CN101464289A

CN101464289A - 单胺氧化酶诊断试剂盒及单胺氧化酶活性浓度测定方法

Info

Publication number: CN101464289A
Application number: CNA2007101914698A
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2007-12-19
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2009-06-24

Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。

Description

单胺氧化酶诊断试剂盒及单胺氧化酶活性浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

现有技术中，测定单胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有：荧光法、免疫抑制法和化学分光光度法。荧光法是以β-苯乙胺作为底物来检测单胺氧化酶，其依据是：β-苯乙胺在10～100mg时反应速度最大，高于苄胺和5-羟色胺的反应速度。免疫学方法则利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，测定反应后形成的单胺氧化酶同工酶，目前应用较多的单克隆抗体有MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

相对而言，化学分光光度法应有更为普遍。可以用单胺氧化酶催化胺类释放出的过氧化氢(H₂O₂)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪(MCDP)等发色剂进行测定，也可以应用苄胺(Benzylamine)、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又称“3-对羟基苯乙胺”，3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)等作为反应底物来测定单胺氧化酶的活性。其中，应用苯甲胺类型底物测得的单胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺作底物测得的活性约为3-对羟基苯乙胺作底物的30％。目前，单胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲胺-β-偶氮萘酚作为底物。苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用下生成苄醛，然后在强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生成醛苯腙，这在生化仪上测定较困难；对苯甲胺-β-偶氮萘酚方法则需要用环乙烷提取，限制了该方法的实用性，且不能应用全自动生化仪分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定单胺氧化酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的单胺氧化酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行单胺氧化酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明单胺氧化酶活性浓度测定方法原理如下：

胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨离子+

过氧化氢

过氧化氢+二氧化碳+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶丙酮酸+

辅酶A+氧

丙酮酸+L-精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶

N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水

这种方法应用单胺氧化酶(Monoamine oxidase；EC 1.4.3.4；EC 1.4.3.6)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase；EC 1.2.3.6)、章鱼碱脱氢酶(octopine dehydrogenase；EC 1.5.1.11)酶促反应连续监测法。单胺氧化酶酶解胺类化合物反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算单胺氧化酶的活性浓度大小。

其中，二氧化碳可以用碳酸氢钠或其他碳酸氢盐取代。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明单胺氧化酶诊断试剂较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

丙酮酸氧化酶 10000U/L

章鱼碱脱氢酶 12000U/L

胺类化合物 9mmol/L

碳酸氢钠 12mmol/L

乙酰辅酶A 2mmol/L

精氨酸 2mmol/L

本发明的单胺氧化酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶。

还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

试剂2

缓冲液、稳定剂、章鱼碱脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶。

还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定单胺氧化酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

丙酮酸氧化酶 6000U/L

章鱼碱脱氢酶 10000U/L

胺类化合物 9mmol/L

碳酸氢钠 12mmol/L

乙酰辅酶A 2mmol/L

精氨酸 2mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值—4180。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。

实施例二

本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

胺类化合物 9mmol/L

碳酸氢钠 12mmol/L

乙酰辅酶A 2mmol/L

精氨酸 2mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

丙酮酸氧化酶 6000U/L

章鱼碱脱氢酶 10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值—2170。

实施例三

本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

胺类化合物 9mmol/L

碳酸氢钠 12mmol/L

乙酰辅酶A 2mmol/L

精氨酸 2mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

章鱼碱脱氢酶 10000U/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

丙酮酸氧化酶 6000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定单胺氧化酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值—2170。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0015；吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达250U/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤3％；试剂的灵敏度可达0.0003±0.00015ΔA/min/U/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。

Claims

1.一种利用酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：

胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨离子+

过氧化氢

过氧化氢+二氧化碳+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶丙酮酸+

辅酶A+氧

丙酮酸+L-精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶

N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出单胺氧化酶的活性浓度大小结果。

其中，二氧化碳可以用碳酸氢钠或其他碳酸氢盐取代。

2.一种单胺氧化酶诊断试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 20——500mmol/L

稳定剂 1——4000mmol/L

还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L

丙酮酸氧化酶 1000——80000U/L

章鱼碱脱氢酶 1000——80000U/L

胺类化合物 1——50mmol/L

碳酸氢钠 1——50mmol/L

乙酰辅酶A 1——50mmol/L

精氨酸 1——50mmol/L

本发明测定单胺氧化酶活性的诊断试剂盒的成分当中，所述“胺类化合物”优选以下物质之一：苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺或者这七种物质的衍生物，但选择范围不受这些列举所限制。

试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶组成。还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、章鱼碱脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶组成。还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、章鱼碱脱氢酶、胺类化合物、碳酸氢钠、乙酰辅酶A、精氨酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。