CN101464359A - 钠(离子)诊断/测定试剂盒及钠(离子)浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钠(离子)诊断/测定试剂盒,同时本发明还涉及测定钠(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分,属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括:缓冲液、还原型辅酶、乳糖、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶及稳定剂;通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列的酶促反应,再将反应物置于紫外/可见光分析仪下,检测主波长340nm处吸光度下降的速度,从而测算出钠(离子)的浓度大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种钠(离子)诊断/测定试剂盒,同时本发明还涉及测定钠(离子)浓度的方法,属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术
血清中钠离子含量(简称“血钠”)在临床上有着非常重要的意义,医学上有三个决定水平,依次为:水平1——115mmol/l,水平2——135mmol/l,水平3——150mmol/l。当患者血钠浓度等于或低于水平1时,可出现神志不清、疲劳、恶心、头痛、呕吐和厌食等症状,表明机体内水的比例大于钠,应采用相应治疗措施;当血钠浓度低于水平2时,应查找低钠血症的原因,进一步测定血清渗透压、血钾并进行尿液分析,以确定诊断;当血钠浓度高于水平3时,应检查其它试验项目,寻找导致高钠血症的原因。
现有技术中测定钠离子含量的常用方法有:火焰光度计法、离子选择电极法、化学测定法、原子分光光度法、酶动力学法等。
火焰光度计法——1950年开始使用并一直沿用至今,可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水中的Na+和K+,是一种发射光谱分析法,其结果准确可靠,广为临床采用。该方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大,一般不采用。现在主要使用内部标准法,即向标本及标准液中加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定,操作时,将含锂的溶液作为稀释液,同时测定K+、Na+和Li+的浓度,以标本与标准液的Na+/Li+与K+/Li+比值,计算Na+、K+浓度。由于血清稀释倍数大,血清蛋白质粘性的影响几乎可以忽略不计。
离子选择电极法——简称ISE法,是采用灵敏的特定专用电极,在专用仪器上进行血清和尿等体液中的K+、Na+的测定,因标本用量少,快速准确,几乎有取代其它方法的趋势。其测定原理是,用离子选择电极与参比电极组合起来,浸泡在待测标本溶液中进行检测。目前已有的电极种类有:①玻璃膜电极,感应材料为玻璃薄膜,有PH电极、K+电极和Na+电极;②固相膜电极,由难溶性金属物质加压成型,以固体膜或单日膜作为感应膜,有Cl-电极和F-电极;③液态膜电极,将环氧树脂或内装聚氯乙稀作为感应膜,有Ca2+电极;④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的使用寿命,因为电极使用一段时间后就会自动老化,有效期长短不一。目前离子选择电极法应用也较为普遍,但是电极成本昂贵。
此外,化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚,作为离子载体进行测定。由于大环结构内有空穴,分子内部的氧原子有未共用电子对可与金属离子结合,根据空穴大小,可选择性结合不同直径的金属离子,从而达到测出离子浓度的目的;原子分光光度法也可用于检测血清中K+、Na+,但操作繁杂,误差较大,不及火焰光度法简便。
酶法测定钠离子含量的方法,与火焰光度计法或离子选择电极法都有较好的一致性,这种方法抗干扰性强、稳定性好,但用生化分析仪不能同时测定钠离子和钾离子各自的含量,导致这种方法不能得到推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术,监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化,得以测定钠(离子)浓度的方法,同时,本发明还将给出用以实现该方法的钠(离子)诊断/测定试剂盒,采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钠(离子)浓度测定,而且测定速度快、准确度高,因而可以得到切实的推广应用。
本发明钠(离子)浓度测定方法原理如下:
乳糖+水 β-半乳糖苷酶/Na + 葡萄糖+半乳糖
葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸内酯+过氧化氢
过氧化氢+还原型辅酶 NADH过氧化物酶 辅酶+2水
这种方法应用需要钠离子激活的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase;EC3.2.1.23)具有乳糖酶(lactase;EC 3.2.1.108)的特性,酶(偶)联葡萄糖氧化酶(glucose oxidase;EC 1.1.3.4)、NADH过氧化物酶(NADH peroxidase;EC1.11.1.1;EC 1.11.1.2)酶促反应连续监测/速率比色法。在钠离子的激活下,β-半乳糖苷酶酶解乳糖反应产生葡萄糖,再通过(偶)联合葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶的作用,最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰),从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度,通过测量340nm处吸光度下降的速度,可以测算钠(离子)的浓度大小。
实验表明,从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑,无论是单剂、双剂还是三剂,如下成分关系的本发明钠(离子)诊断/测定试剂盒较为理想:
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
β-半乳糖苷酶 6000U/L
葡萄糖氧化酶 8000U/L
NADH过氧化物酶 10000U/L
乳糖 20mmol/L
本发明的钠(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂,包括:
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶、乳糖。
试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂:
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖。
试剂2
缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶。
还原型辅酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶、乳糖在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂:
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖。
试剂2
缓冲液、稳定剂、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶。
还原型辅酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶、乳糖在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂,本发明测定钠(离子)浓度的方法,其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为单试剂,包括:
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
β-半乳糖苷酶 6000U/L
葡萄糖氧化酶 8000U/L
NADH过氧化物酶 10000U/L
乳糖 20mmol/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,进行冷冻干燥,制成干粉试剂;使用前,加入纯净水,复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定:温度37℃,反应时间10分钟,起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测钠(离子)样品与试剂的体积比例为1/25,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大约2分钟左右,检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的速度,从而测算出钠(离子)的浓度大小。
实施例二
本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为双试剂,包括:
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
乳糖 20mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
β-半乳糖苷酶 6000U/L
葡萄糖氧化酶 8000U/L
NADH过氧化物酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体双试剂,可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定:温度37℃,反应时间10分钟,起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测钠(离子)样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大约2分钟左右,检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的速度,从而测算出钠(离子)的浓度大小。
实施例三
本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为三试剂,包括:
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
乳糖 20mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
葡萄糖氧化酶 8000U/L
NADH过氧化物酶 10000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
β-半乳糖苷酶 6000U/L
试剂全部溶解配好后,分装入瓶,制成液体三试剂,可以直接使用。
测定钠(离子)浓度时,在全自动生化分析仪上设定:温度37℃,反应时间10分钟,起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm,测试副波长405nm,被测钠(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反应方向为负反应(下降反应),延迟时间大约2分钟左右,检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后,使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的速度,从而测算出钠(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证,采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的,鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同,不另一一例举。
总之,实验证明:采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.022;吸光度时间反应曲线应呈下降曲线直至终点;试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达50—200mmol/L;试剂测试的不准确度,其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2%;试剂的灵敏度可达0.00016±0.00008ΔA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好,线形范围宽广,足以便于推广应用。
Claims (6)
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的钠(离子)浓度测定方法,其方法原理如下:
乳糖+水 β-半乳糖苷酶/Na + 葡萄糖+半乳糖
葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸内酯+过氧化氢
过氧化氢+还原型辅酶 NADH过氧化物酶 辅酶+2水
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下,检测主波长340nm吸光度下降的速度,测算出钠(离子)的浓度大小测定结果。
2.一种钠(离子)诊断/测定试剂盒,主要成分包括:
缓冲液 20——500mmol/L
稳定剂 1——4000mmol/L
还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L
β-半乳糖苷酶 1000——80000U/L
葡萄糖氧化酶 1000——80000U/L
NADH过氧化物酶 1000——80000U/L
乳糖 1——50mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围;在此范围内效果较好,在此范围外,试剂仍会反应作用。
其特征在于:试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂,直接使用。
3.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒,其特征在于:
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶、乳糖组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒,其特征在于:
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶、乳糖组成双剂试剂;试剂1,由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖组成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶组成。还原型辅酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶、乳糖在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒,其特征在于:
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶、乳糖组成多剂试剂;试剂1,由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖组成;试剂2,由缓冲液、稳定剂、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶组成;试剂3,由缓冲液、稳定剂、β-半乳糖苷酶组成。还原型辅酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、NADH过氧化物酶、乳糖在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒,其特征在于:还包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为:硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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