CN101339190A

CN101339190A - 人体重要寄生虫抗原芯片及其制备方法

Info

Publication number: CN101339190A
Application number: CNA2008100623420A
Authority: CN
Inventors: 干小仙; 王越; 施晓华
Original assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2008-05-19
Filing date: 2008-05-19
Publication date: 2009-01-07

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是用于检测血清中人体重要寄生虫抗体的抗原芯片及其制备方法。本发明将对人体危害严重的血吸虫、肺吸虫、华支睾吸虫、囊虫、曼氏裂头蚴、旋毛虫、广州管圆线虫、弓形虫等寄生虫的抗原阵列点样于固相膜性载体上，采用特制的垂直流芯片检测装置，应用颜色鲜艳的胶体金二抗结合物或胶体金蛋白A结合物为检测标记物，检测病人血清中人体重要寄生虫特异性γ免疫球蛋白(IgG)。血清中IgG抗体在层层渗滤过程中与膜上抗原发生特异性结合，用胶体金标记物检测与抗原特异性结合的人IgG。仅需几分钟就能同时完成人血清样本中多种寄生虫抗体指标检测，具有高通量、操作简单，使用方便，适用于寄生虫病临床检验和血清流行病学调查。

Description

人体重要寄生虫抗原芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是用于检测血清中人体重要寄生虫抗体的抗原芯片及其制备方法。

背景技术

日本血吸虫病仍在我国7省市流行，有些地区出现疫情回升，据统计我国现有血吸虫感染人数达80多万。随着国民生活水平的提高，饮食多样化、生鲜菜肴时尚化等社会因素导致食源性寄生虫病流行状况发生明显变化，一些本已基本控制的食源性寄生虫病如华支睾吸虫病、肺吸虫病和原来较为少见的食源性寄生虫病如广州管圆线虫病、曼氏裂头蚴病发生再流行或小范围暴发流行。根据2001～2004第二次全国人体重要寄生虫病现状调查，华支睾吸虫等食源性寄生虫感染率明显上升，估计我国现有华支睾吸虫感染者1200多万，肺吸虫、囊虫感染者200多万。1996年之前在我国大陆极为少见的广州管圆线虫病，分别在温州、福州、北京等地发生暴发流行，引起严重的公共卫生问题。裂头蚴病的病例数也在不断增多。因临床上缺乏简便易行、准确的诊断试剂，寄生虫病被误诊或漏诊的现象较为普遍，给患者带来极大的痛苦。特别是猪囊虫、曼氏裂头蚴、肺吸虫、血吸虫、广州管圆线虫、旋毛虫、棘颚口线虫、弓形虫侵入人体后，其幼虫或成虫或虫卵可移行寄生在脑、眼、肝、肺、心等人体重要脏器，严重时甚至危及生命。

查见虫卵、幼虫或成虫等病原体虽可确诊，但是这些寄生虫的寄生部位多变，病原学检测存在很大的局限性。如，脑脊液中广州管圆线虫的检出率仅1～3％，血吸虫病、华支睾吸虫病、肺吸虫病粪检阳性率仅30～50％，囊虫、曼氏裂头蚴、旋毛虫、弓形虫需组织活检病原体，当寄生在深部组织时病原学检查受到限制。因此，这些寄生虫病的病原学诊断远远不能满足临床诊治的要求，血清中特异性抗体检测结果通常是这些寄生虫病诊断和鉴别诊断的重要依据。

生物芯片技术是新近发展起来的高新技术，集生物信息学、材料学、自动化等交叉学科的优势，能对生物信息进行快速、高效、准确的检测分析。生物芯片被认为是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。生物芯片根据芯片上的探针不同可以分为基因芯片和蛋白芯片两大类。芯片上固定的探针是特定的基因片段，称为基因芯片。芯片上固定的探针是蛋白质或多肽类分子，称为蛋白芯片。若蛋白芯片上固定的均为特异性抗原，这种蛋白芯又可称之为抗原芯片。在临床医学中，感染性疾病免疫诊断主要依靠抗原和抗体的检测。因此，在生物芯片领域中，对感染性疾病的早期诊断、疗效考核上，蛋白芯片明显优于基因芯片。利用蛋白芯片技术同时对多种疾病的标志物(特异性抗体或抗原等)进行平行检测分析，使得用常规方法需要多次检测才能完成的检验工作在蛋白芯片上仅需一次就可以完成，并且多项指标平行检测分析，结果更准确可靠。

现有蛋白芯片技术的检测系统大多用荧光标记，虽然灵敏度高，但检测时需用昂贵的特殊仪器设备，大大限制了该技术在临床上推广应用。

国内外已有血吸虫、肺吸虫、华支睾吸虫、囊虫、旋毛虫、广州管圆线虫、弓形虫抗体检测试剂和相关的研究报道，但多为单项寄生虫抗体检测。由于这些寄生虫病的临床表现缺乏特异性，医务人员难以确定是何种寄生虫感染时，需用单项试剂盒一一进行检测，每次检测只能完成一个指标，不仅速度慢、效率低、费用高，而且待检样本的量要大。

发明内容

本发明的目的是提供一种简易、快速、不需特殊仪器设备，且能同时完成多种人体重要寄生虫抗体平行检测的抗原芯片及制备方法。

本发明将对人体危害严重的血吸虫、肺吸虫、华支睾吸虫、囊虫、曼氏裂头蚴、旋毛虫、广州管圆线虫、弓形虫等寄生虫的抗原阵列点样于固相膜性载体上，采用特制的垂直流芯片检测装置，应用颜色鲜艳的胶体金二抗结合物或胶体金蛋白A结合物为检测标记物，检测病人血清中人体重要寄生虫特异性γ免疫球蛋白(IgG)。血清中IgG抗体在层层渗滤过程中与膜上抗原发生特异性结合，用胶体金标记物检测与抗原特异性结合的人IgG。仅需几分钟就能同时完成人血清样本中多种寄生虫抗体指标检测，具有高通量、操作简单，使用方便，适用于寄生虫病临床检验和血清流行病学调查。

本发明集现代免疫学技术、生物芯片高新技术和胶体金标记技术为一体，将对人体危害较严重、诊断较难的血吸虫病、肺吸虫病、华支睾吸虫病、囊虫病、曼氏裂头蚴病、旋毛虫病、广州管圆线虫病、弓形虫病等寄生虫的抗原以微阵列形式密集在一张10×10mm大小的固相膜性载体上，只需一次采样、加样检测，就能完成上述所有寄生虫的特异性抗体指标检测，并且多种寄生虫抗体指标平行检测，有利于结果比较分析，可大大提高诊断的可靠性。

本发明涉及一种人体重要寄生虫抗原芯片，检测系统由：人体重要寄生虫抗原阵列点样芯片、特制垂直流芯片反应体系、金标液、洗脱液组成。

本发明涉及的一种人体重要寄生虫抗原芯片，其垂直流芯片反应体系由垂直流芯片反应器、吸水垫料和固相膜性载体组成。芯片反应器为由聚丙烯反应盒，分底座、反应盒盖有一10×10mm方形反应检测示窗。

本发明人体重要寄生虫抗原芯片的制备方法，包括以下步骤：

1)将人体重要寄生虫抗原探针用pH为7.0～8.5的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成0.2～2mg/ml的蛋白浓度，用芯片自动点样仪将抗原探针和内参照质控点人γ免疫球蛋白(IgG)点样在孔径为0.2～0.65μm的硝酸纤维素膜或醋酸纤维素混合膜上，20～25℃放置2小时，或4～10℃放置过夜。

2)将抗原芯片置垂直流芯片反应器检测示窗下方，下面衬以吸水垫料和反应盒底座，反应盒盖和底座扣紧，4～20℃密封保存。

本发明涉及人体重要寄生虫抗原芯片的制备方法，其点样密度、蛋白点的大小、点间距，可随抗原样品数的数目而改变；点样密度9～25点/cm²，点样量10～200nl/点。

人体重要寄生虫抗原和内参照质控人γ免疫球蛋白(IgG)以矩阵列点样在一张10×10mm的膜性载体上，同属吸虫类的华支睾吸虫(Cls)、并殖吸虫(Pw)、日本血吸虫抗原(Sj)依次相邻排列，同属线虫的旋毛虫(Ts)、广州管圆线虫(Ac)抗原相邻排列，同属绦虫的猪囊虫(Cyt)、曼氏裂头蚴(Sm)抗原相邻排列，内参照质控点人γ免疫球蛋白(IgG)(C)居中，起座标作用。

本发明涉及的人体重要寄生虫抗原芯片，包括点阵列抗原芯片、垂直流芯片反应体系、胶体金标记显色体系。

本发明人体重要寄生虫抗原芯片所涉及的点阵列抗原芯片包括固相膜性载体和阵列式分布的寄生虫抗原与内参照质控人IgG。固相膜性载体可以是孔径为0.2～0.65μm的硝酸纤维素膜或硝酸醋酸混合纤维素膜。人体重要寄生虫抗原可以是虫源性粗抗原或部分纯化抗原组分或重组抗原，如：1)华支睾吸虫(Cls)，为成虫可溶性抗原；2)并殖吸虫抗原(Pw)，可以是卫氏并殖吸虫成虫可溶性抗原或排泄分泌抗原；3)日本血吸虫抗原(Sj)，可以是虫卵可溶性抗原、成虫可溶性抗原或尾蚴膜可溶性抗原；4)囊虫抗原(Cyt)，可以是囊液抗原或囊尾蚴可溶性抗原或两者的层析纯化抗原；5)曼氏裂头蚴抗原(Sm)，可以是裂头蚴可溶性抗原或29～36kDa纯化抗原；6)广州管圆线虫抗原(Ac)，可选用III～V期幼虫可溶性抗原或成虫可溶性抗原；7)旋毛虫抗原(Ts)，可为感染期幼虫可溶性抗原；8)弓形虫抗原(Tox)可选用全虫抗原或排泄分泌抗原。

本发明人体重要寄生虫抗原芯片所述的人体重要寄生虫抗原和内参照质3控人IgG，点样前用pH为7.0～8.5的PBS稀释到蛋白浓度为0.2～2.0mg/ml。PBS稀释液的配方：0.2g/L氯化钾，1.44g/L磷酸氢二钠，0.24g/L磷酸二氢钾，8g/L氯化钠。

本发明人体重要寄生虫抗原芯片所述的人体重要寄生虫抗原和内参照质控人IgG矩阵排列为：9～11个蛋白样品按3×3点阵，点阵密度9点/cm²；1215个蛋白样品按3×4点阵，点阵密度12点/cm²；16～19个蛋白样品按4×4点阵，点阵密度16点/cm²；20～24个蛋白样品按4×5点阵，点阵密度20点/cm²；25个蛋白样品按5×5点阵，点阵密度25点/cm²。

本发明人体重要寄生虫抗原芯片所涉及的垂直流芯片反应器，为长65mm、宽30mm、高18mm的塑料小盒，分底座和盒盖，盒盖右侧有一10mm×10mm的方孔，即芯片的反应检测示窗，左侧留有空白处可记录样本编号等信息，如示意图1。底座和盒盖之间有腔室，用于置吸水垫料，能充分吸纳样本检测时流下的液体。抗原芯片置反应检测示窗正下方的吸水垫料上，盒盖和底座扣合时使得芯片与盒盖、垫料紧密接合，保证样本检测时，示窗中的反应液匀速垂直流下。

本发明人体重要寄生虫抗原芯片所涉及的金标液制备方法：0.01％氯金酸(HAuCl₄)溶液100ml加热煮沸，搅拌下加入1％柠檬酸钠2～6ml，继续加热至溶液呈酒红色，冷却至室温，用新鲜配制的0.2M K₂CO₃溶液调pH值至6.0～9.0条件下标记抗人IgG二抗或胶体金(SPA)，加少量PEG20000，4～10℃高速离心浓缩胶体金标记物，用pH为6.0～8.5，浓度为0.01～0.05M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(TBS)稀释至工作浓度，4～20℃避光保存。

本发明人体重要寄生虫抗原芯片所涉及的洗脱液配方：100ml 0.01～0.05MTBS(PH7.0～8.5)，加0.05～0.1克叠氮钠、10～100μl吐温-20、10～100μl曲拉通X-100，搅拌混匀。

上述人体重要寄生虫抗原芯片制备方法的具体步骤如下：

1、抗原准备

血吸虫、肺吸虫、华支睾吸虫、囊虫、曼氏裂头蚴、旋毛虫、广州管圆线虫、弓形虫等寄生虫抗原点样前用抗原稀释液稀释至工作浓度。

2、最佳抗原工作浓度确定

每一种抗原用抗原稀释液稀释成0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0mg/ml蛋白浓度，再加0.1mg/ml人IgG为内参照质控，共9个样品，按3×3阵列点样制成最佳抗原工作浓度筛选芯片，用该芯片检测30份健康人血清、30份病人血清，以特异性、敏感性最高的最小抗原浓度为最佳抗原点样浓度。

3、点样制备抗原芯片

寄生虫抗原加内参照质控人IgG，按抗原样品数目设计的点阵排列方式和位置，用芯片自动点样仪接触式点样。点阵形式为矩形阵列，点直径为0.5～1.5mm，点间距0.5～1.0mm，抗原阵列大小为6.5～9.0mm×6.5～9.0mm。点样后置4～20℃24小时，使抗原蛋白质与膜性载体牢固结合。

4、芯片反应器组装

反应器底座空槽内置满吸水垫料，将抗原芯片放置在吸水垫料上，抗原芯片的位置和方向与反应器盒盖上方形反应检测示窗吻合，反应器底座和盒盖合拢扣紧，密封包装后置4～20℃保存。

本发明具有以下优点：1)高通量，最多可以同时进行24种人体重要寄生虫抗体指标平行检测；2)采用垂直流检测装置，操作简易、快速，整个检测过程仅需3～5分钟；3)采用胶体金标记，肉眼直接判读结果，不需特殊仪器设备，非常适合临床即时检测和流行病学调查；4)所需样本量少，一次检测只需30～50微升血清。

附图说明

图1为垂直流抗原芯片反应器平面图，其中1)为样品信息记录处；2)为反应检测示窗。

图2为3×3抗原点排列位置示意图，第一排：华支睾吸虫抗原(Cls)、并殖吸虫抗原(Pw)、日本血吸虫抗原(Sj)；第二排：旋毛虫抗原(Ts)、人IgG(C)、囊虫抗原(Cyt)；第三排：广州管圆线虫抗原(Ac)、弓形虫抗原(Tox)、曼氏裂头蚴抗原(Sm)。

具体实施方式

实施例1：

人体重要寄生虫抗原芯片检测方法

8种人体重要寄生虫抗原和1个内参照质控人IgG，共9个蛋白样品，设定3×3点样阵列，点样量100nl，抗原点直径1.5mm，点间距1.2mm，抗原阵列大小为7.5mm×7.5mm，芯片大小12mm×12mm；3×3抗原点阵列，如示意图2。

按制备抗原芯片数目多少裁剪一定面积的孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜。用pH8.2 PBS分别将华支睾吸虫成虫可溶性抗原(Cls)、卫氏并殖吸虫成虫可溶性抗原(Pw)、日本血吸虫虫卵可溶性抗原(Sj)、广州管圆线虫成虫抗原(Ac)、曼氏裂头蚴可溶性抗原(Sm)、旋毛虫幼虫可溶性抗原(Ts)稀释至0.5mg/ml，将囊虫囊液粗抗原(Cyt)稀释至0.2mg/ml，将弓形虫全虫抗原(Tox)稀释至2.0mg/ml，人IgG稀释至0.1g/ml，用自动点样仪接触式点样，点样针吸取稀释好的抗原样品及内参照质控人IgG后直接点印至硝酸纤维素膜。在一张膜上，芯片按一个方向依次点样排列，做好抗原芯片上抗原排列方向记号。点样后20～25℃放置2小时，使抗原蛋白与硝酸纤维素膜充分结合固定。随后将按12mm×12mm大小一张张裁剪抗原芯片。

取芯片反应器底座，凹槽内放置好吸水垫料，再将抗原芯片放在盒盖反应检测示窗相对应的位置上，注意抗原芯片上下不要颠倒，然后取反应盒盖与底座对准，确定芯片的抗原阵列位于盒盖反应检测示窗中央后扣合。将装配好抗原芯片的反应器，用铝铂纸密封包装，4～20℃保存。

实施例2：

病人血清样本检测

取出装配好抗原芯片的反应器一只，置水平台面上，在芯片反应器反应检测示窗的方孔中加洗脱液(PH7.0，0.02M TBS，0.05％叠氮钠，0.05％吐温-20，0.1％Triton-100)50μl，待完全渗入后，加待检病人血清50μl，待完全渗入后加洗脱液50μl，待完全渗入后加金标液50μl，待完全渗入后加洗脱液50μl，待完全渗入后，可肉眼判读结果或用扫描仪扫描保存检测结果。每一操作步骤之间应连续进行，整个检测流程仅需3～5分钟。结果判断：位于中央的内参照质控点显示红色小圆点为本次检测有效，不显示红色小圆点，提示本次检测无效；观察8个相应寄生虫抗原点位置，出现抗原点大小的红色圆点为该寄生虫抗体阳性，不出现红色圆点为该寄生虫抗体阴性。

Claims

1、人体重要寄生虫抗原芯片，其特征在于检测系统由：人体重要寄生虫抗原阵列点样芯片、垂直流芯片反应体系、金标液、洗脱液组成。

2、根据权利要求1所述的寄生虫抗原芯片，其特征是垂直流芯片反应体系由芯片反应器、吸水垫料和固相膜性载体组成。

3、根据权利要求1所述的人体重要寄生虫抗原芯片的制备方法，其特征在于抗原芯片的制备方法包括以下步骤：

4、根据权利要求3所述的人体重要寄生虫抗原芯片的制备方法，其特征在于点样密度、蛋白点的大小、点间距，可随抗原样品数的数目而改变。

5、根据权利要求3所述的人体重要寄生虫抗原芯片的制备方法，其特征在于点样密度9～25点/cm²，点样量10～200nl/点。

6、根据权利要求3所述的人体重要寄生虫抗原芯片的制备方法，其特征在于人体重要寄生虫抗原和内参照质控人γ免疫球蛋白(IgG)以矩阵列点样在一张10×10mm的膜性载体上，抗原排列设计为同属吸虫类的华支睾吸虫(Cls)、并殖吸虫(Pw)、日本血吸虫抗原(Sj)依次相邻排列，同属线虫的旋毛虫(Ts)、广州管圆线虫(Ac)抗原相邻排列，同属绦虫的猪囊虫(Cyt)、曼氏裂头蚴(Sm)抗原相邻排列，内参照质控点人IgG(C)居中，起座标作用。