构或发夹。所述二级结构的区可以是未折叠的，以便允许关联的标签寡核苷酸对之间通过任何方便手段的相互作用，例如酶促裂解。在WO2012/152942中更详细讨论了解折叠包括二级结构的区的探针的方法，其内容在此通过引用以其全部并入。在特别优选的方面，在邻近探针对的邻近结合之后，第一标签寡核苷酸的单一结构域可以与二级结构的任何这样的区相互作用，例如通过破坏茎环结构，从而使其解折叠。二级结构的区可以因而被视为亚稳的二级结构，即热力学上不稳定但是动力学上稳定的二级结构。
如本文使用的，术语“杂交(hybridisation)”或“杂交(hybridises)”指的是在核苷酸序列——其是足够互补的以经由沃森-克里克或其它碱基配对形成双链体——之间形成双链体。当两个分子共享碱基对组织同源性时，那些核苷酸序列是彼此“互补的”。因此，标签寡核苷酸中的互补区指的是能够与其各自的通用寡核苷酸(即第一或第二通用寡核苷酸)形成分子间双链体的标签寡核苷酸(通用补体结构域)的部分。类似地，在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，标签寡核苷酸对的单一结构域可以直接或间接相互作用；所述相互作用可以因而导致形成分子间双链体，或者在两个标签寡核苷酸的游离端之间，或者在两个标签寡核苷酸的游离端中的每个和第三寡核苷酸分子(例如夹板寡核苷酸或共同的核酸分子)之间。
“互补”核苷酸序列将与特异性组合以在适当的杂交条件下形成稳定的双链体。例如，当部分第一序列可以以反平行结合至部分第二序列时，其中每个序列的3'-末端结合至另一个序列的5'-末端并且一个序列的每个A、T(U)、G和C然后分别与另一个序列的T(U)、A、C和G对齐，两个序列是互补的。RNA序列也可以包括互补的G＝U或U＝G碱基对。因而，两个序列在本发明下不需要具有“互补的”完美同一性。通常当在限定长度的分子内至少大约85％(优选地至少大约90％，和最优选地至少大约95％)的核苷酸共享碱基对组织时，两个序列是充分互补的。
在基于邻近的检测试验检测分析物取决于样品中分析物的存在和当这样的探针结合至分析物时检测邻近探针对之间的相互作用。探针之间(或更具体地，它们各自的关联核酸结构域之间)的相互作用因而是邻近依赖性的；邻近探针一起在分析物上的结合使它们邻近，以便它们(或更具体地，它们的核酸结构域)可以相互作用。
邻近探针对的第一和第二标签寡核苷酸中的至少一个将优选地在其单一结构域中包括特异于并且代表特定的靶标分析物——其是该特定的邻近探针对的靶标——的序列(单一标签序列)。这可以是如上面讨论的“单一序列”。邻近探针对的核酸结构域的相互作用可以产生样品中先前不存在的核酸序列，并且其可以包括上面讨论的单一标签序列，即可以被特异性检测的可检测的信号(例如其可以由来自不同邻近探针对的可检测的信号区分)。因而，一般而言，邻近探针对的核酸结构域之间(即第一和第二标签寡核苷酸的游离端之间)的相互作用导致生成核酸产物(可检测的信号)，其可以被检测，以便检测分析物。因而可以通过检测所述可检测的信号来检测分析物。
相反地，在多对邻近探针之中，每个邻近探针对可以在其单一结构域中包括对邻近探针对中的每个共同(即由其共享)的序列(通用标签序列)。所述序列可以被用作例如引物结合位点以允许由于邻近探针之间的相互作用形成的核酸分子的扩增，或可以被用于固定化或另外操作或操纵生成的核酸分子。
可以直接或间接进行在标签寡核苷酸的相互作用上生成的可检测的信号的检测。可以使用例如包括标记——其可以选自，但不限于，荧光团，荧光蛋白，放射性同位素，比色检测标记比如色原，磁性颗粒，颗粒比如碳、银或金，量子点，酶中的任一种或多种——的检测寡核苷酸实现信号的直接检测。因而，标志物的标记可以是直接“信号给出的”。
可选地，检测可以是间接的，其意思是可检测的信号必需被操纵或增强以使得其是可检测的。例如，可检测的信号可能需要一些进一步的处理，例如它可以被扩增，例如通过本领域已知的任何合适方法。因而由于相互作用形成或生成的核酸分子，例如连接和/或延伸产物，可以被扩增。根据需要扩增可以是线性的或指数的，其中感兴趣的代表性扩增方案包括但不限于：聚合酶链反应(PCR)；等温扩增，滚环扩增(RCA)，和其熟知的变型，比如超支化RCA等。其它核酸扩增方法可以包括环介导的等温扩增(LAMP)、智能扩增工艺(SMAP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、或连接酶链反应(LCR)。其中检测步骤包括扩增，扩增产物可以被检测，从而以检测靶标分析物。
如下面更详细描述的，可以非特异性或特异性地检测扩增产物。感兴趣的代表性非特异性检测方案包括采用信号产生系统——其选择性地检测双链DNA产物，例如，经由嵌入——的方案。发现用于这样的实施方式的代表性可检测的分子包括荧光核酸染色剂，比如菲啶鎓(phenanthridinium)染料，包括单体或当与核酸复合时给出增强荧光的其同源或异源二聚体。菲啶鎓染料的实例包括乙啶同源二聚体、溴化乙啶、碘化丙啶、和其它烷基取代的菲啶鎓染料。在本发明的另一个实施方式中，核酸染色剂是或掺入吖啶染料，或其同源或异源二聚体，比如吖啶橙、吖啶同源二聚体、乙啶-吖啶同源二聚体、或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本发明的又另一个实施方式中，核酸染色剂是吲哚或咪唑染料，比如Hoechst33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580(BIOPROBES 34,Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.,(May 2000))DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI(4',6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其它允许的核酸染色剂包括但不限于7-氨基放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751、选择的补骨脂素(呋喃香豆精)、苯乙烯基染料、金属络合物比如钌络合物、和过渡金属络合物(例如，包含Tb3+和Eu3+)。在本发明的某些实施方式中，核酸染色剂是菁染料或当与核酸缔合时给出增强荧光的菁染料的同源或异源二聚体。可以使用在Lee(1989)的美国专利号4,883,867、Yue et al.(1996)的美国专利号5,582,977、Yue et al.(1994)的美国专利号5,321,130、和Yue et al.(1995)的美国专利号5,410,030(所有四个专利通过引用并入)中描述的任何染料，包括以来自Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.的商标TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、PO-PRO和YO-PRO可商购的核酸染色剂。可以使用在Haugland et al.(1995)的美国专利号5,436,134、Yue et al.(1997)的美国专利号5,658,751、和Hauglandet al.(1999)的美国专利号5,863,753(所有三个专利通过引用并入)中描述的任何染料，包括以来自Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.的商标SYBR Green、EvaGreen、SYTO、SYTOX、PICOGREEN、OLIGREEN、和RIBOGREEN可商购的核酸染色剂。在本发明的又其它实施方式中，核酸染色剂是单体、同源二聚体或异源二聚体菁染料，其掺入氮杂或多氮杂苯并
Figure BDA0001690362650000171
唑鎓(polyazabenzazolium)杂环，比如氮杂苯并
Figure BDA0001690362650000172
唑、氮杂苯并咪唑、或氮杂苯并噻唑，其当与核酸缔合时给出增强荧光，包括以来自Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.的商标SYTO、SYTOX、JOJO、JO-PRO、LOLO、LO-PRO可商购的核酸染色剂。
通用寡核苷酸可以具有足以允许经由其通用补体结构域杂交标签寡核苷酸的任何长度。因而，通用寡核苷酸可以是5-40nt的长度，优选地15-30nt的长度。在具体的实施方式中，通用寡核苷酸可以是大约20nt的长度，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25nt的长度。然而，第一和第二通用寡核苷酸，其在本发明的某些实施方式中可以具有不同的序列，可以具有不同的长度，或可以是相同的长度。标签寡核苷酸的通用补体结构域可以优选地是与通用寡核苷酸相同的长度，然而，通用补体结构域不需要与整个通用寡核苷酸杂交，并且可以在某些实施方式中仅与其部分杂交。
通用寡核苷酸和标签寡核苷酸的通用补体结构域之间的相互作用应当是稳定的，即以便形成的双链体在检测反应的条件下不解离。在优选的实施方式中，形成的双链体的解链温度(Tm)大于45℃。例如，Tm可以是至少50℃，大于55℃，大于60℃或大于65℃。优选地，在第一和第二通用寡核苷酸不同时，在第一和第二标签寡核苷酸与第一和第二通用寡核苷酸之间形成的双链体的各自的Tm值将是类似的(即在10℃内，优选地在5℃内或更小)或相同的。用于计算给定核苷酸序列的Tm值的方法和公式是本领域已知的。例如，可以通过使用公式：Tm＝4℃×(G+C)+2℃×(A+T/U)计算近似Tm值。计算Tm值的软件也是本领域已知的。
在本发明的进一步优选的实施方式中，在多对邻近探针被用于多重检测形式时，标签寡核苷酸中的一个或两个可以包括通用标签序列，其可以被用于进一步的分析或检测步骤。在一个实施方式中，这可以包括通用引物结合位点，即使得共同的单个正向和/或反向扩增引物可以被用于在本文概述的任何检测方法中扩增通过多个邻近探针对的相互作用生成的多个核酸分子。在另一个实施方式中，通用标签序列可以包括用于分离邻近探针和/或可检测的信号的结合位点。通用标签序列可以例如是可固定化的，例如它可以能够与在固体表面或支持体上提供的捕获寡核苷酸杂交，或它可以被提供有用于附加至固体表面或支持体的手段，比如亲和结合对的成员例如，另一个成员或其被提供在支持体/表面上。
术语“多个”意思是多于一个，即至少2个。因而，多对邻近探针指的是至少2对邻近探针，每个能够结合至不同的靶标分析物。优选地，这指的是至少3、4、5、6、7、8、或9对邻近探针，或更多，例如至少10、20、50、100、200、500、1000或更多对邻近探针。类似地，如上面定义的，术语“多重”或“多重的”指的是每次同时和并行地进行方法(例如检测分析物或制造探针对)超过一项。因而，以代表性实例为例，多对邻近探针可以被用于多个不同靶标分析物的多重检测。
如上面讨论的，为了在基于邻近的检测试验中检测靶标分析物，邻近探针对结合至共同的靶标，从而使得它们各自的核酸结构域(或更具体地，在当前情况下，标签寡核苷酸的游离端或单一结构域)彼此邻近，并且允许它们相互作用。靶标分析物的性质因此不限于本发明，条件是可以发现针对靶标分析物具有特异性的合适的分析物结合结构域。
“分析物”可以是期望在检测试验中进行检测的任何物质(例如分子)或实体。分析物可以被视为试验方法的“靶标”。分析物可以因此是期望进行检测的任何生物分子或化合物，例如肽或蛋白质，或核酸分子或小分子，包括有机或无机分子。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒，或其片段或产物。因此，将可见分析物可以是任何物质或实体，针对其可以发展出特异性结合配偶体(例如亲和结合配偶体)。需要的只是分析物能够结合邻近探针对。
基于邻近探针的试验已经在检测蛋白质或多肽中发现了特别的效用。特别感兴趣的分析物可以因而包括蛋白质的分子比如肽、多肽、蛋白质或朊病毒或包括蛋白质或多肽组分的任何分子等，或其片段。
第一和第二邻近探针可以均包括相同的分析物结合结构域，或配对中的每个邻近探针的分析物结合结构域可以是不同的，这取决于待检测的靶标分析物。
在一个实施方式中，本发明的邻近探针对可以被用于检测包括单个分子的靶标分析物，即第一和第二邻近探针包括不同的分析物结合结构域并且可以同时结合至靶标分析物的两种不同的区(或表位)，即单个靶标分析物可以由两种不同的(关联)邻近探针同时结合。靶标分析物可以因而被认为是多表位的，即包括多个表位，其每个可以由不同的邻近探针靶向。因而，在此实施方式中，邻近探针对(包括第一和第二邻近探针)包括第一和第二分析物结合结构域，其是不同的并且其具有不同的结合特异性。本发明因而提供了使用本发明的探针检测靶标分析物的方法，其中靶标分析物是单个分子，其中第一和第二邻近探针的分析物结合结构域是不同的，并且其中第一和第二邻近探针结合至靶标分析物内不同的表位。
在进一步的实施方式中，本发明的探针对可以被用于检测两个或更多个分子亚单位的复合物，其可以或可以不彼此共价结合，并且其可以是相同的或不同的。因而除细胞或微生物之外，这样的复合分析物还可以是蛋白质复合物或蛋白质相互作用物。这样的复合物或相互作用物可以因而是同源或异源多聚体。分子例如蛋白质的聚集物也可以是靶标分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集物。分析物还可以是蛋白质或肽和核酸分子比如DNA或RNA之间的复合物。特别感兴趣的可以是蛋白质和核酸之间，例如调控因子比如转录因子和DNA或RNA之间的相互作用物。
在第一方面，复合物可以包括两个或更多个不同的生物学分子，即靶标分析物可以是异源多聚体，例如异源二聚体。在此实施方式中，第一和第二邻近探针包括不同的分析物结合结构域并且可以同时结合至复合物的两个不同的组分。例如，在包括组分A和B的生物学复合物中，第一邻近探针可以结合至组分A并且第二邻近探针可以结合至组分B。在此实施方式中，邻近探针对包括第一和第二分析物结合结构域，其是不同的并且其具有不同的结合特异性。本发明因而提供了使用本发明的探针检测靶标分析物的方法，其中靶标分析物是异聚生物学复合物，其中第一和第二邻近探针的分析物结合结构域是不同的，并且其中第一和第二邻近探针结合至所述复合物的第一和第二组分。
在进一步的方面，生物学复合物可以是同源多聚体，即包括相同生物学分子的两个或更多个拷贝的生物学复合物，例如同源二聚体。在此实施方式中，第一和第二邻近探针均包括相同的分析物结合结构域，并可以同时结合至生物学复合物中分析物的两个单独拷贝的相同区。第一和第二邻近探针可以因而包括相同的分析物结合结构域，其每个被缀合至不同的(即第一和第二)通用寡核苷酸。换句话说，第一和第二通用寡核苷酸可以被单独缀合至相同的第一和第二分析物结合结构域，即第一分析物结合结构域也是第二分析物结合结构域。因而在此实施方式中，在本制造方法的步骤(a)和(b)中形成的第一和第二通用缀合物将均具有相同的分析物结合结构域，以及偶联至其的不同的(即第一或第二)通用寡核苷酸分子。适当的第一和第二标签寡核苷酸可以然后与第一和第二缀合物杂交以形成第一和第二邻近探针。因而本发明提供了使用本发明的探针检测靶标分析物的方法，其中靶标分析物是同聚生物学复合物，其中第一和第二邻近结构域的分析物结合结构域是相同的，并且其中第一和第二邻近探针结合至多聚体的每个组分的相同区。
本发明的探针可以被用于检测任何样品中的靶标分析物。包括所有生物学和临床样品，例如生物体的任何细胞或组织样品，或源自其的任何体液或制品，以及样品比如细胞培养物、细胞制品、细胞溶胞产物等。还包括环境样品，例如土壤和水样品或食物样品。样品可以是新鲜制备的或它们可以以任何常规方式被预处理例如进行储存。
代表性样品因而包括可以包含生物分子或任何其它期望或靶标分析物的任何材料，其包括例如食物和同类产品，临床和环境样品。样品可以是生物学样品，其可以包含任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。这样的生物学材料可以因而包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、包括蓝藻的藻类、真菌、细菌、原生动物等。代表性样品因而包括全血和血源性产品比如血浆、血清和血沉棕黄层、血细胞、尿、粪便、脑脊液或任何其它体液(例如呼吸分泌物、唾液、乳等)、组织、活组织检查物、细胞培养物、细胞悬浮液、条件培养基或细胞培养成分的其它样品等。样品可以以任何常规或期望方式被预处理以制备用于本发明的方法，例如通过细胞溶胞或纯化，分离分析物等。
通用寡核苷酸可以通过本领域已知的任何手段被偶联至分析物结合结构域，并且该手段可以是期望的或常规的并且可以是直接的或间接的例如经由连接基团。例如，结构域可以通过共价键(例如化学交联)或通过非共价缔合例如经由基于链亲和素-生物素的偶联(生物素被提供在一个结构域上，具体地寡核苷酸结构域，并且链亲和素在另一个上)彼此缔合。
通用寡核苷酸和分析物结合结构域通过键直接或通过连接基团间接接合在一起。在采用连接基团时，可以选择这样的基团以通过连接基团提供核酸结构域和分析物结合结构域的共价附接。连接基团，当存在时，在许多实施方式中是生物学惰性的。在代表性实施方式中，连接基团通常是至少大约50道尔顿，经常至少大约100道尔顿并且可以高达1000道尔顿或更大，例如如果连接基团包含间隔区，则高至1000000道尔顿，但是通常将不超过大约500道尔顿并且经常将不超过大约300道尔顿。通常，这样的连接体将包括间隔基团，其在具有反应官能性——其能够共价结合至核酸结构域或分析物结合结构域——的末端处终止。感兴趣的间隔基团可以包括脂肪族和不饱和烃链，包含杂原子比如氧(醚比如聚乙二醇)或氮(聚胺)的间隔区，肽，碳水化合物，可能包含杂原子的环或无环系统。间隔基团还可以由配体——其结合至金属，以便存在的金属离子配位两个或更多个配体以形成复合物——组成。具体的间隔区元件包括：1,4-二氨基己烷、苯二甲基二胺、对苯二甲酸、3,6-二氧杂辛二酸、乙二胺-N,N-乙酰乙酸、1,1'-亚乙基双(5-氧-3-吡咯烷羧酸)、4,4'--亚乙基二哌啶。
潜在的反应官能性包括亲核官能团(胺、醇、硫醇、酰肼)，亲电子官能团(醛、酯、乙烯酮、环氧化物、异氰酸酯、马来酰亚胺)，能够进行环加成反应、形成二硫键、或结合至金属的官能团。具体的实例包括伯胺和仲胺、异羟肟酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、氧化羰基咪唑、硝基苯基酯、三氟乙酯、缩水甘油醚、乙烯砜、和马来酰亚胺。
发现用于主题邻近探针的具体的连接体基团包括杂官能化合物，比如叠氮基苯甲酰酰肼、N-[4-(p-叠氮基水杨基氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫基]丙酰胺)、双-磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯、己二酰亚胺二甲酯、二琥珀酰亚胺酒石酸酯、N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-叠氮基苯基]-1,3'-二硫基丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛、和琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-碳酸酯、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)等。
邻近探针的核酸结构域可以由能够参与沃森-克里克型或类似的碱基对相互作用的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及合成核苷酸残基组成。因而，核酸结构域可以是DNA或RNA或其组合或任何修饰例如PNA或包含非核苷酸骨架的其它衍生物。
如上面讨论的，期望的是，可以以本领域已知的邻近探针——即功能性或反应性寡核苷酸结构域被直接缀合至分析物结合部分的邻近探针——相同的方式查看、处理或使用经由本发明的方法制造的邻近探针。下面提供了邻近检测试验中的杂交探针与常规的邻近探针(即本领域已知的探针)的比较。因此，将领会通过本发明的方法生成的邻近探针可以以正常方式被用于任何基于邻近的检测试验。标签寡核苷酸可以因而被设计以包括允许它们如可能需要的直接或间接相互作用的核酸序列。
在一个优选的实施方式中，本发明的探针可以适合用于邻近延伸试验。在此实施方式中，标签寡核苷酸中的至少一个包括游离的3’末端，当探针结合至邻近的靶标分析物时，其能够与配对中的另一个邻近探针的核酸结构域的单一结构域内的互补区直接或间接(即由进一步的寡核苷酸分子介导)杂交，从而形成双链体。使用另一个邻近探针(或与其杂交的寡核苷酸分子)的核酸结构域作为延伸模板，通过添加dNTP，DNA聚合酶可以然后延伸单一结构域的3’末端，因而形成延伸产物，其可以是可检测的信号或可以被用于提供可检测的信号，例如，如在美国专利号7,306,904和6,511,809中描述的。因而检测延伸产物以检测靶标分析物。用作延伸模板的分子在此实施方式中是线性的。
在具体的实施方式中，第一和第二标签寡核苷酸二者均可以包括游离的3’末端(即第一和第二标签寡核苷酸的单一结构域可以具有游离的3’末端)。所述游离的3’末端可以经由互补区彼此直接杂交，并且至少一个(或在一些实施方式中两个)标签寡核苷酸的3’末端可以使用另一个邻近探针的核酸结构域作为延伸模板由DNA聚合酶延伸。因而，在一个实施方式中，第一标签寡核苷酸的3’末端可以包括与第二标签寡核苷酸的3’末端的互补区。如上面记载的，在标签寡核苷酸的末端处(例如在3'末端处)的互补区不需要跨越它们的全长100％互补。因而，例如，可以容忍互补区中一个或多个错配的存在。错配可以在互补区的内部和/或它们可以在末端处，包括在标签寡核苷酸的3’端处。因而，在一些实施方式中，在标签寡核苷酸的3’末端处的端部核苷酸(一个或多个)(例如端部1至3个核苷酸)可以不是互补的。需要的是存在高产(productive)杂交，其足以允许标签寡核苷酸之间的相互作用例如延伸反应发生(例如延伸由彼此模板化的一个标签寡核苷酸)。
互补区(即标签寡核苷酸之间的“重叠”，或杂交区)的长度可以变化。例如其可以处于上面针对通用补体结构域与通用寡核苷酸的杂交指示的范围中。可选地，其可以是例如5至20、5至15、5至12或5至10个核苷酸长，或5、6或7中的任一个至20、18、15、12、10或9个核苷酸中的任一个长。
其它杂交和延伸形式也是可能的，例如其中一个邻近探针的标签寡核苷酸具有游离的3'末端并且另一个具有游离的5'末端，其中标签寡核苷酸(或更具体地部分标签寡核苷酸)可以彼此杂交或与共同的杂交模板杂交，或具有游离的3'末端的两个标签寡核苷酸(或更具体地其部分)与共同的杂交模板(例如添加的寡核苷酸分子)杂交，在每种情况下，在杂交之后存在至少一个可用的3'末端，其可以被延伸以形成可检测的延伸产物。在WO2012/104261中描述了邻近延伸试验的多种实例。然而，在这样的实施方式中，第一标签寡核苷酸的3’末端可以包括与在样品中存在的第三(夹板)寡核苷酸的区的互补区。共同的杂交模板或第三寡核苷酸优选是线性的。
在进一步的方面，本发明的探针可以适合用于邻近连接试验。在这样的方面，邻近探针中的一个的标签寡核苷酸可以包括游离的3’末端，并且另一个邻近探针的标签寡核苷酸可以包括游离的5’末端，并且各自的标签寡核苷酸的所述游离端可以包括与样品中第三(夹板)寡核苷酸的互补区。换句话说，标签寡核苷酸可以因而包括与进一步的寡核苷酸分子(连接模板)——其可以模板化标签寡核苷酸的游离端的连接(直接地或间接地)——的互补区。标签寡核苷酸的末端可以与所述进一步的寡核苷酸杂交，以便第一标签寡核苷酸的3’游离端和第二标签寡核苷酸的5’游离端彼此直接相邻，并且因而可以被直接连接，或可选地，连接可以是间接的，即在游离端与连接模板在之间存在间隔的情况下杂交时，该间隔被“缺口”寡核苷酸填充，以便每个游离端被连接至缺口寡核苷酸的一个末端。在一些实施方式中，游离端之间的间隔可以通过延伸游离的3'末端被“填入”，例如在聚合酶反应中，使用连接模板作为延伸模板。一旦游离的3'末端已经被延伸以与游离的5'末端相邻，两个末端可以通过连接反应被接合。
在又进一步的方面，本发明的探针可以适合用于原位邻近连接试验(原位PLA)。如上文描述的，本发明的探针可以模板化寡核苷酸分子(或寡核苷酸对，例如骨架和夹板寡核苷酸分子)的环化。以代表性实例为例，标签寡核苷酸可以因而具有分别与如下的互补区：添加的线性寡核苷酸(类似于“挂锁探针”)的(i)5'和3'末端，和(ii)所述末端之间的区。在添加适当的聚合酶之后，可以使用其中一个标签寡核苷酸的3’末端作为引物，通过可以任选地起始的环化寡核苷酸的滚环扩增(RCA)检测样品中分析物的存在。多联体RCA产物，其仅在邻近探针邻近结合时形成，提供了用于检测分析物的“替代”标志物。
其它基于邻近的检测试验是本领域已知的，例如邻近-杂交链反应(邻近-HCR)，如PCT/EP2015/052340中描述的。第一标签寡核苷酸可以在其游离端处包括与第二标签寡核苷酸的单一结构域的区——其不处于第二标签寡核苷酸的末端——的互补区，即第二标签寡核苷酸的游离端可以保持不结合至第一标签寡核苷酸，并且可以因而能够起始HCR。
因此，将可见本发明的邻近探针可以被用于任何常规的或期望的基于邻近的检测试验，并且技术人员将因而领会与第一和第二缀合物杂交的第一和第二标签寡核苷酸可以被设计以包括合适的单一结构域，这取决于待进行的检测试验。
参考下列实施例和附图可以更好地理解本发明，其中：
图1显示了比较常规的邻近探针对与杂交邻近探针对的示意图。A)常规的邻近探针，其中功能结构域(核酸结构域)被直接缀合至分析物结合结构域。B)邻近探针，其中通用寡核苷酸被缀合至每个邻近探针，并且包括通用补体结构域的标签寡核苷酸各自与通用寡核苷酸杂交。
图2显示了常规的邻近探针对和杂交邻近探针对的比较，并且提供了可能使用的示例性寡核苷酸序列。A)常规的邻近探针，其包括在其3’末端处的互补区。B)邻近探针，其包括通过其5’末端缀合至每个邻近探针的通用寡核苷酸；和标签寡核苷酸，其通过在其5’末端处的互补区与通用寡核苷酸杂交，并且其能够经由在其3’末端处的互补区直接相互作用。
图3显示了常规的邻近探针对和杂交邻近探针对的制造方法的比较。A)寡核苷酸被活化和缀合至分析物结合结构域中的每个以形成邻近探针对。B)通用寡核苷酸被活化和缀合至分析物结合结构域中的每个以形成第一和第二通用缀合物，并且标签寡核苷酸与每个通用寡核苷酸杂交以形成邻近探针对。
图4显示了经由常规方法和本文描述的方法制造多个邻近探针对的方法的比较。A)第一和第二寡核苷酸针对邻近探针对中的每个进行活化并且缀合至分析物结合结构域。总计6个寡核苷酸被活化以产生3个邻近探针对。B)第一和第二通用寡核苷酸被活化和缀合至第一和第二邻近探针中的每个。第一和第二标签寡核苷酸与每个通用寡核苷酸杂交以形成多个邻近探针对。总计2个寡核苷酸被活化以产生3个邻近探针对。
图5显示了与常规的邻近探针对比较，使用包括不同标签寡核苷酸序列的三个不同的邻近探针对(杂交探针)在邻近延伸试验中检测巨噬细胞集落刺激因子1(CSF-1)。A)三个单独的邻近探针对，每个包括不同的标签寡核苷酸对但是相同的分析物结合结构域。B)常规的邻近探针对。C)使用部分(A)和(B)的邻近探针滴定检测CSF-1。测试的所有杂交探针生成类似的信号水平(杂交序列对#1-#3)，并且当使用常规的邻近探针或杂交探针(序列#4对序列#1-#3)时，基于邻近的检测试验具有类似的灵敏度。
实施例
实施例1–邻近探针的制造方案
使用20倍摩尔过量的二苄基环辛炔-NHS酯(DBCO-NHS酯，CLK-A102N,JenaBioscience；新溶解于DMSO的0.67μL的DBCO-NHS酯的4mM溶液)在室温(RT)下活化10μL的抗体(2μg/μL，PBS中重构的)持续30min。在Zeba旋转脱盐柱(7K MWCO,Thermo Scientific)上纯化DBCO活化的抗体以去除未反应的DBCO-NHS酯。在纯化后，活化的抗体与4倍摩尔过量的叠氮化物修饰的寡核苷酸(通用寡核苷酸1和2)混合并且在4℃下培育过夜。
标签寡核苷酸在TE缓冲液中被重构并且以4倍摩尔过量被添加至通用缀合物。在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中，在室温下进行杂交30分钟。
实施例2–使用邻近探针对检测靶标分析物
在邻近延伸试验中使用包括通用寡核苷酸和三个不同的标签寡核苷酸对的三个单独的邻近探针对(杂交探针)，以及功能结构域被直接缀合至分析物结合结构域的第四个邻近探针对，以测试使用通用寡核苷酸方法生成的探针是否如常规的邻近探针一样在基于邻近的检测试验中有效。
使用Proseek方案(Olink AB)根据制造商的说明以一系列不同的浓度进行CSF-1的检测，以便获得每个邻近探针对的滴定曲线(参见图5C)。每对杂交探针被发现在靶标分析物的检测中是类似有效的，并且杂交探针中的每个被发现类似于功能核酸分子被直接缀合至分析物结合结构域的邻近探针进行。这证明杂交探针在基于邻近的检测试验中可以是有用的试剂。
Figure BDA0001690362650000271
Figure BDA0001690362650000281
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Claims (15)

1.一种制造多对邻近探针的方法，其中每对邻近探针包括第一和第二邻近探针并且每对能够结合至不同的靶标分析物，其中每个邻近探针包括分析物结合结构域和部分双链核酸结构域并且配对中的每个邻近探针可以同时结合至靶标分析物，并且其中在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，所述邻近探针对的所述核酸结构域能够直接相互作用，所述方法包括：
a.将第一通用寡核苷酸缀合至多个第一分析物结合部分中的每个，以形成第一通用缀合物组；
b.将第二通用寡核苷酸缀合至多个第二分析物结合部分中的每个，以形成第二通用缀合物组；
c.使多个不同的第一标签寡核苷酸中的一个与第一通用缀合物组中的每个第一通用寡核苷酸杂交，从而形成多种第一邻近探针，每个不同的第一标签寡核苷酸包括第一通用补体结构域，其对所有第一标签寡核苷酸是共同的并且其与第一通用寡核苷酸互补；和第一单一结构域，其包括单一序列，所述单一序列对每个不同的第一标签寡核苷酸是唯一的，并且其中所述第一单一结构域不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；
d.使多个不同的第二关联标签寡核苷酸中的一个与第二通用缀合物组中的每个第二通用寡核苷酸杂交，从而形成多种第二邻近探针，每个不同的第二标签寡核苷酸包括第二通用补体结构域，其对所有第二标签寡核苷酸是共同的并且其与第二通用寡核苷酸互补；和第二单一结构域，其包括单一序列，所述单一序列对每个不同的第二标签寡核苷酸是唯一的，并且其中所述第二单一结构域不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；
e.从所述多种第一邻近探针选择多个第一邻近探针并且从所述多种第二邻近探针选择多个关联的第二邻近探针，从而提供多对邻近探针；
其中至少一个第一邻近探针的所述第一标签寡核苷酸能够与多于一种第二邻近探针的所述第二标签寡核苷酸相互作用，其中所述第一和第二标签寡核苷酸能够通过杂交相互作用。
2.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二通用寡核苷酸是不同的。
3.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二通用寡核苷酸是相同的。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一和第二标签寡核苷酸包括游离的3’末端。
5.权利要求4所述的方法，其中所述第一和第二标签寡核苷酸在其3’末端处包括互补区；和/或
其中可以使用关联的标签寡核苷酸作为延伸模板延伸所述第一和/或第二标签寡核苷酸。
6.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中每个第一邻近探针的标签寡核苷酸能够与多于一种第二邻近探针的标签寡核苷酸相互作用。
7.权利要求6所述的方法，其中每个第一邻近探针的标签寡核苷酸能够与所有第二邻近探针的标签寡核苷酸相互作用。
8.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二标签寡核苷酸包括单一标签序列，其特异于并且代表特定靶标分析物，其中所述序列可以被用于鉴定在样品中存在的特定靶标分析物。
9.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二标签寡核苷酸包括通用标签序列，其对每对邻近探针是共同的，其中所述序列可以被用于操作或扩增由于所述标签寡核苷酸之间的相互作用形成的核酸分子。
10.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：
(i)所述第一和第二邻近探针包括不同的分析物结合结构域并且可以同时结合至相同分子的两个不同的区；或者
(ii)所述第一和第二邻近探针结合至生物分子复合物中的两个单独的分子；或者
(iii)所述第一和第二邻近探针包括不同的分析物结合结构域并且可以同时结合至异聚复合物中的两个单独的分子；或者
(iv)所述第一和第二邻近探针包括相同的分析物结合结构域并且可以同时结合至同聚复合物中的两个单独的分子。
11.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述分析物结合结构域是蛋白质的。
12.权利要求11所述的方法，其中所述分析物结合结构域是抗体。
13.多对邻近探针，每对包括第一和第二邻近探针并且每对能够结合至不同的靶标分析物，其中每个邻近探针包括分析物-结合结构域和部分双链核酸结构域并且配对中的每个邻近探针可以同时结合至靶标分析物，并且其中在将邻近探针对结合至其靶标分析物之后，所述邻近探针对的所述核酸结构域能够直接相互作用，其中：
多个第一邻近探针中的每个包括缀合至第一分析物结合部分的第一通用寡核苷酸和与所述第一通用寡核苷酸杂交的多个不同的第一标签寡核苷酸中的每个，其中每个不同的第一标签寡核苷酸包括第一通用补体结构域，其对所有第一标签寡核苷酸是共同的并且其与所述第一通用寡核苷酸互补；和第一单一结构域，其包括单一序列，所述单一序列对每个不同的第一标签寡核苷酸是唯一的，并且其中所述第一单一结构域不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；并且
多个第二邻近探针中的每个包括缀合至第二分析物结合部分的第二通用寡核苷酸和与所述第二通用寡核苷酸杂交的多个不同的第二关联标签寡核苷酸中的每个，其中每个不同的第二标签寡核苷酸包括第二通用补体结构域，其对所有第二标签寡核苷酸是共同的并且其与所述第二通用寡核苷酸互补；和第二单一结构域，其包括单一序列，所述单一序列对每个不同的第二标签寡核苷酸是唯一的，并且其中所述第二单一结构域不能够与第一或第二通用寡核苷酸杂交；
其中每对邻近探针的所述第一和第二单一结构域是关联的结构域，其能够直接地介导彼此的相互作用，从而使得当所述邻近探针已经结合至其靶标分析物时，所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域能够相互作用，其中至少一个第一邻近探针的所述第一标签寡核苷酸能够与多于一种第二邻近探针的所述第二标签寡核苷酸相互作用，其中所述第一和第二标签寡核苷酸能够通过杂交相互作用。
14.权利要求13所述的多对邻近探针，其中所述多对邻近探针如权利要求2至12中的任一项所限定。
15.权利要求13或14所述的多对邻近探针在邻近延伸试验中的用途，其中每对邻近探针中的至少一个所述标签寡核苷酸包括游离的3’末端，当探针结合至邻近的靶标分析物时，所述游离的3’末端能够与配对中的另一个邻近探针的核酸结构域的单一结构域内的互补区杂交，从而形成双链体，其中所述邻近延伸试验包括使用DNA聚合酶延伸所述3’末端，使用另一个邻近探针的核酸结构域作为延伸模板，以及检测延伸产物以检测靶标分析物。
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