CN101464301A - 钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。

Description

钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等。当血钾高达7.5mmol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确定适当的治疗方案。血清钾超过10mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而死亡。高钾使心脏停跳于舒张期。

目前钾测定常用的方法有：同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度计法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。

火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na⁺和K⁺，是一种发射光谱分析法。测定方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大，一般不采用。现在主要使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、Na和Li的浓度，以标本与标准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、K浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可忽略不计。

化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K，一般采用普通冠醚阴离子染料进行比色定量。

离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行血清和尿等体液的K⁺、Na⁺的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡在待测标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为：①玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜的有pH电极、K⁺电极和Na⁺电极；②固相膜电极，由难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有Cl^-电极和F^-电极；③液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的Ca²⁺电极；④用缬氨霉素膜制成的K⁺电极。上述电极均有一定的寿命，因为电极使用一段时间就会自动老化，有效期长短不一。

原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、Na+，操作繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。

钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方法是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂贵。

酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干扰性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较好的分析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为常规分析项目。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定钾(离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的钾(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钾(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明钾(离子)浓度测定方法原理如下：

腺苷二磷酸+磷酸烯醇式  丙酮酸丙酮酸激酶/K ⁺   腺苷三磷酸+

                                                     丙酮酸

丙酮酸+辅酶A+氧  丙酮酸氧化酶  过氧化氢+二氧化碳+

                                        乙酰辅酶A

二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶  异柠檬酸脱氢酶  异柠檬酸

                                              +辅酶

这种方法应用需要钾离子激活的丙酮酸激酶(pyruvic kinase；EC 2.7.1.40)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase；EC 1.2.3.6)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase；EC 1.1.1.41；EC 1.1.1.42)酶促反应连续监测/速率比色法。在钾(离子)的激活下，丙酮酸激酶酶解磷酸烯醇式丙酮酸反应产生丙酮酸，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算钾(离子)的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钾(离子)诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                           100mmol/L

稳定剂                                    500mmol/L

还原型辅酶                               0.25mmol/L

丙酮酸激酶                                  6000U/L

丙酮酸氧化酶                                8000U/L

异柠檬酸脱氢酶                             10000U/L

腺苷二磷酸                                  3mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸                            3mmol/L

辅酶A                                       4mmol/L

酮戊二酸                                   10mmol/L

本发明的钾(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶。

还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶。

还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钾(离子)浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液                 100mmol/L

稳定剂                                        500mmol/L

还原型辅酶                                    0.25mmol/L

丙酮酸激酶                                       6000U/L

丙酮酸氧化酶                    8000U/L

异柠檬酸脱氢酶                 10000U/L

腺苷二磷酸                      3mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸                3mmol/L

辅酶A                           4mmol/L

酮戊二酸                       10mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。

实施例二

本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液                100mmol/L

稳定剂                                        50mmol/L

还原型辅酶                                  0.25mmol/L

腺苷二磷酸                                     3mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸                               3mmol/L

辅酶A                                   4mmol/L

酮戊二酸                               10mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液         100mmol/L

稳定剂                                 500mmol/L

丙酮酸激酶                               6000U/L

丙酮酸氧化酶                             8000U/L

异柠檬酸脱氢酶                          10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。

实施例三

本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液                   100mmol/L

稳定剂                                           50mmol/L

还原型辅酶                                     0.25mmol/L

腺苷二磷酸                                        3mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸                         3mmol/L

辅酶A                                    4mmol/L

酮戊二酸                                10mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液          100mmol/L

稳定剂                                 500mmol/L

丙酮酸氧化酶                             8000U/L

异柠檬酸脱氢酶                          10000U/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液         100mmol/L

稳定剂                                 500mmol/L

丙酮酸激酶                               6000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定钾(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.018；吸光度时间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达10mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤3％；试剂的灵敏度可达0.018±0.009ΔA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。

Claims (6)

1.一种利用酶比色法及酶联法技术的钾(离子)浓度测定方法，其方法原理如下：

腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶/K ⁺  腺苷三磷酸+

                                               丙酮酸

丙酮酸+辅酶A+氧 丙酮酸氧化酶 过氧化氢+二氧化碳+

                                      乙酰辅酶A

二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 异柠檬酸脱氢酶 异柠檬酸

                                              +辅酶

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出钾(离子)的浓度大小测定结果。

2.一种钾(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括：

缓冲液                 20——500mmol/L

稳定剂                 1——4000mmol/L

还原型辅酶             0.1——0.35mmol/L

丙酮酸激酶             1000——80000U/L

丙酮酸氧化酶           1000——80000U/L

异柠檬酸脱氢酶         1000——80000U/L

腺苷二磷酸             1——50mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸       1——50mmol/L

辅酶A                  1——50mmol/L

酮戊二酸               1——50mmol/L

试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成。还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶组成。还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。