CN102156126B

CN102156126B - 二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN102156126B
Application number: CN2011100722377A
Authority: CN
Inventors: 董理
Original assignee: Individual
Current assignee: Changchun Hui Li Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2011-03-24
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-03-24
Also published as: CN102156126A

Abstract

本发明公开了一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒，该检测方法包括：将二氧化碳结合力的待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括pH值为4.8～5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；检测所述反应液在540～550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。在检测过程中，所述待检测样品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氢根，从而使反应液的pH值升高，显色剂显色，然后通过检测所述反应液的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。与现有技术相比，本发明利用显色反应，无需使用还原型辅酶，检测的二氧化碳结合力具有很好的准确性。

Description

二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及检验测定技术领域，更具体地说，涉及一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒。

背景技术

二氧化碳结合力指血浆中碳酸氢根所含的二氧化碳的含量。血清或血浆中二氧化碳结合力含量测定是临床生化检验的常规项目，测定二氧化碳结合力可以了解人体内酸碱平衡的情况。呼吸性酸中毒，(肺气肿、肺纤维化)、呼吸肌麻痹、支气管扩张、气胸及呼吸道阻塞；代谢性碱中毒，例如呕吐、肾上腺皮质功能亢进、缺钾及服用碱性药物过多等都会引起酸碱中毒，从而使二氧化碳结合力增高；代谢性酸中毒，例如尿毒症、休克、糖尿酮症、严重腹泻及脱水；呼吸性碱中毒，例如呼吸中枢及呼吸加快等会引起二氧化碳结合力降低。因此，测定血清或血浆中的二氧化碳结合力含量，是输液疗法纠正失衡的重要指标，对治疗有重要意义。

目前，测定二氧化碳结合力的方法包括pH电极测定法、酸碱清空法和量压法等，量压法主要是采用瓦式呼吸机进行测定，即根据样品中的碳酸氢根与乳酸作用生成二氧化碳，在密闭的环境下，测定出二氧化碳的体积从而测算出碳酸氢根的含量，从而得到二氧化碳结合力。但是，上述方法测定操作误差较大，测定结果的准确度不高，很难作为医院常规检验项目开展。

随着各种半、全自动生化分析仪的普遍应用，近年来普遍采用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)偶联的速率法(简称PEPC法)测定二氧化碳结合力。其反应原理为：

碳酸氢根与磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸和磷酸；

草酰乙酸与还原型辅酶在苹果酸脱氢酶的作用下生成苹果酸和氧化型辅酶。

在PEPC法中，通过测定还原型辅酶的用量，测定碳酸氢根的含量，从而得到二氧化碳结合力。但是，空气中二氧化碳会与还原型辅酶发生反应，从而造成还原型辅酶下降；此外，待检测样品中内源性物质的增高，例如某些疾病会使血乳酸增高，从而使样品中乳酸脱氢酶含量增加，由于乳酸脱氢酶的作用，使还原型辅酶下降，影响检测二氧化碳结合力的准确性。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒，该检测方法能够准确检测二氧化碳结合力。

本发明提供了一种二氧化碳结合力的检测方法，包括：

步骤a)提供二氧化碳结合力的待检测样品；

步骤b)将所述待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括pH值为4.8～5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；

步骤c)检测步骤b)得到的反应液在540～550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。

优选的，所述待检测样品为血清或肝素抗凝血浆。

优选的，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～50mmol/L。

优选的，所述检测液中氯化钠的浓度为150～160mmol/L。

优选的，所述检测液中碳酸酐酶的浓度为3000～5000U/L。

优选的，所述检测液中显色剂的浓度为120～500mg/L。

优选的，所述检测液还包括聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠。

本发明还提供一种试剂盒，包括：

pH值为4.8～5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂。

9、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碳酸酐酶的浓度为3500～4500U/L。

优选的，还包括标准液，所述标准液为40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氢钠。

从上述的技术方案可以看出，本发明提供一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒，该检测方法包括：将二氧化碳结合力的待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括pH值为4.8～5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；检测所述反应液在540～550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。在检测过程中，所述待检测样品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氢根，从而使反应液的pH值升高，显色剂显色，然后通过检测所述反应液的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。与现有技术相比，本发明利用显色反应，无需使用还原型辅酶，检测的二氧化碳结合力具有很好的准确性。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种二氧化碳结合力的检测方法，包括：

步骤a)提供二氧化碳结合力的待检测样品；

本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为10～50mmol/L，更优选为20～30mmol/L，最优选为30mmol/L。所述检测液中氯化钠的浓度优选为150～160mmol/L，更优选为152～158mmol/L，更优选为154mmol/L。所述检测液中碳酸酐酶的浓度优选为3000～5000U/L，更优选为3800～4200U/L，最优选为3900～4100U/L。所述检测液中显色剂的浓度优选为120～500mg/L，更优选为150～300mg/L，最优选为180～250mg/L。本发明采用的显色剂优选为质量比为7∶3∶10的酚红、溴百里香酚蓝和氯化钠的混合物。所述检测液还包括稳定剂，所述稳定剂的浓度优选为10～14g/L，更优选为11～13g/L，最优选为11～12g/L。本发明所述稳定剂优选为质量比为1∶1∶10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠的混合物。本发明提供的检测方法采用的标准液优选为40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氢钠。

本发明提供的二氧化碳结合力的检测方法为碳酸酐酶比色法，通过待检测样品与试剂盒混合发生的反应，引起pH变化，显色剂显色，然后利用紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪，检测所述反应液在540～550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。本发明提供的二氧化碳结合力的检测方法测定速度快，并且，由于所述检测液呈弱酸性，不易吸收空气中的二氧化碳，抗干扰能力强。此外，即使所述试剂盒吸收了少量空气中的二氧化碳，本发明可以通过对检测液的空白测定，避免对测定结果的影响，保证了测定准确度；并且，本发明提供的检测方法无需反复定标，使用方便。

本发明提供的二氧化碳结合力的检测方法的检测原理为：本发明所述待检测样品优选为无溶血、无乳糜的血清或肝素抗凝血浆。由于所述待检测样品中的碱度主要是碳酸盐缓冲系统，其中以碳酸氢根为主，其次是碳酸和碳酸根，在pH为5左右的弱酸性介质中，碳酸和碳酸根转化为二氧化碳和水。利用本发明提供的二氧化碳结合力的检测方法检测待检测样品中的二氧化碳结合力时，待检测样品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氢根，生成的碳酸氢根使反应液的pH值升高，显色剂显色。原试剂盒在pH值5以下时为黄色，由于碳酸氢根含量越高显色就越深，当pH值升高时反应液由黄色变为紫红色。所述反应液的最佳吸收波长为540～550nm，优选为546nm。将最终反应液置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，在540～550nm波长下测定吸光度值大小。通过吸光度值与碳酸氢根含量的正比关系，测算得到二氧化碳结合力的含量。检测原理具体为：

碳酸+氢氧根→水+二氧化碳

二氧化碳和水在碳酸酐酶作用下生成氢离子和碳酸氢根

本发明还公开一种试剂盒，包括：

pH值为4.8～5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂。

本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为10～50mmol/L，更优选为20～30mmol/L，最优选为30mmol/L。所述氯化钠的浓度优选为150～160mmol/L，更优选为152～158mmol/L，更优选为154mmol/L。所述碳酸酐酶的浓度优选为3000～5000U/L，更优选为3800～4200U/L，最优选为3900～4100U/L。所述显色剂的浓度优选为120～500mg/L，更优选为150～300mg/L，最优选为180～250mg/L。本发明采用的显色剂优选为质量比为7∶3∶10的酚红、溴百里香酚蓝和氯化钠的混合物。所述检测液还包括稳定剂，所述稳定剂的浓度优选为10～14g/L，更优选为11～13g/L，最优选为11～12g/L。本发明所述稳定剂优选为质量比为1∶1∶10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠的混合物。按照本发明，还包括标准液，所述标准液为40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氢钠。

本发明提供的试剂盒可以为单一试剂，也可以为双试剂。例如，将Tris-HCl缓冲液、氯化钠溶液、碳酸酐酶和显色剂制成单一试剂；或者，将Tris-HCl缓冲液和氯化钠制成第一试剂，将碳酸酐酶、显色剂、稳定剂制成第二试剂，在利用该试剂盒检测二氧化碳结合力时，将第一试剂与第二试剂混合，从而检测待检测样品中的二氧化碳结合力。

本发明提供的试剂盒优选按照如下方法制备：按30mmol/L称取Tris加蒸馏水溶解，用1N的HCl调pH至4.8～5.2，加入氯化钠、碳酸酐酶及显色剂，混合。将得到的混合溶液分装入瓶。本发明可以通过对所述分装入瓶的混合溶液进行冷冻干燥，制成干粉试剂，所述干粉试剂在使用前需用蒸馏水复溶；可以直接制备得到液体试剂，便于直接使用。

为了进一步说明本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

试剂盒的配制：

按30mmol/L称取Tris加蒸馏水溶解，用1N的HCl调pH至4.8～5.2，分别加入氯化钠、碳酸酐酶和显色剂，得到混合溶液，将所述混合溶液分装入瓶，冷冻干燥，得到干粉试剂，所述混合溶液中包括以下成分：

将40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氢钠混合，得到标准液。

实施例2

将实施例1制备的试剂盒与蒸馏水混合，静置10分钟，得到检测试剂；

将血清、实施例1制备的标准液与上述制备的检测试剂分别置于全自动生化分析仪的样品盘和试剂盘中，仪器自动按设定参数8μl样品和240μl检测试剂取样，混合，反应，得到反应溶液，在37℃下，孵育时间为300秒，检测546nm波长下的吸光度值，根据计算公式C_样＝A_样/A_标×C_标(26mmol/L)，测算出二氧化碳结合力的浓度大小，其中：C_样为被测样本浓度；A_样为样本吸光度值；C_标为标准液浓度(已知)；A_标为标准液吸光度值。

实施例3

试剂盒的配制

制备第一试剂：

按30mmol/L称取Tris加蒸馏水溶解，用1N的HCl调pH至4.8～5.2，加入氯化钠，得到第一试剂。

制备第二试剂：

用4％的牛血白蛋白溶液溶解碳酸酐酶，用50％甲醇溶解显色剂，然后加入蒸馏水和稳定剂，得到第二试剂。

所述第一液体试剂与所示第二液体试剂中成分如下：

制备标准液：

将40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氢钠混合，得到标准液。

实施例4

将肝素抗凝血浆、实施例3制备的标准液、第一试剂、第二试剂分别置于全自动生化分析仪的样品盘和试剂盘中，仪器自动按设定参数8μl样品和200μl第一试剂、40μl第二试剂取样，混合，反应，得到反应溶液，在37℃下，孵育时间为300秒，检测546nm波长下的吸光度值，根据计算公式C_样＝A_样/A_标×C_标，从而测算出二氧化碳结合力的浓度大小，其中：C_样为被测样本浓度；A_样为样本吸光度值；C_标为标准液浓度；A_标为标准液吸光度值。如表1所示，为本发明检测二氧化碳结合力的测定参数。

表1碳酸酐酶比色法测定参数

比较例

采用PEPC法测定二氧化碳结合力，测定参数如表2所示。实施例4与实施例5的测定结果如表3、表4所示。

以日本和光公司生产的液体双试剂二氧化碳测定试剂盒为例，具体操作步骤为：

将肝素抗凝血浆、标准液与第一试剂、第二试剂分别置于全自动生化分析仪的样品盘和试剂盘中，仪器自动按设定参数5μl样品和240μl第一试剂、60μl第二试剂取样，混合，反应，得到反应溶液，在37℃下，延迟时间为90秒，测量时间为120秒，检测340nm波长下的吸光度变化值，根据计算公式C_样＝ΔA_样/分钟/ΔA_标/分钟×C_标，从而测算出二氧化碳结合力的浓度大小，其中：C_样为被测样本浓度；ΔA_样/分钟为样本每分钟吸光度变化值；C_标为标准液浓度；ΔA_标/分钟为标准液每分钟吸光度变化值。

表2PEPC法测定参数

表3对比试验结果

表4对比试验结果

从上述实验测定结果可以看出，本发明通过自动分析仪测定的检测结果具有很好的准确性。此外，本发明测定的线性范围为39mmol/L；试剂测试的不准确度的相对偏差不超过±15％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数CV≤5％；试剂的灵敏度可达0.400±0.0200ΔA/mmol/L。

本发明提供本发明提供一种二氧化碳结合力的检测方法和试剂盒，该检测方法包括：将二氧化碳结合力的待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括pH值为4.8～5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂；检测所述反应液在540～550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。在检测过程中，所述待检测样品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氢根，从而使反应液的pH值升高，显色剂显色，然后通过检测所述反应液的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。与现有技术相比，本发明利用显色反应，无需使用还原型辅酶，检测的二氧化碳结合力具有很好的准确性，同时精密度好，线性范围宽广，可以推广使用。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种二氧化碳结合力的检测方法，其特征在于，包括：

步骤a）提供二氧化碳结合力的待检测样品；

步骤b）将所述待检测样品与检测液混合，反应，得到反应液，所述检测液包括pH值为4.8~5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂，所述显色剂为质量比为7：3：10的酚红、溴百里香酚蓝和氯化钠的混合物；

步骤c）检测步骤b）得到的反应液在540~550nm波长下的吸光度值，计算得到二氧化碳结合力。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待检测样品为血清或肝素抗凝血浆。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10~50mmol/L。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测液中氯化钠的浓度为150~160mmol/L。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测液中碳酸酐酶的浓度为3000~5000U/L。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测液中显色剂的浓度为120~500mg/L。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测液还包括稳定剂，所述稳定剂为质量比为1：1：10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化钠的混合物。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括：

pH值为4.8~5.2的Tris-HCl缓冲液、氯化钠、碳酸酐酶和显色剂，所述显色剂为质量比为7：3：10的酚红、溴百里香酚蓝和氯化钠的混合物；

还包括标准液，所述标准液为40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氢钠。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述碳酸酐酶的浓度为3500~4500U/L。