CN101173930A

CN101173930A - 钠诊断/测定试剂盒及钠的浓度测定方法

Info

Publication number: CN101173930A
Application number: CNA200610097304XA
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2006-10-30
Filing date: 2006-10-30
Publication date: 2008-05-07

Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钠诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钠浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β－半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出钠的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。

Description

钠诊断/测定试剂盒及钠的浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种钠诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钠浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

血清中钠离子含量(简称“血钠”)在临床上有着非常重要的意义，医学上有三个决定水平，依次为：水平1——115mmol/l，水平2——135mmol/l，水平3——150mmol/l。当患者血钠浓度等于或低于水平1时，可出现神志不清、疲劳、恶心、头痛、呕吐和厌食等症状，表明机体内水的比例大于钠，应采用相应治疗措施；当血钠浓度低于水平2时，应查找低钠血症的原因，进一步测定血清渗透压、血钾并进行尿液分析，以确定诊断；当血钠浓度高于水平3时，应检查其它试验项目，寻找导致高钠血症的原因。

现有技术中测定钠离子含量的常用方法有：火焰光度计法、离子选择电极法、化学测定法、原子分光光度法、酶动力学法等。

火焰光度计法——1950年开始使用并一直沿用至今，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水中的Na⁺和K⁺，是一种发射光谱分析法，其结果准确可靠，广为临床采用。该方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大，一般不采用。现在主要使用内部标准法，即向标本及标准液中加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定，操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K⁺、Na⁺和Li⁺的浓度，以标本与标准液的Na⁺/Li⁺与K⁺/Li⁺比值，计算Na⁺、K⁺浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可以忽略不计。

离子选择电极法——简称ISE法，是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行血清和尿等体液中的K⁺、Na⁺的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其它方法的趋势。其测定原理是，用离子选择电极与参比电极组合起来，浸泡在待测标本溶液中进行检测。目前已有的电极种类有：①玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜，有PH电极、K⁺电极和Na⁺电极；②固相膜电极，由难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜，有Cl-电极和F-电极；③液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀作为感应膜，有Ca²⁺电极；④用缬氨霉素膜制成的K⁺电极。上述电极均有一定的使用寿命，因为电极使用一段时间后就会自动老化，有效期长短不一。目前离子选择电极法应用也较为普遍，但是电极成本昂贵。

此外，化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，作为离子载体进行测定。由于大环结构内有空穴，分子内部的氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而达到测出离子浓度的目的；原子分光光度法也可用于检测血清中K⁺、Na⁺，但操作繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。

酶法测定钠离子含量的方法，与火焰光度计法或离子选择电极法都有较好的一致性，这种方法抗干扰性强、稳定性好，但用生化分析仪不能同时测定钠离子和钾离子各自的含量，导致这种方法不能得到推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定钠浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的钠诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钠浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明钠浓度测定方法原理如下：

乳糖+水 β-半乳糖苷酶/Na ⁺ 葡萄糖+半乳糖

葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶葡萄糖-6-磷酸

+腺苷二磷酸

葡萄糖-6-磷酸+辅酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

葡糖酸内酯磷酸+还原型辅酶

这个方法应用需要钠离子激活的β-半乳糖苷酶(lactase；EC3.2.1.108)酶(偶)联己糖激酶(hexokinase；EC 2.7.1.1；EC 2.7.1.2)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase；EC 1.1.1.49)酶促反应速率比色法。β-半乳糖苷酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再通过(偶)联合己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算钠的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钠诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

辅酶 3mmol/L

乳糖 20mmol/L

腺苷三磷酸 6mmol/L

氯化镁 6mmol/L

β-半乳糖苷酶 10000U/L

己糖激酶 10000U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 10000U/L

本发明的钠诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳

糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁。

试剂2

缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸

脱氢酶。

辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸。

试剂2

缓冲液、乳糖、氯化镁。

试剂3

缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸

脱氢酶。

辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钠浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的钠诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

辅酶 3mmol/L

乳糖 20mmol/L

腺苷三磷酸 6mmol/L

氯化镁 6mmol/L

β-半乳糖苷酶 10000U/L

己糖激酶 10000U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钠样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钠的浓度大小。

实施例二

本实施例的钠诊断/测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

辅酶 3mmol/L

乳糖 10mmol/L

腺苷三磷酸 9mmol/L

氯化镁 3mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

β-半乳糖苷酶 16000U/L

己糖激酶 16000U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 16000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钠样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

实施例三

本实施例的钠诊断/测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

辅酶 3mmol/L

腺苷三磷酸 12mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

乳糖 30mmol/L

氯化镁 4mmol/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

β-半乳糖苷酶 20000U/L

己糖激酶 8000U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 8000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定钠浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钠样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

Claims

1.一种酶比色法及酶联法的钠的浓度测定方法，其方法原理如下：

乳糖+水 β-半乳糖苷酶/Na⁺ 葡萄糖+半乳糖

葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶葡萄糖-6-磷酸

+腺苷二磷酸

葡萄糖-6-磷酸+辅酶葡萄糖-6-磷酸脱氧酶

葡糖酸内酯磷酸+还原型辅酶

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出钠的浓度大小测定结果。

2.一种钠诊断/测定试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 20-500mmol/L

稳定剂 1-50mmol/L

辅酶 1-6mmol/L

乳糖 1-50mmol/L

腺苷三磷酸 1-12mmol/L

氯化镁 1-10mmol/L

β-半乳糖苷酶 1000-80000U/L

己糖激酶 1000-80000U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 1000-80000U/L

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述钠诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述钠诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成。辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述钠诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸组成；试剂2，由缓冲液、乳糖、氯化镁组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成。辅酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化镁、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述钠诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。