JP2018533944A - 近接プローブの作成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a.第1のユニバーサルオリゴヌクレオチド(universal oligonucleotide)を第1の分析物結合部(analyte binding moiety)に接合させて第1のユニバーサル接合体(universal conjugate)を形成するステップと、
b.第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドを第2の分析物結合部に接合させて第2のユニバーサル接合体を形成するステップと、
c.第1のユニバーサル接合体の第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに、第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第1のユニバーサル相補ドメイン(universal complement domain)と、第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第1のユニークドメイン(unique domain)とを含む第1のタグオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることで、第1の近接プローブを形成するステップと、
d.第2のユニバーサル接合体の第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに、第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第2のユニバーサル相補ドメインと、第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第2のユニークドメインとを含む第2の同系(cognate)タグオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることで、第2の近接プローブを形成するステップであり、該第1のユニークドメインおよび第2のユニークドメインは、互いとの相互作用を直接的または間接的に仲介することが可能であり、これによって第1の近接プローブおよび第2の近接プローブの核酸ドメインが相互作用できるステップと、
e.第1の近接プローブおよび第2の近接プローブを選択することによって、一対の近接プローブを提供するステップを含む、方法である。
a.該第1の近接プローブは、第1の分析物結合部に接合した第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドと、前記第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第1のタグオリゴヌクレオチドとを含み、前記第1のタグオリゴヌクレオチドは、前記第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第1のユニバーサル相補ドメインと、第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第1のユニークドメインとを含んでおり、
b.該第2の近接プローブは、第2の分析物結合部に接合した第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドと、前記第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第2の同系タグオリゴヌクレオチドとを含み、前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、前記第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第2のユニバーサル相補ドメインと、第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第2のユニークドメインとを含んでおり、
該第1のユニークドメインおよび第2のユニークドメインは、互いとの相互作用を直接的または間接的に仲介することが可能な同系ドメインであり、これによって、第1の近接プローブおよび第2の近接プローブが標的分析物に結合した際に、第1の近接プローブおよび第2の近接プローブの核酸ドメインが相互作用できる。
a.第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドを複数の第1の分析物結合部のそれぞれに接合させて第1のユニバーサル接合体のセットを形成するステップと、
b.第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドを複数の第2の分析物結合部のそれぞれに接合させて第2のユニバーサル接合体のセットを形成するステップと、
c.前記第1のユニバーサル接合体セットの第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに、複数の異なる第1のタグオリゴヌクレオチドであって、そのそれぞれが、すべての第1のタグオリゴヌクレオチドに共通し、かつ前記第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第1のユニバーサル相補ドメインと、異なる第1のタグオリゴヌクレオチドのそれぞれに特有であり、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第1のユニークドメインとを含む、複数の異なる第1のタグオリゴヌクレオチドのうちの1つをハイブリダイズさせることで、複数の第1の近接プローブを形成するステップと、
d.前記第2のユニバーサル接合体セットの第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに、複数の異なる第2の同系タグオリゴヌクレオチドであって、そのそれぞれが、すべての第2のタグオリゴヌクレオチドに共通し、かつ前記第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第2のユニバーサル相補ドメインと、異なる第2のタグオリゴヌクレオチドのそれぞれに特有であり、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第2のユニークドメインとを含む、複数の異なる第2の同系タグオリゴヌクレオチドのうちの1つをハイブリダイズさせることで、複数の第2の近接プローブを形成することと、
e.該複数の第1の近接プローブから第1の近接プローブと、該複数の第2の近接プローブから第2の同系近接プローブとをそれぞれ複数選択することによって、複数の近接プローブ対を提供するステップとを含む、方法である。
a.前記複数の第1の近接プローブは、それぞれ、第1の分析物結合部に接合した第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドと、前記第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした複数の異なる第1のタグオリゴヌクレオチドのうちの1つとを含み、異なる第1のタグオリゴヌクレオチドは、それぞれ、すべての第1のタグオリゴヌクレオチドに共通し、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第1のユニバーサル相補ドメインと、異なる第1のタグオリゴヌクレオチドのそれぞれに特有であり、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第1のユニークドメインとを含んでおり、
b.前記複数の第2の近接プローブは、それぞれ、第2の分析物結合部に接合した第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドと、前記第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした複数の異なる第2の同系タグオリゴヌクレオチドのうちの1つとを含み、異なる第2のタグオリゴヌクレオチドは、それぞれ、すべての第2のタグオリゴヌクレオチドに共通し、かつ第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第2のユニバーサル相補ドメインと、異なる第2のタグオリゴヌクレオチドのそれぞれに特有であり、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第2のユニークドメインとを含んでおり、
各近接プローブ対の該第1のユニークドメインおよび第2のユニークドメインは、互いとの相互作用を直接的または間接的に仲介することが可能な同系ドメインであり、これによって、該近接プローブが標的分析物に結合した際に、第1の近接プローブおよび第2の近接プローブの核酸ドメインが相互作用できる。
10μlの抗体(PBS中2μg/μlで再構成)を、室温で30分間、20倍モル過剰のジベンジルシクロオクチン−NHSエステル(DBCO−NHSエステル、CLK−A102N、イエナ・バイオサイエンス社(Jena Bioscience);DBCO−NHSエステルの4mM溶液の0.67μlを新たにDMSOに溶解させた)と共に活性化した。DBCO活性化抗体を、ゼバ(Zeba)スピン脱塩カラム(7K MWCO、サーモ・サイエンティフィック社(Thermo Scientific))で精製して、未反応のDBCO−NHSエステルを除いた。精製後、活性化抗体を、4倍モル過剰のアジド変性オリゴヌクレオチド(ユニバーサルオリゴヌクレオチド1およびユニバーサルオリゴヌクレオチド2)と混合し、4℃で一晩インキュベートした。
近接伸長アッセイにおいて、ユニバーサルオリゴヌクレオチドと3つの異なるタグオリゴヌクレオチド対とを含む3つの異なる近接プローブ(ハイブリダイゼーションプローブ)対、および機能性ドメインが分析物結合ドメインに直接接合された第4の近接プローブ対を用いて、ユニバーサルオリゴヌクレオチド法を用いて作成したプローブが、近接度に基づく検出アッセイにおいて、従来の近接プローブほど効果的であるかどうかを調べた。
Claims (22)
- 複数の近接プローブ対を製造する方法であって、各近接プローブ対は、第1の近接プローブと第2の近接プローブとを含み、各近接プローブ対は異なる標的分析物に結合することができ、各近接プローブは、分析物結合ドメインと、部分的に二本鎖である核酸ドメインとを含み、近接プローブ対における各近接プローブは、標的分析物に対して同時に結合することができ、一対の近接プローブの前記核酸ドメインは、前記一対の近接プローブが標的分析物に結合する際に、直接的または間接的に相互作用することができるものであって、該方法は、
a.第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドを複数の第1の分析物結合部のそれぞれに接合させて第1のユニバーサル接合体のセットを形成するステップと、
b.第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドを複数の第2の分析物結合部のそれぞれに接合させて第2のユニバーサル接合体のセットを形成するステップと、
c.前記第1のユニバーサル接合体セットの各第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに、複数の異なる第1のタグオリゴヌクレオチドであって、そのそれぞれが、すべての第1のタグオリゴヌクレオチドに共通し、かつ前記第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第1のユニバーサル相補ドメインと、異なる第1のタグオリゴヌクレオチドのそれぞれに特有であり、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第1のユニークドメインとを含む、複数の異なる第1のタグオリゴヌクレオチドのうちの1つをハイブリダイズさせることで、複数の第1の近接プローブを形成するステップと、
d.前記第2のユニバーサル接合体セットの各第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに、複数の異なる第2の同系タグオリゴヌクレオチドであって、そのそれぞれが、すべての第2のタグオリゴヌクレオチドに共通し、かつ前記第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第2のユニバーサル相補ドメインと、異なる第2のタグオリゴヌクレオチドのそれぞれに特有であり、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第2のユニークドメインとを含む、複数の異なる第2の同系タグオリゴヌクレオチドのうちの1つをハイブリダイズさせることで、複数の第2の近接プローブを形成するステップと、
e.該複数の第1の近接プローブから第1の近接プローブと、該複数の第2の近接プローブから同系の第2の近接プローブとをそれぞれ複数選択することによって、複数の近接プローブ対を提供するステップとを含む、方法。 - 前記第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび前記第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドは、異なるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび前記第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドは、同じものである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドおよび前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションによって相互作用することができる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドおよび前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、遊離の3’末端を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドおよび前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、3’末端に相補的な領域を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドおよび/または前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、前記同系タグオリゴヌクレオチドを伸長の鋳型として伸長されてもよい、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドは、遊離の3’末端を有し、前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、遊離の5’末端を有し、前記第1のタグオリゴヌクレオチドおよび前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、各々の遊離末端で共通のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドおよび前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、環状化可能なオリゴヌクレオチド分子、または一対のオリゴヌクレオチド分子の環状化の鋳型として働く、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドは、第1の添加オリゴヌクレオチド分子の5’末端および3’末端に相補的な領域を有し、前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、該第1の環状化可能オリゴヌクレオチドの5’末端と3’末端との間の領域に相補的な領域、または第2の添加オリゴヌクレオチドに相補的な領域を有している、請求項9に記載の方法。
- 前記各第1の近接プローブのタグオリゴヌクレオチドは、その同系の第2の近接プローブのタグオリゴヌクレオチドとのみ相互作用してもよい、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記各第1の近接プローブのタグオリゴヌクレオチドは、2つ以上の前記第2の近接プローブのタグオリゴヌクレオチドと相互作用してもよく、好ましくはすべての前記第2の近接プローブのタグオリゴヌクレオチドと相互作用してもよい、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドおよび/または前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、特定の標的分析物に特異的で、かつ該特定の標的分析物を表すユニークタグ配列を含み、該配列を用いて試料中に存在する特定の標的分析物を特定してもよい、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のタグオリゴヌクレオチドおよび/または前記第2のタグオリゴヌクレオチドは、前記近接プローブ対に共通のユニバーサルタグ配列を含み、該配列を用いて、前記タグオリゴヌクレオチド間の相互作用の結果形成される前記核酸分子を処理または増幅してもよい、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の近接プローブおよび前記第2の近接プローブは、異なる分析物結合ドメインを含み、同じ分子の2つの異なる領域に同時に結合してもよい、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の近接プローブおよび前記第2の近接プローブは、生体分子複合体における別個の2つの分子に結合する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の近接プローブおよび前記第2の近接プローブは、異なる分析物結合ドメインを含み、ヘテロ複合体における別個の2つの分子に同時に結合してもよい、請求項16に記載の方法。
- 第1の近接プローブおよび第2の近接プローブは、同じ分析物結合ドメインを含み、ホモ複合体における別個の2つの分子に同時に結合してもよい、請求項17に記載の方法。
- 前記分析物結合ドメインは、タンパク質性である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分析物結合ドメインは、抗体である、請求項19に記載の方法。
- 複数の近接プローブ対であって、各近接プローブ対は、第1の近接プローブと第2の近接プローブとを含み、各近接プローブ対は異なる標的分析物に結合することができ、各近接プローブは、分析物結合ドメインと、部分的に二本鎖である核酸ドメインとを含み、近接プローブ対における各近接プローブは、標的分析物に対して同時に結合することができ、一対の近接プローブの前記核酸ドメインは、前記一対の近接プローブが標的分析物に結合する際に、直接的または間接的に相互作用することができるものであって、
a.前記複数の第1の近接プローブは、それぞれ、第1の分析物結合部に接合した第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドと、前記第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした複数の異なる第1のタグオリゴヌクレオチドのうちの1つとを含み、異なる第1のタグオリゴヌクレオチドは、それぞれ、すべての第1のタグオリゴヌクレオチドに共通し、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第1のユニバーサル相補ドメインと、異なる第1のタグオリゴヌクレオチドのそれぞれに特有であり、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第1のユニークドメインとを含んでおり、
b.前記複数の第2の近接プローブは、それぞれ、第2の分析物結合部に接合した第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドと、前記第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした複数の異なる第2の同系タグオリゴヌクレオチドのうちの1つとを含み、異なる第2のタグオリゴヌクレオチドは、それぞれ、すべての第2のタグオリゴヌクレオチドに共通し、かつ第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドに相補的な第2のユニバーサル相補ドメインと、異なる第2のタグオリゴヌクレオチドのそれぞれに特有であり、かつ第1のユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび第2のユニバーサルオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない第2のユニークドメインとを含んでおり、
各近接プローブ対の該第1のユニークドメインおよび第2のユニークドメインは、互いとの相互作用を直接的または間接的に仲介することが可能な同系ドメインであり、これによって、該近接プローブが標的分析物に結合した際に、前記第1の近接プローブおよび前記第2の近接プローブの核酸ドメインが相互作用できる、複数の近接プローブ対。 - 前記複数の近接プローブ対は、請求項2〜20のいずれか1項に記載のものである、請求項21に記載の複数の近接プローブ対。
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