CN102323265B - 一种检测钾离子的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学领域，公开了一种检测钾离子的方法和试剂盒。本发明所述方法将蛋白水解酶与四苯硼锂组成混合液，在pH5.6-6.0的缓冲体系中，与待测样品反应后加入氢氧化钠混合，得到四苯硼钾悬浊液，然后在630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的钾离子浓度。本发明所述试剂盒包括3000-5000U/L的蛋白水解酶、80-120mmol/L的四苯硼锂、1-3mmol/L的氢氧化钠。本发明所述方法能够避免蛋白吸附钾离子以及蛋白变性浊度带来的误差，提高检测结果的准确性，可以广泛应用于钾离子浓度检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种检测钾离子的方法和试剂盒。
背景技术
电解质是指在水溶液中或熔融状态下能够导电的化合物。在人体中，电解质广泛分布在细胞内液和细胞外液中，其中细胞外液的电解质中主要阳离子是钠离子，主要的阴离子是氯离子和碳酸氢根离子；细胞内液的电解质中主要阳离子是钾离子和镁离子，主要的阴离子是磷酸氢根离子。这些电解质离子通过神经、体液调节与水形成动态平衡，两者共同参与机体的代谢活动等机体重要机能，对正常生命活动的维持起着非常关键的作用。
电解质离子和水之间的失衡会造成水和电解质紊乱，这对机体的正常生命活动影响极大。许多器官系统的疾病以及一些全身性的病理过程，都可以引起或伴有水和电解质紊乱。此外，外界环境的某些变化、某些医原性因素如药物使用不当，也常可导致水和电解质紊乱。如果得不到及时的纠正，水和电解质紊乱本身又可使全身各器官系统特别是心血管系统、神经系统的生理功能和机体的物质代谢发生相应的障碍，严重时常可导致死亡。
在所有电解质的离子中，血清钾离子浓度的轻微变化就能对心脏节律和功能产生明显的影响，所以钾离子浓度快速变化可引起紧急危及生命的后果。因此，在纠正水和电解质紊乱的过程中，血清钾离子浓度的检测是必要的。
现有检测钾离子的方法有很多，常用的有火焰光度法、离子选择电极法和酶法。离子选择电极法采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行血清等体液的钾离子测定，其专用仪器是通过离子选择电极与参比电极组合浸泡在待测标本中进行检测的。但是，该法中的电极在使用一定时间后会自动老化，寿命较短，需要经常更换，检测成本较大，不利于各基层医院的广泛使用。
火焰光度法分为内标准法和外标准法两种。由于外标准法操作误差较大，一般不采用。现在主要使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定钾离子的浓度，以标本与标准液的K/Li比值，计算K+的浓度。但是火焰光度法仪器受使用燃料的限制，并且测定步骤繁琐，存在一定误差，限制了其在钾离子检测中的应用。
随着各种半、全自动生化分析仪的普遍应用，酶法检测钾离子浓度也越来越普遍。但是，酶法中的试剂稳定性较差，且检测条件比较严格，如果操作不当，就会使检测结果出现误差。
鉴于上述原因，现有技术有利用比浊法对钾离子与四苯硼锂反应生成的悬浊液进行吸光度检测，从而计算出钾离子的浓度，其反应式如下：
K++LiB(C6H5)4→KB(C6H5)4↓+Li+
但是，血清中的钾离子包括游离的钾离子和被蛋白吸附的钾离子，被蛋白吸附的钾离子无法和四苯硼根反应，造成检测结果出现误差。同时，变性的蛋白会产生变性浊度，干扰KB(C6H5)4产生的浊度，也会使检测结果出现误差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测钾离子的方法和试剂盒，使得该试剂盒和方法能够提高检测钾离子的准确度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测钾离子的方法，将蛋白水解酶与四苯硼锂组成混合液，在pH5.6-6.0的缓冲体系中，与待测样品反应后加入氢氧化钠混合，得到四苯硼钾悬浊液，然后在630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的钾离子浓度。
其中，样品钾离子浓度(mmol/L)＝标准溶液浓度×A样/A标，所述待测样品、混合液和氢氧化钠的体积比为1∶20∶4。
本发明所述混合液中蛋白水解酶的酶活为3000-5000U/L，可通过市售获得，包括胃蛋白水解酶、胰蛋白水解酶、木瓜蛋白水解酶以及本领域技术人员公知的其他蛋白水解酶，所述混合液中四苯硼锂的浓度为80-120mmol/L，所述氢氧化钠的浓度为1-3mmol/L。
在现有技术中，钾离子与四苯硼锂反应生成四苯硼钾沉淀，但反应中存在蛋白干扰，因此会使结果出现误差。本发明在钾离子与四苯硼锂反应前，将蛋白水解酶提前与四苯硼锂混合，反应时被吸附的钾离子在蛋白水解酶的作用下，从蛋白分子的吸附下解脱出来，全部与四苯硼锂反应生成沉淀，由此避免检测结果出现的误差。对于待测样品中变性蛋白的干扰，本发明在钾离子与四苯硼锂反应后加入氢氧化钠，彻底消除反应液中产生的蛋白变性浊度，同时保留了KB(C6H5)4的浊度，避免变性浊度带来的误差。此外，本发明所述方法还包括在加入氢氧化钠同时加入体积分数为0.1-0.5％的曲拉通X-100、吐温20或吐温40。曲拉通X-100、吐温20或吐温40均为表面活性剂，它们能够促使沉淀颗粒均匀分散于溶液中，使悬浊液更加均匀，进一步增加了检测的准确性。
本发明所述缓冲体系由1.2-1.8mmol/L的柠檬酸、80-120mmol/L的Tris和24-28mmol/L的磷酸氢二钠组成，所述标准溶液由0.5-1g/L的叠氮钠、20-40g/L的牛血白蛋白和5mmol/L的氯化钾组成。
柠檬酸、Tris以及磷酸氢二钠作为缓冲体系，防止检测过程中pH值的较大波动，能够给检测样品提供一个稳定的检测环境。在标准溶液中，牛血白蛋白能够给氯化钾一个模拟的体内环境，减小在进行吸光度检测时产生基质效应，影响待测样品钾离子浓度的计算。而叠氮钠作为防腐剂，可以确保牛血白蛋白不易变质。
本发明还提供了一种检测钾离子的试剂盒，包括：
3000-5000U/L的蛋白水解酶、80-120mmol/L的四苯硼锂、1-3mmol/L的氢氧化钠。
其中，所述蛋白水解酶是本技术领域公知的一种包含多种蛋白水解酶的复合酶，主要包括胃蛋白水解酶、胰蛋白水解酶、木瓜蛋白水解酶以及其他蛋白水解酶，可通过市售获得。
此外，本发明所述试剂盒还包括：
1.2-1.8mmol/L的柠檬酸、80-120mmol/L的Tris、24-28mmol/L的磷酸氢二钠、表面活性剂和标准溶液，所述标准溶液由0.5-1g/L的叠氮钠、20-40g/L的牛血白蛋白和5mmol/L的氯化钾组成，所述表面活性剂为体积分数为0.1-0.5％的曲拉通X-100、吐温20或吐温40。
本发明试剂盒可以配制成双试剂，即由1.2-1.8mmol/L的柠檬酸、80-120mmol/L的Tris、24-28mmol/L的磷酸氢二钠、3000-5000U/L的蛋白水解酶、以及80-120mmol/L的四苯硼锂组成的试剂1，由1-3mmol/L的氢氧化钠、体积分数为0.1-0.5％的曲拉通X-100、吐温20或吐温40组成的试剂2，由0.5-1g/L的叠氮钠、20-40g/L的牛血白蛋白和5mmol/L的氯化钾组成的标准溶液。
本发明所述方法检测钾离子浓度具有较高准确度和精密度，试验结果显示，本发明所述方法检测的结果在质控品的±2SD范围内。此外，本发明对同一样品进行重复性检测，各结果之间的标准差率(变异系数)为2.50％，小于标准的3％。上述试验结果表明本发明具有很高的准确度和精密度。
由以上技术方案可知，本发明所述方法能够避免蛋白吸附钾离子以及蛋白变性浊度带来的误差，提高检测结果的准确性，可以广泛应用于钾离子浓度检测。
具体实施方式
本发明公开了一种检测钾离子的方法和试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种检测钾离子的试剂盒和方法做进一步说明。
实施例1：本发明所述方法
将蛋白水解酶与四苯硼锂组成混合液(蛋白水解酶酶活为4000U/L，四苯硼锂浓度为100mmol/L)，在pH5.8的1.5mmol/L的柠檬酸、100mmol/L的Tris、26mmol/L的磷酸氢二钠缓冲体系中，与待测样品反应3min后加入2mmol/L的氢氧化钠，同时加入0.3％曲拉通X-100混合，得到四苯硼钾悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，与经上述相同处理的标准溶液(由0.75g/L的叠氮钠、30g/L的牛血白蛋白和5mmol/L的氯化钾组成)的A标比浊，计算样品的钾离子浓度，公式为样品钾离子浓度(mmol/L)＝标准溶液浓度(5mmol/L)×A样/A标。
实施例2：本发明所述方法
将蛋白水解酶与四苯硼锂组成混合液(蛋白水解酶酶活为3000U/L，四苯硼锂浓度为80mmol/L)，在pH5.6的1.3mmol/L的柠檬酸、80mmol/L的Tris、24mmol/L的磷酸氢二钠缓冲体系中，与待测样品反应3min后加入1mmol/L的氢氧化钠，同时加入0.2％吐温20混合，得到四苯硼钾悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，与经上述相同处理的标准溶液(由0.5g/L的叠氮钠、20g/L的牛血白蛋白和5mmol/L的氯化钾组成)的A标比浊，计算样品的钾离子浓度，公式为样品钾离子浓度(mmol/L)＝标准溶液浓度(5mmol/L)×A样/A标。
实施例3：本发明所述方法
将蛋白水解酶与四苯硼锂组成混合液(蛋白水解酶酶活为5000U/L，四苯硼锂浓度为120mmol/L)，在pH6.0的1.7mmol/L的柠檬酸、120mmol/L的Tris、28mmol/L的磷酸氢二钠缓冲体系中，与待测样品反应3min后加入3mmol/L的氢氧化钠，同时加入0.4％吐温40混合，得到四苯硼钾悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，与经上述相同处理的标准溶液(由1g/L的叠氮钠、40g/L的牛血白蛋白和5mmol/L的氯化钾组成)的A标比浊，计算样品的钾离子浓度，公式为样品钾离子浓度(mmol/L)＝标准溶液浓度(5mmol/L)×A样/A标。
实施例4：本发明所述方法的准确度分析
试验仪器：CB171半自动生化分析仪；
检测样品：中生北控质控血清(钾离子靶值为4.12mmol/L，
为3.88-4.36mmol/L)；
CB171半自动生化分析仪：温度为37℃，反应方法为终点法，测定波长为630nm，反应方向为正反应。
采用实施例1至实施例3的检测方法对上述质控血清分别进行检测。具体结果为：实施例1检测结果为4.18mmol/L；实施例2检测结果为4.23mmol/L；实施例3检测结果为4.20mmol/L。3次检测结果表明，本发明所述方法的检测结果位于质控血清的+2SD范围内，具有较高准确性。
实施例5：本发明所述方法的精密度分析
试验仪器：CB171半自动生化分析仪；
检测样品：任意一血清样品；
CB171半自动生化分析仪：温度为37℃，反应方法为终点法，测定波长为630nm，反应方向为正反应。
采用实施例1至实施例3的检测方法分别对同一待测样品重复检测10次，其中，实施例1检测方法的检测结果见表1。
表1检测样品钾离子浓度(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示，标准差率为2.50％，小于标准的3％，实施例2、3检测方法的检测结果的标准差率同样小于3％，表明本发明所述方法具有高精密度。
实施例6：本发明所述方法的线性分析
试验仪器：CB171半自动生化分析仪；
检测样品：高钾血清样品(7.5mmol/L)；
CB171半自动生化分析仪：温度为37℃，反应方法为终点法，测定波长为630nm，反应方向为正反应。
将高钠血清样品稀释成4个不同的浓度，依次为1.25mmol/L、2.5mmol/L、5.0mmol/L、7.5mmol/L，采用实施例1至实施例3的检测方法对上述样品的每个浓度进行2次检测，根据Excel中的公式计算R值，其中，实施例1检测方法的检测结果见表2。
表2线性试验结果
结果显示，根据检测结果计算出的R值为0.999，接近于1，实施例2、3检测方法的R值同样大于0.99，表明本发明所述方法在1.25-7.5mmol/L的范围内具有良好的线性度。
实施例7：本发明所述方法的符合度分析
试验仪器：CB171半自动生化分析仪和XD-683钾钠分析仪；
检测样品：空腹采集18名测试者的无溶血、无乳糜的血清；
CB171半自动生化分析仪：温度为37℃，反应方法为终点法，测定波长为630nm，反应方向为正反应。
采用实施例1至实施例3的检测方法分别对上述样品检测，相同样品用钾钠分析仪检测，其中，实施例1检测方法的检测结果以及钾钠分析仪检测结果见表3。
表3符合度分析结果(mmol/L)
结果显示，根据检测结果计算出的R值为0.993，实施例2、3检测方法的R值同样大于0.99，表明本发明所述方法检测结果与钾钠分析仪结果无明显差异，具有较高符合度。
实施例8：本发明所述方法的对比试验
试验仪器：CB171半自动生化分析仪；
检测样品：中生北控质控血清(钾离子靶值为4.12mmol/L，
为3.88-4.36mmol/L)；
将上述质控血清采用实施例1检测方法检测，重复10次；同时采用与实施例1相近的方法检测，区别在于不添加蛋白水解酶或不添加氢氧化钠，重复10次；检测结果见表4.
表4对比分析结果(mmol/L)
由表4结果可以看出，本发明所述方法的检测结果更加准确、精密度更高，而没有添加蛋白水解酶或不添加氢氧化钠的方法检测结果出现误差，且精密度也较差。
实施例9：本发明所述试剂盒
试剂1：1.5mmol/L的柠檬酸、100mmol/L的Tris、26mmol/L的磷酸氢二钠、酶活为4000U/L的蛋白水解酶，100mmol/L的四苯硼锂；
试剂2：2mmol/L的氢氧化钠、0.3％曲拉通X-100；
标准液：0.75g/L的叠氮钠、30g/L的牛血白蛋白、5mmol/L的氯化钾。
实施例10：本发明所述试剂盒
试剂1：1.3mmol/L的柠檬酸、80mmol/L的Tris、24mmol/L的磷酸氢二钠、酶活为3000U/L的蛋白水解酶，80mmol/L的四苯硼锂；
试剂2：1mmol/L的氢氧化钠、0.2％吐温20；
标准液：0.5g/L的叠氮钠、20g/L的牛血白蛋白、5mmol/L的氯化钾。
实施例11：本发明所述试剂盒
试剂1：1.7mmol/L的柠檬酸、120mmol/L的Tris-HCl、28mmol/L的磷酸氢二钠、酶活为5000U/L的蛋白水解酶，120mmol/L的四苯硼锂；
试剂2：3mmol/L的氢氧化钠、0.4％吐温40；
标准液：1g/L的叠氮钠、40g/L的牛血白蛋白、5mmol/L的氯化钾。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测钾离子的方法，其特征在于，蛋白水解酶与四苯硼锂组成混合液，在pH5.6-6.0的缓冲体系中，与待测样品反应后加入氢氧化钠以及体积分数为0.1-0.5%的曲拉通X-100、吐温20或吐温40混合，得到四苯硼钾悬浊液，然后在630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的钾离子浓度；
所述标准溶液由0.5-1g/L的叠氮钠、20-40g/L的牛血白蛋白和5mmol/L的氯化钾组成，所述缓冲体系由1.2-1.8mmol/L的柠檬酸、80-120mmol/L的Tris和24-28mmol/L的磷酸氢二钠组成。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述待测样品、混合液和氢氧化钠溶液的体积比为1:20:4。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述混合液中蛋白水解酶的酶活为3000-5000U/L。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述混合液中四苯硼锂的浓度为80-120mmol/L。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述氢氧化钠的浓度为1-3mmol/L。
6.一种检测钾离子的试剂盒，其特征在于，包括：
3000-5000U/L的蛋白水解酶、80-120mmol/L的四苯硼锂、1-3mmol/L的氢氧化钠、1.2-1.8mmol/L的柠檬酸、80-120mmol/L的Tris、24-28mmol/L的磷酸氢二钠、表面活性剂和标准溶液，所述标准溶液由0.5-1g/L的叠氮钠、20-40g/L的牛血白蛋白和5mmol/L的氯化钾组成，所述表面活性剂为体积分数为0.1-0.5%的曲拉通X-100、吐温20或吐温40。
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