CN117089641A - 一种基于脱氧核酶化学发光探针的crispr生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于脱氧核酶化学发光探针的CRISPR生物传感器及其应用，属于生物检测技术领域。本发明构筑了能够响应Cas12a激活的脱氧核酶化学发光探针，其由脱氧核酶、脱氧核酶互补链、磺达肝癸钠报告缓冲液组成。脱氧核酶互补链为RNA，能够与脱氧核酶部分互补，催化化学发光底物CDP‑Star产生化学发光信号。Cas12a激活后，脱氧核酶与脱氧核酶互补链形成的核酸结构被破坏，失去催化活性，无法产生信号。基于该脱氧核酶化学发光探针的CRISPR/Cas12a生物传感器用于核酸检测灵敏度高、特异性强、设备要求低，为各物种基因的临床检测、食品安全、环境监测提供了可靠的分析工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于脱氧核酶化学发光探针的CRISPR生物传感器及其应用，属于生物检测技术领域。
背景技术
生物传感器是待测目标物与生物分子结合并发生信号转换的一种传感装置，基于信号检测模式的不同，生物传感器可分为光化学生物传感器、荧光生物传感器、电化学生物传感器等。其中，荧光生物传感器因具有操作简单、响应速度快、时空分辨率高等优点而得到科研人员的广泛关注。另外，CRISPR技术正在融入新一代病原菌生物传感器的构建。CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌中的一种获得性免疫机制，基于该体系的切割特性，构建了多种新型的检测平台。然而，现有的CRISPR生物传感器大多以荧光信号作为读出方式，广泛依赖荧光与猝灭基团修饰的DNA作为报告子，存在荧光强度弱、结构不稳定、价格昂贵等缺点，这直接导致检测系统背景信号升高，灵敏度降低。此外，荧光技术与医疗机构广泛普及的化学发光检测平台不兼容，严重影响此项技术的转化与临床应用。化学发光技术具有背景信号低、灵敏度高、设备需求低等优势，相关设备在医疗机构普及度较高，然而，目前利用化学信号读出CRISPR检测信号的技术尚少。因此，有必要开发能够输出化学发光信号的新型CRISPR检测技术。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高灵敏、检测便捷、设备需求简单的化学发光报告元件，使其响应CRISPR/Cas12a激活时间，构筑基于脱氧核酶化学发光探针(DNAzymechemiluminescent reporter,DCR)的CRISPR/Cas12a生物传感器。
本发明的第一个目的是提供一种基于脱氧核酶化学发光探针的CRISPR生物传感器，包括以下组分：
目标核酸的扩增体系，
针对目标核酸设计的Cas12a和crRNA，
含有脱氧核酶和磺达肝癸盐的缓冲体系，
化学发光底物；
其中，所述Cas12a可被目标核酸激活并特异性切割脱氧核酶，使脱氧核酶失去催化活性，所述脱氧核酶可催化化学发光底物使底物发光。
进一步地，所述目标核酸可为任意DNA或RNA。
进一步地，所述扩增体系中含有扩增目标核酸的引物。
进一步地，扩增体系可为RAA扩增体系，即包含特异性引物对的RAA试剂盒，所述的特异性引物对为针对目标核酸设计的特异性引物对。所述RAA试剂盒的其他组分如RAA干粉测试管(包含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶等)、Buffer A、Buffer B等均是本领域技术人员公知的。所述RAA扩增体系由RAA干粉测试管加入包含上游引物(Primer F)、下游引物(Primer R)、Buffer A和无菌水和待测核酸的混合溶液，然后在测试管盖上加入Buffer B，盖上管盖，上下颠倒5～6次，低速离心10sec置于39℃孵育进行RAA扩增反应，RAA产物用于后续CRISPR/Cas12a识别反应。RAA扩增反应时间为10～20min。
进一步地，所述缓冲体系中含有与脱氧核酶部分互补的序列。
进一步地，所述与脱氧核酶部分互补的序列为RNA序列。实际使用时，孵育使其形成互补结构。目前尚无脱氧核酶互补链能够增强脱氧核酶对CDP-Star催化活性的报道，本发明发现，这一RNA序列能够增强脱氧核酶对CDP-Star催化活性，使所构建的方法检测灵敏度提高100倍。
进一步地，所述脱氧核酶含有SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步地，所述RNA序列含有SEQ ID NO.2所示的序列。
进一步地，所述化学发光底物包括CDP-Star。
进一步地，化学发光底物浓度可根据实际需要进行调整，如50μM。
进一步地，所述磺达肝癸盐在缓冲体系中的浓度为10-50μM。磺达肝癸盐不是传统的缓冲液组方，但是本发明发现磺达肝癸钠可以使DCR的信号响应提高约105倍，加入磺达肝癸钠有助于提高检测的灵敏度。
进一步地，除磺达肝癸钠盐，缓冲液还包括以下组分：Tris-HCl，NaCl、MgCl2和BSA，pH值为6.8～8.5。
进一步地，反应缓冲溶液中NaCl、Tris-HCl和MgCl2的摩尔比为4～6:1～3:1～4，BSA的终浓度为1～5mg/mL；优选地，反应缓冲溶液中NaCl、Tris-HCl和MgCl2的摩尔比为5:1:1，BSA的终浓度为1mg/mL，pH值为7.9；最优选地，反应缓冲溶液中各成分的终浓度为：50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mg/mL BSA，pH 7.9。
进一步地，含有脱氧核酶杂交分子和磺达肝癸盐的缓冲体系的制备方法为，将脱氧核酶与脱氧核酶互补链混合，加热至90-100℃保持一定时间，缓慢降温至室温，随后加入缓冲液。
进一步地，杂交体系中，脱氧核酶与脱氧核酶RNA互补链的摩尔比<1。
本发明的第二个目的是提供一种用于构建CRISPR生物传感器的脱氧核酶化学发光探针体系，包括脱氧核酶、与脱氧核酶部分互补的RNA序列、含有磺达肝癸盐的缓冲体系、以及化学发光底物。
进一步地，所述脱氧核酶含有SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步地，所述RNA序列含有SEQ ID NO.2所示的序列。
本发明的第三个目的是提供上述CRISPR生物传感器或脱氧核酶化学发光探针体系在制备检测产品中的应用，包括但不限于试剂盒等。
进一步地，所述检测产品用于核酸检测。
进一步地，所述检测包括但不限于基因变异检测、病原体检测、单核苷酸多态性检测等。
进一步地，检测产品用于非诊断、非治疗目的的核酸检测时，包括以下步骤：
S1、扩增目的基因；
S2、向扩增产物中加入针对目标核酸设计的Cas12a和crRNA、含有脱氧核酶和磺达肝癸盐的缓冲体系，孵育，加入化学发光底物后再次避光孵育，根据化学发光检测结果实现对目的基因的检测。
进一步地，所述检测产品用于检测弓形虫基因。
进一步地，检测弓形虫基因时，crRNA序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的最优检测方法原理如下：
本发明中脱氧核酶与脱氧核酶RNA互补链杂交，可以形成一定的空间结构，crRNA和Cas12a蛋白通过氢键紧密结合，crRNA能识别目标核酸，诱导Cas12a蛋白激活。待靶基因扩增产生大量目标核酸后，目标核酸激活Cas12a，切割脱氧核酶与脱氧核酶互补链杂交结构中的单链DNA(ssDNA)区域，使脱氧核酶中催化核心部位的磷酸二酯键断裂，从而失去催化CDP-Star脱磷酸的能力，从而无法产生化学发光。基于该设计，靶基因越多，Cas12a被激活越多，越多脱氧核酶被剪切，化学发光信号越低。
本发明的有益效果：
1)本发明使用能够催化产生化学发光信号的脱氧核酶，形成DCR，代替传统的荧光基团报告元件，相比于荧光有机小分子，脱氧核酶具有良好的光学性能和生物特性，其发光强度高、稳定性好、设备兼容性好、灵敏度高。该DCR体系是首个基于化学发光的CRISPR报告技术所形成的生物传感器，也是化学发光法首次与CRISPR技术结合并用于基因的检测。
2)本发明采用具有催化性质的脱氧核酶作为报告分子，该脱氧核酶无需化学修饰，价格便宜，化学发光强度大，结构稳定。基于DCR与CRISPR/Cas12a的生物传感器，相较于常用的PCR检测，借助RAA、CRISPR/Cas12a、DCR剪切等超灵敏步骤，灵敏度和特异性都大幅度提升；其次，本发明所有步骤均在恒温条件下进行，设备要求更低。综上，本发明的生物传感器在核酸现场检测中具有较大应用潜力。
附图说明
图1为本发明的CRISPR/Cas12a生物传感器检测过程示意图。
图2为基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测的线性关系图。
图3为不加入脱氧核酶互补链时，基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测的线性关系图。
图4为基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器对弓形虫核酸的特异性结果。
图5为不加入磺达肝癸钠时，基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测的线性关系图。
图6为加入脱氧核酶互补链DNA时，基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。药品和试剂：实验中使用的DNA、RNA、crRNA均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经HPLC纯化。NaCl、Tris和MgCl2，磺达肝癸钠等化学试剂购买自阿拉丁(上海，中国)。化学发光读数获得自TECANInfinite M200多功能酶标仪(瑞士)。RAA试剂盒从杭州众测生物科技有限公司购买，其他试剂均购买自国药试剂(上海，中国)，并且均为分析纯。
本发明涉及的序列信息如下：
表1核酸序列
实施例1基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器用于基因检测
(1)配制DCR：脱氧核酶与脱氧核酶互补链按照摩尔比1:2混合，加热至95℃保持10min，缓慢降温至室温，随后加入报告缓冲液10mM Tris-HCl，10mM NaCl、5mM MgCl2，以及磺达肝癸钠。在最终的溶液中，脱氧核酶与脱氧核酶互补链的摩尔浓度分别是5μM和10μM，磺达肝癸钠的浓度为25μM。
(2)配制CRISPR/Cas12a反应体系：将Cas12a蛋白(500nM,20μL)与crRNA(100nM,40μL)在20μL 10×反应缓冲溶液(500mM NaCl、100mM Tris-HCl、100mM MgCl2、10mg/mL BSA,pH 7.9)中混合孵育，最终反应缓冲溶液中各成分的终浓度为：50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mg/mL BSA，pH 7.9。
(3)扩增反应：使用RAA等温扩增试剂盒。将13.5μLddH2O和25μLBuffer A加入装有反应干粉的测试单元管中，适当摇晃待干粉溶解，低速离心10sec。取10μL至PCR管中，随后加入0.5μL 10μM Primer F、0.5μL 10μMPrimer R和2μL弓形虫核酸质粒(ddH2O、1*10-1nM、1*10-3nM、1*10-6nM、1*10-8nM、1*10-9nM、1*10-10nM、1*10-11nM、1*10-12nM)，PCR管盖加0.5μLBuffer B，盖上盖管，上下颠倒轻甩充分混匀5～6次，低速离心10sec。将PCR管放入PCR仪39℃，反应15min。反应结束后设置100℃，5min停止反应，放置在-20℃冰箱保存备用。
(4)取2μL RAA产物(不同浓度弓形虫核酸质粒)和18μL含有DCR的CRISPR/Cas12a识别体系加入PCR管中，37℃孵育15min，加入50mM CDP-Star，静置孵育10min。
(5)待上述反应结束后，吸取PCR管中溶液打入384孔板中，采用多功能酶标仪检测，选用化学发光检测模式，如图2所示可检测低至1*10-11nM的弓形虫核酸。
实施例2
在未引入脱氧核酶互补链的情况下，基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测
操作与实施例1类似，除步骤(1)中未加入脱氧核酶互补链，对应的体积用超纯水补齐。按照所述操作反应后，采用多功能酶标仪化学发光检测模式，如图3所示可检测低至1*10-9nM的弓形虫核酸，表明脱氧核酶互补链的加入对提高灵敏度具有重要作用。
实施例3
将脱氧核酶互补链替换为DNA序列，基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测
操作与实施例1类似，除步骤(1)中加入的脱氧核酶互补链为DNA，对应的体积用超纯水补齐。按照上述操作反应后，采用多功能酶标仪化学发光检测模式，如图4所示可检测低至1*10-9nM的弓形虫核酸，表明脱氧核酶互补链RNA对提高灵敏度具有重要作用。
实施例4
生物传感器特异性检测
如上述实施例1制备DCR后将2μL RAA扩增产物加入18μLCRISPR/Cas12a反应体系孵育，结束后再进行化学发光检测。RAA扩增操作加入的核酸模板分别为1*10-3nM弓形虫核酸、1*10-1nM弓形虫核酸单基因突变片段、1*10-1nM弓形虫核酸双基因突变片段、1*10-1nM弓形虫核酸三突变基因片段、1*10-1nM曼氏沙门氏菌(Cysticercuscellulosae)特征核酸和1*10-1nM血吸虫(Schistosoma)特征核酸。如图5所示，仅有弓形虫核酸使检测体系呈强荧光，其他核酸均呈低荧光，该体系对弓形虫529特征核酸具有高特异性。
对比例1
在未引入磺达肝癸钠的情况下，基于DCR的CRISPR/Cas12a生物传感器用于弓形虫检测
操作与实施例1类似，除步骤(1)中未加入磺达肝癸钠。按照所述操作反应后，采用多功能酶标仪化学发光检测模式，如图6所示可检测浓度大于1*10-6nM的弓形虫核酸，灵敏度显著低于加入磺达肝癸钠的情况(实施例1)，表明磺达肝癸钠的加入对提高灵敏度具有重要作用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (15)
1.一种基于脱氧核酶化学发光探针的CRISPR生物传感器，其特征在于，包括以下组分：
目标核酸的扩增体系，
针对目标核酸设计的Cas12a和crRNA，
含有脱氧核酶和磺达肝癸盐的缓冲体系，
化学发光底物；
其中，所述Cas12a可被目标核酸激活并特异性切割脱氧核酶，使脱氧核酶失去催化活性，所述脱氧核酶可催化化学发光底物使底物发光。
2.根据权利要求1所述的CRISPR生物传感器，其特征在于：所述缓冲体系中含有与脱氧核酶部分互补的序列。
3.根据权利要求2所述的CRISPR生物传感器，其特征在于：所述与脱氧核酶部分互补的序列为RNA序列。
4.根据权利要求1所述的CRISPR生物传感器，其特征在于：所述脱氧核酶含有SEQ IDNO.1所示的序列。
5.根据权利要求3所述的CRISPR生物传感器，其特征在于：所述RNA序列含有SEQ IDNO.2所示的序列。
6.根据权利要求1所述的CRISPR生物传感器，其特征在于：所述化学发光底物包括CDP-Star。
7.根据权利要求1所述的CRISPR生物传感器，其特征在于：所述磺达肝癸盐在缓冲体系中的浓度为10-50μM。
8.根据权利要求2所述的CRISPR生物传感器，其特征在于：将脱氧核酶与脱氧核酶互补链混合，加热至90-100℃进行反应，反应结束后加入含有磺达肝癸盐的缓冲液，得到含有脱氧核酶杂交分子和磺达肝癸盐的缓冲体系。
9.一种用于构建CRISPR生物传感器的脱氧核酶化学发光探针体系，其特征在于：包括脱氧核酶、与脱氧核酶部分互补的RNA序列、含有磺达肝癸钠的缓冲体系。
10.根据权利要求9所述的脱氧核酶化学发光探针体系，其特征在于：还包括脱氧核酶特异性催化的化学发光底物。
11.权利要求1-8任一项所述的CRISPR生物传感器或权利要求9或10所述的脱氧核酶化学发光探针体系在制备检测产品中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述检测包括基因变异检测、病原体检测、单核苷酸多态性检测。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，用于核酸检测时，包括以下步骤：
S1、扩增目的基因；
S2、向扩增产物中加入针对目标核酸设计的Cas12a和crRNA、含有脱氧核酶和磺达肝癸盐的缓冲体系，孵育，加入化学发光底物后再次避光孵育，根据化学发光检测结果实现对目的基因的检测。
14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述检测产品用于检测弓形虫基因。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：检测弓形虫基因时，crRNA序列如SEQ IDNO.3所示。
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