CN104152535A - 体外酶法钾测定试剂、其制备方法及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开体外酶法钾测定试剂，包括分装的体积相同的第一试剂和第二试剂，所述第一试剂内物质浓度如下：pH为7.3温度为25℃的MOPS缓冲液200mmol/L、白蛋白1.00g/L、三磷酸苷5.62mmol/L、EGTA0.982mmol/L、α-酮戊二酸32.7mmol/L、尿素38.3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/L和NaN₃0.50g/L，第二试剂内物质浓度如下：NaHCO₃30.9mmol/L、NADH0.845mmol/L、MgSO₄16mmol/L和NaN₃0.30g/L，所述第一试剂和第二试剂中的溶剂均为纯水。本发明体外酶法钾测定试剂可长期稳定保存，测定准确性高、成本低、解决Shigeki方法不能应用的问题。

Description

体外酶法钾测定试剂、其制备方法及其使用方法

技术领域

本发明涉及钾测定试剂，特别是涉及体外酶法钾测定试剂。

本发明还涉及上述体外酶法钾测定试剂的制备方法以及该体外酶法钾测定试剂的使用方法。

背景技术

人体血清中钾的含量测定是临床体外诊断测定项目之一，也是临床常规急诊诊断中不可缺少的项目。血清钾高于参考值上限，多见于肾上腺皮质功能减退，特别危重患者，血清钾上升至8mmol/L,患者可能发生心室纤颤；血清钾低于参考值下限，多见于肾小管疾病，出现严重腹泻、呕吐，肾上腺皮质功能亢进等症状。

目前医院测定血清钾多使用离子选择电极(ISE)。其电极是对钾专一性强的缬霉素膜，是比较理想的测定血清或尿中钾离子浓度方法。缬霉素膜专一性强，但使用寿命短，一般三个月左右就要更换一次。

酶法测定钾的优点是利用分光光度计原理，在全自动生化分析仪上进行测定，全自动生化仪是医院测定其它众多项目必备仪器，利用生化仪测定钾，医院不需要再购置和维护离子选择电极设备。上生化仪测定，操作方便，节省开支。酶法测定结果与离子电极法等效。同样是医院测定钾的理想方法之一。

酶法测定钾的方法是上世纪80年代末由Berry.MN等人提出的，他是利用K⁺是丙酮酸激酶的激活剂原理，建立起酶法测定血清钾的基本方法，随后德国B.M公司正式推出酶法测定钾的试剂盒，并在全世界市场上销售，受到医院的欢迎。但Berry的原理中，K⁺离子是丙酮酸激酶的激活剂，Na⁺离子也是该酶的激活剂，而且血清中Na⁺离子浓度是K⁺离子的12倍。为了保证测定K⁺离子专一性，必须去除血清中的Na⁺离子，去除Na⁺离子依靠加入一种对Na⁺专一的人工合成离子穴(Cryptand)。此离子穴价格昂贵，造成钾试剂成本奇高。这是Berry方法的不利方面。

1987年日本人Shigeki Kimura等人提出另一个测定钾的酶法原理，它利用K⁺是尿素氨基水解酶(Urea amidolyase简称UAL.EC3.5.1.45)水解尿素的激活剂原理，建立测定K⁺的方法。

起反应如下：

UAL水解Urea时需加入ATP、HCO₃ ^-作为底物，在Mg⁺⁺和K⁺离子激活下，生成NH₄ ⁺和OH⁺,生成的NH₄ ^-,加入a-酮戊二酸和NADH，在GLDH的作用下生成glutamate和NAD⁺,在340nm波长下，激活剂K⁺的多少与NADH下降成正比，建立起测定K⁺基本方法。

Shigeki等人的具体测定试剂分为试剂1和试剂2：各试剂内成分及浓度如下：

试剂1：

BSA(白蛋白)………………..3g/L

a-酮戊二酸…..14.4mmol/L

NADH……………………………………..0.53mm0l/L

Urea……………………………………..4.47mmol/L

NaHCO₃…………………………………….51.4mmol/L

EGTA……………………………………….0.5mmol/L

Magnesium acetate……………………..7.2mmol/L

UAL………………………………………..330.4U/L

GIDH……………………………………….43.2Ku/L

Imidazole buffer……..200mmol/L pH7.0 37℃

试剂2

BSA(白蛋白)………………………………3g/L

ATP…………………………………………9.72mmol/L

Urea……………………………………….4.47mmol/L

NaHCO₃…………………………………….51.4mmol/L

EDTA……………………………………….0.5mmol/L

Magnuesium acetate(醋酸镁)………….7.2mmol/L

Imidazole buffer….200mmol/L pH7.0 37℃

其中，NADH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一种转递质子(更准确来说是氢离子)的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。EGTA为乙二醇二乙醚二胺四乙酸，即GEDTA，EGTA是最为被广泛使用的钙离子选择性的螯合剂，用于在镁存在下，测定钙。它与钙离子形成的复合物比与镁离子形成的复合物要稳定100,000倍,被用来制备钙缓冲液和控制钙离子的浓度。容量分析及光度分析中测量微量金属的络合剂、掩蔽剂。也可滴定钡、锶、铜、镁和锌。Magnesiumacetate是乙酸镁，无色单斜晶体，易潮解。溶于水，水溶液通常为中性或弱酸性。在空气中易潮解，加热脱水。用作试剂、医药、催化剂等。UAL是尿素氨基水解酶，别名Urea-amidohydrolase。GIDH是glutamatedehydrogenase，即谷氨酸脱氢酶，催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氨的反应。且谷氨酸脱氢酶是唯一既能利用NAD+又能利用NADH+作为还原当量的酶。是一种不需氧的脱氢酶。Imidazole buffer为咪唑缓冲液，分子式C3H4N2，分子量68,08g/mol，微溶于苯、石油醚，溶于乙醚、丙酮、氯仿、吡啶，易溶于水、乙醇。缓冲范围:6.2---7.8。可用于含有His蛋白质亲和层析中做洗脱液(树脂上的二价阳离子Ni²⁺可与咪唑基团结合。BSA是牛血清白蛋白，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。ATP是三磷酸腺苷的缩写，其结构式是：A—P～P～P，它是一种含有高能磷酸键的有机化合物，它的大量化学能就储存在高能磷酸键中。

用Shigeki方法，基本原理与Berry相同，它的优点不受Na⁺干扰，不需要用昂贵的Na⁺离子穴(crgptand),试剂成本低，简单易行。但主要的缺点是试剂1和试剂2随存放时间延长，其测定值迅速下降。

试剂1和试剂2本身不稳定，使得Shigeki方法仅仅只能是在试验室进行试验使用，而不能成为在医院等医疗机构中真正使用产品。实际表明，至今市场上和医疗机构没有用Shigeki方法的试剂，主要也是以上原因。

发明内容

本发明是为了解决现有技术中的不足而完成的，本发明的目的是提供第一试剂和第二试剂单独可以长期稳定保存，两者混合后测定时，酶活力保持不变，而且测定钾含量准确性高、成本低、解决了以前Shigeki方法的不能应用的问题的体外酶法钾测定试剂。

本发明的体外酶法钾测定试剂，包括分开包装体积相同的第一试剂和第二试剂，所述第一试剂内的物质及各物质浓度如下所示：pH为7.3温度为25℃的MOPS缓冲液200mmol/L、白蛋白1.00g/L、三磷酸苷5.62mmol/L、EGTA 0.982mmol/L、α-酮戊二酸32.7mmol/L、尿素38.3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/L和NaN₃0.50g/L，第二试剂内的物质及各物质浓度如下：NaHCO₃30.9mmol/L、NADH0.845mmol/L、MgSO₄16mmol/L、NaN₃0.30g/L，所述第一试剂和第二试剂中的溶剂均为纯水。

本发明的体外酶法钾测定试剂，由于其包括分开包装的体积相同的第一试剂和第二试剂，所述第一试剂由pH为7.3温度为25℃的MOPS缓冲液200mmol、白蛋白1.00g、三磷酸苷5.62mmol、EGTA 0.982mmol、α-酮戊二酸32.7mmol、尿素38.3mmol、尿素氨基水解酶230u、谷氨酸水解酶4320u、NaN₃0.50g与纯水配置成1L溶液制成，第二试剂由NaHCO₃30.9mmol、NADH0.845mmol、MgSO₄16mmol、NaN₃(叠氨钠)0.30g和纯水配置成1L溶液制成。这样，分开包装的体积相同的第一试剂和第二试剂在单独的生产和运输以及存储的过程中彼此不受对方影响。第一试剂中不包括NaHCO₃，NaHCO₃引起MOPS缓冲液逐渐偏碱，改变UAL酶最适pH。NaHCO₃不与第一试剂中的缓冲液混合，因此第一试剂可以长期稳定保存，而第二试剂中的NaHCO₃用水溶解，将水溶的NaHCO₃作为第二试剂与NADH放在一起，NaHCO₃在水溶解中，立刻使得水溶液偏碱性，在碱性情况下，NaHCO₃不再释放CO₂，NaHCO₃浓度得以维持。第二试剂的偏碱性的水溶液又使得NADH稳定，因此试剂第二试剂也可以长期稳定保存。第一试剂中缓冲液pH7.3，不含NaHCO₃，UAL酶在其中也得以稳定。因此，当试剂不使用时，UAL酶活保持稳定，NAHCO₃又不会减少。试剂得以长期稳定。当使用第一试剂与第二试剂混合，第二试剂中，NaHCO₃为水溶液，弱碱水溶液不会对第一试剂中缓冲液pH7.3有任何冲击，混合后的试剂仍保持pH7.3,测定时，酶活力保持不变。此时可以进行体外酶法钾测定，准确率高，成本低，操作方便，准确率高，第一试剂与第二试剂均可长期稳定保存，利于体外酶法钾测定试剂的生产、运输和保存，使得医院、诊所等医疗机构使用该试剂进行钾测定成为现实中能够很容易实现的状态。

本发明还包括制备上述体外酶法钾测定试剂的制备方法，能够制备出第一试剂和第二试剂单独可以长期稳定保存，两者混合后进行测定时，酶活力保持不变，而且测定钾含量准确性高、成本低、解决了以前Shigeki方法的不能应用的问题的体外酶法钾测定试剂。

本发明的体外酶法钾测定试剂的制备方法，包括以下步骤：

A.制备第一试剂：在温度为25℃的条件下将pH为7.3的MOPS缓冲液200mmol、白蛋白1.00g、三磷酸苷5.62mmol、EGTA0.982mmol、α-酮戊二酸32.7mmol、尿素38.3mmol、尿素氨基水解酶230u、谷氨酸水解酶4320u、NaN₃0.50g依次加入纯水中配置成1L溶液，搅拌25-35分钟后按照160ml一份分开封闭包装；

B.制备第二试剂：将NaHCO₃30.9mmol、NADH0.845mmol、MgSO₄16mmol、NaN₃(叠氨钠)0.30g和纯水配置成1L溶液，搅拌25-35分钟后按照160ml一份分开封闭包装；

C.组合包装，将一份包装后的第一试剂与一份包装后的第二试剂封装在测定试剂盒内。

通过上述步骤，可以制备出第一试剂和第二试剂单独可以长期稳定保存，两者混合后测定时，酶活力保持不变，而且测定钾含量准确性高、成本低、解决了以前Shigeki方法的不能应用的问题的体外酶法钾测定试剂。

本发明还提供了上述体外酶法钾测定试剂的使用方法，能够准确测定钾含量。

本发明的体外酶法钾测定试剂的使用方法，为每160μl第一试剂与160μl第二试剂混合后与血清样本进行测定。

使用本发明的体外酶法钾测定试剂的使用方法，可以有效并精确地测定钾含量。

具体实施方式

下面对本发明的体外酶法钾测定试剂、制备方法及其使用方法作进一步详细说明。

本发明的体外酶法钾测定试剂，包括分开包装的体积相同的第一试剂和第二试剂，所述第一试剂由pH为7.3温度为25℃的MOPS缓冲液200mmol、白蛋白1.00g、三磷酸苷5.62mmol、EGTA0.982mmol、α-酮戊二酸32.7mmol、尿素38.3mmol、尿素氨基水解酶230u、谷氨酸水解酶4320u、NaN₃0.50g与纯水配置成1L溶液制成，配制后的第一试剂中各物质浓度分别为：pH为7.3温度为25℃的MOPS缓冲液200mmol/L、白蛋白1.00g/L、三磷酸苷5.62mmol/L、EGTA0.982mmol/L、α-酮戊二酸32.7mmol/L、尿素38.3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/L和NaN₃0.50g/L，第二试剂由NaHCO₃30.9mmol、NADH0.845mmol、MgSO₄16mmol、叠氨钠0.30g和纯水配制成1L溶液制成，配制后的第二试剂中各物质的浓度分别为：NaHCO₃30.9mmol/L、NADH0.845mmol/L、MgSO₄16mmol/L和叠氨钠0.30g/L。这样，分开包装的第一试剂和第二试剂在单独的生产和运输以及存储的过程中彼此不受对方影响。第一试剂中不包括NaHCO₃，NaHCO₃不与第一试剂中的缓冲液混合，因此第一试剂可以长期稳定保存，而第二试剂中的NaHCO₃用水溶解，将水溶的NaHCO₃作为第二试剂与NADH放在一起，NaHCO₃在水溶解中，立刻使得水溶液偏碱性，在碱性情况下，NaHCO₃不再释放CO₂，NaHCO₃浓度得以维持。第二试剂的偏碱性的水溶液又使得NADH稳定，因此第二试剂可以长期稳定保存。第一试剂缓冲液pH7.3，不含NaHCO₃，UAL酶在其中也得以稳定。因此，当试剂不使用时，UAL酶活保持稳定，NAHCO₃又不会减少。试剂得以长期稳定。当使用第一试剂与第二试剂混合，第二试剂中，NaHCO₃为水溶液，弱碱水溶液不会对第一试剂中缓冲液pH7.3有任何冲击，混合后的试剂仍保持pH7.3,测定时，酶活力保持不变。此时可以进行体外酶法钾测定，准确率高，成本低，操作方便，准确率高，第一试剂与第二试剂均可长期稳定保存，利于体外酶法钾测定试剂的生产、运输和保存，使得医院、诊所等医疗机构使用该试剂进行钾测定成为现实中能够很容易实现的状态。本发明是在解析Shigeki不稳定原因而产生的。通过申请人大量实验，最终确定Shigeki试剂不稳定原因是加入的NaHCO₃引起的。NaHCO₃是UAL酶反应的主要底物之一，缺少它，反应不会发生。NaHCO₃不能省去。NAHCO₃在任何酸性、中性、弱碱性缓冲液中，均不稳定，随时间的延长，NaCO₃不断的释放出CO₂，使缓冲液逐渐趋向碱性，UAL酶最适合pH7.0，缓冲液逐渐变碱，UAL酶反应速度逐渐下降，造成测定结果偏低。

另外，本发明的第一试剂和试第二试剂的成分和各成分的含量如下：

第一试剂

Mops缓冲液…………………200mmol/L pH7.3(25℃)

白蛋白…………………………1.00g/L

ATP……………………………5.62mmol/L

EGTA……………………………………0.982mmol/L

UAL…………………………………….230u/L

GIDH…………………………………….4320u/L

α-酮戊二酸…………………………..32.7mmol/L

Urea…………………………………..38.3mmol/L

NaN₃(防腐剂)…………………..0.50g/L

第二试剂

1000ul纯水

NaHCO₃…………………….30.9mmol/L

NADH……………………….0.845mmol/L

MgSO₄……………………..16mmol/L

NaN₃……………………….0.30g/L

其中，MOPS缓冲液化学名：3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid，中文名：3-(N-吗啉基)丙磺酸，分子式：C₇H₁₅NO₄S，pH范围6.5-7.9，pKa(25℃)为7.2，其是市场上可以买到的。NADH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一种转递质子(更准确来说是氢离子)的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。，即GEDTA，EGTA是最为被广泛使用的钙离子选择性的螯合剂，用于在镁存在下，测定钙。它与钙离子形成的复合物比与镁离子形成的复合物要稳定100,000倍,被用来制备钙缓冲液和控制钙离子的浓度。容量分析及光度分析中测量微量金属的络合剂、掩蔽剂。也可滴定钡、锶、铜、镁和锌。UAL是尿素氨基水解酶，别名Urea-amidohydrolase。GIDH是glutamate dehydrogenase，即谷氨酸脱氢酶，催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氨的反应。且谷氨酸脱氢酶是唯一既能利用NAD+又能利用NADH+作为还原当量的酶，是一种不需氧的脱氢酶。白蛋白可以是牛血清白蛋白液可以是人血清白蛋白，一般使用的是牛血清白蛋白，因为牛血清白蛋白的价格比较低，而使用人血清白蛋白的优点是没有排异性，但是价格比较贵。牛血清白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。ATP是三磷酸腺苷的缩写，其结构式是：A—P～P～P，它是一种含有高能磷酸键的有机化合物，它的大量化学能就储存在高能磷酸键中。EGTA为乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，也为乙二醇二乙醚二胺四乙酸，分子式为C14H24N2O10，分子量：380.35。α-酮戊二酸(英语：α-Ketoglutaric acid)是戊二酸的两种带酮基的衍生物中的一种，白色细结晶性粉末。熔点113.5℃。易溶于水、醇、极难溶于醚，久贮变淡灰黄色，易潮解。Urea为尿素。NaN₃为叠氮化钠，也为叠氨钠，白色六方晶系结晶。对热不稳定，水溶液遇酸放出有毒的HN₃(氢叠氮酸)，空气中加热300℃释放大量氮气。水中溶解度：10℃时为40.16％，17℃时为41.7％。本发明中使用的原料均是可以在市场上买到的化学物质。

在所述第二试剂中NaHCO₃使用纯水溶解。NaHCO₃用纯水溶解，将水溶的NaHCO₃作为第二试剂与NADH放在一起，NaHCO₃在水溶解中，立刻使水溶液偏碱性，在碱性状况下，NaHCO₃不再释放CO₂，NaHCO₃浓度得以维持。偏碱性的水溶液又使得NADH稳定。

本发明的体外酶法钾测定试剂的制备方法，包括以下步骤：

A.制备第一试剂：在温度为25℃的条件下将pPH为7.3的MOPS缓冲液200mmol(41.85g)、白蛋白1.00g、三磷酸苷5.62mmol(3401mg)、EGTA0.982mmol(458.9mg)、α-酮戊二酸32.7mmol(7393mg)、尿素38.3mmol(2300mg)、尿素氨基水解酶230u、谷氨酸水解酶4320u、NaN₃0.50g依次加入纯水中配置成1L溶液，配制后的试剂一中各物质浓度如下：pH为7.3温度为25℃的MOPS缓冲液200mmol/L、白蛋白1.00g/L、三磷酸苷5.62mmol/L、EGTA 0.982mmol/L、α-酮戊二酸32.7mmol/L、尿素38.3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/L和NaN₃0.50g/L，搅拌25-35分钟后按照160μl一份分开封闭包装；

B.制备第二试剂：将NaHCO₃30.9mmol(2596mg)、NADH0.845mmol(599mg)、MgSO₄16.2mmol(3943mg)、NaN₃(叠氨钠)0.30g和纯水配制成1L溶液，配制后试剂二的各物质的浓度分别为：NaHCO₃30.9mmol/L、NADH0.845mmol/L、MgSO₄16mmol/L和叠氨钠0.30g/L，搅拌25-35分钟后按照160ml一份分开封闭包装；

C.组合包装，将一份包装后的第一试剂与一份包装后的第二试剂封装在测定试剂盒内。

通过上述步骤，可以制备出第一试剂和第二试剂单独可以长期稳定保存，两者混合后测定时，酶活力保持不变，而且测定钾含量准确性高、成本低、解决了以前Shigeki方法的不能应用的问题的体外酶法钾测定试剂。

本发明还提供了上述体外酶法钾测定试剂的使用方法，能够准确测定钾含量。

本发明的体外酶法钾测定试剂的使用方法，为每160μl第一试剂与160μl第二试剂混合后对血清样本进行测定。即160μl第一试剂与160μl第二试剂混合后，加入16μl的提取出来的血清样本进行钾测定。

使用本发明的体外酶法钾测定试剂的使用方法，可以有效并精确地测定钾含量。

在进行体外酶法钾测定的过程中，应用过程总测定参数为上机参数(Vital生化仪或其它全自动生化仪)

模式：二点法

波长……………………………..340nm

标准……………………………..双标准

样品量…………………………..16μl

第一试剂…………………………….160μl

第二试剂……………………………160μl

测定时间…………………………211秒-317秒

测定结果如下：

1)试剂稳定

质控品:由英国RANDOX公司提供,批号414UE。将质控品做成样品，取16μl，加入第一试剂160μl，第二试剂160μl，按上面提供的上机参数，每隔二月测定一次。

试验结果：(测试第一试剂和第二试剂混合后的稳定性)

时间(月)	0	2	4	8
					靶值	4.03	4.03	4.03	4.03
测值	3.78	3.82	3.79	3.90
					相对偏差％	-6.2％	-5.2％	-6.0％	-3.2％

由上述试验数据可以得知本发明的第一试剂和第二试剂的稳定性很好。

液体保存8个月，冻干粉形式可保存18个月。第一试剂和第二试剂均可以以液体形式存在或者制备成干粉状保存。

2)准确度验证：

美国国家临床实验室委员会(NCCLS)批准文件EP9-A2方法验证

对比试剂：离子选择电极法及配套试剂

实验试剂：本发明申请中的体外酶法钾测定试剂、仪器Olympus AU480样品：每天测定8份人血清标本，按1至8的序号进行测定，再按8至1的序号重复测定，共测定5天。

试验结果：

1.线性回归、预期偏倚及其可信区间的计算

1.1线性回归计算

线性回归方程：Y＝0.9553X+0.1727

斜率＝0.9553

截距＝0.1727

相关系数r＝0.9928

2.预期偏倚及其可信区间的计算，见表2

表2预期偏倚及其可信区间

3.结论

实验方法引入的误差在CLIA'88允许误差范围内，二种方法对病人样本测定结果基本相符，以本发明的体外酶法钾测定试剂的使用方法替代比对方法不会对临床引入明显偏倚。

上述仅对本发明中的几种具体实施例加以说明，但并不能作为本发明的保护范围，凡是依据本发明中的设计精神所作出的等效变化或修饰，均应认为落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.体外酶法钾测定试剂，其特征在于：包括分开包装的体积相同的第一试剂和第二试剂，所述第一试剂内的物质及各物质浓度如下所示：pH为7.3温度为25℃的MOPS缓冲液200mmol/L、白蛋白1.00g/L、三磷酸苷5.62mmol/L、EGTA 0.982mmol/L、α-酮戊二酸32.7mmol/L、尿素38.3mmol/L、尿素氨基水解酶230u/L、谷氨酸水解酶4320u/L和NaN₃0.50g/L，第二试剂内的物质及各物质浓度如下所示：NaHCO₃30.9mmol/L、NADH0.845mmol/L、MgSO₄16mmol/L和叠氨钠0.30g/L，所述第一试剂和第二试剂中的溶剂均为纯水。

2.权利要求1所述的体外酶法钾测定试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

A.制备第一试剂：在温度为25℃的条件下将PH为7.3的MOPS缓冲液200mmol、白蛋白1.00g、三磷酸苷5.62mmol、EGTA0.982mmol、α-酮戊二酸32.7mmol、尿素38.3mmol、尿素氨基水解酶230u、谷氨酸水解酶4320u、NaN₃0.50g依次加入纯水中配置成1L溶液，搅拌25-35分钟后按照160ml一份分开封闭包装；

B.制备第二试剂：将NaHCO₃30.9mmol、NADH 0.845mmol、MgSO₄16mmol、叠氨钠0.30g和纯水配置成1L溶液，搅拌25-35分钟后按照160ml一份分开封闭包装；

C.组合包装，将一份包装后的第一试剂与一份包装后的第二试剂封装在测定试剂盒内。

3.权利要求1或2所述的体外酶法钾测定试剂的使用方法，其特征在于：每160μl第一试剂与160μl第二试剂混合后对血清样本进行测定。