CN110452993A - 猪肉中食源性寄生虫的多重pcr检测引物组及试剂盒 - Google Patents

猪肉中食源性寄生虫的多重pcr检测引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测引物组及试剂盒；包括如SEQ ID NO.1/2所示的旋毛虫检测引物；如SEQ ID NO.3/4所示的刚地弓形虫检测引物；如SEQ ID NO.5/6所示的猪囊尾蚴检测引物；如SEQ ID NO.7/8所示的欧猥裂头蚴检测引物。本发明建立了能同时检测猪肉中猪囊尾蚴、旋毛虫、刚地弓形虫、欧猥裂头蚴的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法，极大地提高了分子检测的工作效率，而且方法的敏感性高、特异性强，适合于屠宰场、养殖场及出入境检验检疫机构等使用。

Description

猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测引物组及试剂盒。
背景技术
猪肉是我国居民最喜欢的肉类食品，但我国生猪产品的质量和安全离人民群众的期望仍有较大差距，食品安全事故频发，其中，食源性寄生虫是引发动物食品安全事件最主要的因素。寄生于猪肉中的食源性寄生虫主要包括猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫——猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)的幼虫欧猥裂头蚴(Spirometra erinaceieuropaei plerocercoid larvae)4种。
猪囊尾蚴寄生于猪的横纹肌，以及脑、心脏、皮下、眼、淋巴结、肺等组织和器官，人吃生的或含未杀死囊尾蚴的猪肉，以及被猪带绦虫虫卵污染的食物时造成感染。当寄生于人的脑部，其致残、致死率相当高，轻者引起头痛、头晕、恶心、呕吐，重者神经系统受损，癫痫频繁发作，颅内压升高，造成痴呆、失明等严重后遗症，甚至危及生命；如寄生于眼部，可引起视力下降甚至失明；寄生于肌肉，引起局部肌肉疼痛。由于寄生部位特殊，治愈非常困难。猪自身感染猪囊尾蚴后，亦可造成巨大的经济损失。2004年，全国第二次人体重要寄生虫病现状调查(简称“第二次全国寄生虫调查”)结果显示，我国共有29个省(区、市)存在其成虫带绦虫的流行，约55万人感染，感染率0.28％，较1988-1992年第一次调查上升52.5％，其中西藏、四川分别上升97.0％和98.0％。
猪的旋毛虫感染遍布我国26个省(区、市)，部分地区感染率高达10％～34.2％，对养猪业危害巨大，被农业部列为二类动物疾病。人通过生食或半生食含虫的肉类(主要是猪肉)而感染，其成虫寄生于肠黏膜上皮细胞，新生幼虫经血液循环移行后分布全身各处，尤其是骨骼肌细胞，且可长期寄生，终生带虫。感染初期，患者出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、乏力、发热畏寒症状；感染中期，表现常年肌肉酸痛和无力，持续性高热、头痛、头晕、水肿、皮肤瘙痒等症状，严重者丧失劳动能力；后期持续肌肉疼痛、消瘦乏力、严重衰竭，重度感染者可造成严重的心肌炎、心力衰竭、肺水肿、尿毒症及大脑损伤，导致死亡。全球约有1 100万人感染。我国居民血清阳性率为3.38％；至少有15个省(区、市)的121个县市报道存在病例；1964-2011年共暴发600余起，感染38 797例，死亡336例，95％因摄入携带旋毛虫的猪肉引起；隐性感染由1995年的200万人上升至4 000万人。
刚地弓形虫可感染包括人在内的200余种脊椎动物，我国猪的感染率为4.78％～85.7％，但多为隐性感染，缺乏明显的临床症状。人食用生的、未煮熟的猪肉可造成感染，对孕妇及免疫功能不全者的危害严重，常引起流产、死胎或早产，并可传给胎儿，导致智力发育缺陷、视力障碍、脑膜炎等急慢性疾病。国外人群平均感染率在0.6％～94.0％，约有10-20亿人感染，欧美地区较高，英、法、美国的感染率分别为20％～40％、80％～90％、50％～60％。我国居民感染率在0.1％-47.3％，第二次全国寄生虫调查显示，我国居民血清阳性率为7.97％，比第一次调查时上升45.2％，其中动物饲养员等特殊人群的阳性率高达9.83％，全国约6 000万人感染。目前刚地弓形虫病尚缺乏非常有效的治疗药物。
欧猥裂头蚴广泛寄生于猪、蛙、蛇等动物肌肉中，生食或半生食携带有裂头蚴或原尾蚴的猪肉等食物即可造成感染。该虫寄生于人体不同部位，其中眼裂头蚴病最常见，可引起眼脸红肿、结膜充血、奇痒、流泪，伴发热、恶心和呕吐，眼球运动障碍，严重者视角膜溃疡，并发白内障而失明；皮下裂头蚴病导致皮下结节、瘙痒、炎症、触痛或持续疼痛；脑裂头蚴病常阵发头痛，严重时昏迷、呕吐、视力模糊、肢体麻木甚至瘫痪；内脏裂头蚴病可引起呼吸道咳血、消化道炎症、尿道或膀胱炎症，后果严重。曼氏迭宫绦虫呈世界性分布，亚洲常见人患病的报道，全球病例超过1 400例，我国1000多例，尤以南方省区多见。近年来，该病发病率呈上升趋势，尤其脑脊髓裂头蚴病的比例明显增高，成为我国重要的人兽共患食源性寄生虫病之一。
上述4种食源性寄生虫均主要寄生于猪的肌肉中，寄生部位重叠。其中旋毛虫常采用目检法、压片镜检、肌肉集样消化法检查膈肌脚；猪囊尾蚴常采用目检法检测咬肌、腰肌、眼部肌肉，或采用免疫学检测方法，但不少检测抗原与其他蠕虫存在交叉反应；欧猥裂头蚴多采用目视法检测猪的腹膜下脂肪、膈肌、腹斜肌。由于其虫体较小，容易漏检；对熟练程度要求较高，不熟练人员，极易误诊；敏感性差。而血清学方法存在交叉反应，特异性较差。近几年，上述4种食源性寄生虫病相继建立了PCR等分子检测方法，但检测效率较低，一次常只能检测一种食源性寄生虫。
多重PCR(multiplex PCR)技术在常规的PCR技术的基础上，通过将多套引物混合在一起，优化反应条件后，实现一个反应检测多种食源性寄生虫的目的，极大地提高了检测效率，又保留了普通PCR敏感性高、特异性好的特点，适合现场及流行病学调查时大量样本的检测。目前文献中已有同时检测猪肉中2种食源性寄生虫(如旋毛虫和猪囊尾蚴)的多重PCR方法报道，但尚未见能同时检测旋毛虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴、刚地弓形虫4种食源性寄生虫的多重PCR方法。同时，采用该现有文献报道的猪囊尾蚴扩增引物，极易与其他食源性寄生虫(如欧猥裂头蚴)出现非特异性条带。为此，申请者在反复进行序列比对的基础上，专门为该多重PCR设计了猪囊尾蚴的特异性引物，经试验，发现与其他食源性寄生虫之间无非特异性扩增，解决了困扰多重PCR设计的难题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的4种食源性寄生虫病PCR等分子检测方法检测效率较低，且一次常只能检测一种食源性寄生虫的缺陷，提供一种猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测引物组及试剂盒。更具体是提供一种能够准确、快速、稳定、特异性和敏感性高的用于检测猪肉等产品中猪囊尾蚴、旋毛虫、刚地弓形虫、欧猥裂头蚴的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测引物组，所述引物组包括如下四对引物：
旋毛虫检测引物：
Ts-F：5’-GTT CCA TGT GAA CAG CAG T-3’，
Ts-R:5’-CGA AAA CAT ACG ACA ACT GC-3’；
刚地弓形虫检测引物：
Tg-F:5’-GAT TTG CAT TCA AGA AGC TGA TAG TAT-3’，
Tg-R:5’-AGT TAG GAA GCA ATC TGA AAG CAC ATC-3’；
猪囊尾蚴检测引物：
Cc-F:5’-TCT GCT TGC GTA TTG GAT AA-3’，
Cc-R:5’-TGT ACA ATC ATC CAC CCA AC-3’；
欧猥裂头蚴检测引物：
Sm-F:5’-ACT TGA TCA TTT AGA GGA AGT-3’，
Sm-R:5’-CTC CGC TTA GTG ATA TGC T-3’。
第二方面，本发明涉及一种前述的多重PCR检测引物组在制备检测猪肉中食源性寄生虫的试剂盒中的用途，所述食源性寄生虫包括旋毛虫、刚地弓形虫、猪囊尾蚴和欧猥裂头蚴。
第三方面，本发明涉及一种猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括前述的多重PCR检测引物组。
作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒包括混装在一起的所述四对引物，四对引物的摩尔比为Ts:Tg:Cc:Sm＝1:1:1:1。
作为本发明的又一个实施方案，所述试剂盒包括独立包装的所述四对引物。
作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒包括：含Mg2+的10×PCR反应缓冲液、每种浓度为2.5mM的dNTP、每种浓度为10μM的上游引物、每种浓度为10μM的下游引物、4种阳性对照DNA和超纯水。
第四方面，本发明涉及一种猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测方法，所述方法包括如下步骤：
S1、提取待测样品的总DNA；
S2、采用权利要求2所述试剂盒中的四对引物，以所述总DNA为模板进行多重PCR反应，获得扩增后的物料；
S3、琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增后的物料中含120bp的扩增产物，则样品中含有旋毛虫；若扩增后的物料中含333bp的扩增产物，则样品中含有刚地弓形虫；若扩增后的物料中含523bp的扩增产物，则样品中含有猪囊尾蚴；若扩增后的物料中含1300bp的扩增产物，则样品中含有欧猥裂头蚴。
作为本发明的一个实施方案，所述多重PCR反应中，所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为Ts-F/R 10μM，Tg-F/R 10μM，Cc-F/R 10μM，Sm-F/R 10μM。
作为本发明的一个实施方案，所述多重PCR反应条件为：95℃变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；再72℃延伸7min。
作为本发明的一个实施方案，所述多重PCR反应采用25μL反应体系，其中含Mg2+的10×PCR反应缓冲液2.5μL，每种浓度为2.5mM的dNTP 2μL，浓度为8000U/mL的Ex Taq酶0.5μL，每种浓度为10μM的上游引物组1μL，每种浓度为10μM的下游引物组1μL，模板DNA 2μL，超纯水16μL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明建立了能同时检测猪肉中猪囊尾蚴、旋毛虫、刚地弓形虫、欧猥裂头蚴的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法，极大地提高了分子检测的工作效率，而且方法的敏感性高、特异性强，适合于屠宰场、养殖场及出入境检验检疫机构等使用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为检测猪肉中4种食源性寄生虫的多重PCR扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准DL2000；1：模板中仅含旋毛虫DNA；2：模板中仅含刚地弓形虫DNA；3：模板中仅含猪囊尾蚴DNA；4：模板中仅含欧猥裂头蚴DNA；5：模板中含旋毛虫DNA和刚地弓形虫DNA；6：模板中含旋毛虫DNA和猪囊尾蚴DNA；7：模板中含旋毛虫DNA和欧猥裂头蚴DNA；8：模板中含刚地弓形虫DNA和猪囊尾蚴DNA；9：模板中含刚地弓形虫DNA和欧猥裂头蚴DNA；10：模板中含猪囊尾蚴DNA和欧猥裂头蚴DNA；11：模板中含旋毛虫DNA、刚地弓形虫DNA和猪囊尾蚴DNA；12：模板中含旋毛虫DNA、刚地弓形虫DNA和欧猥裂头蚴DNA；13：模板中含刚地弓形虫DNA、猪囊尾蚴DNA和欧猥裂头蚴DNA；14、16-17：模板中含有旋毛虫、刚地弓形虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴4种DNA；15：阴性对照；
图2为多重PCR方法的敏感性试验结果；其中，M：DNA分子质量标准DL2000；1-5：将混合DNA模板分别进行100、10-1、10-2、10-3、10-4倍稀释后，进行多重PCR扩增；N：阴性对照；
图3为多重PCR方法的特异性试验结果；其中，M：DNA分子质量标准DL2000；1：刚地弓形虫；2：旋毛虫；3：猪囊尾蚴；4：欧猥裂头蚴；5、日本血吸虫；6：微小隐孢子虫；7：柔嫩艾美耳球虫；8：细粒棘球绦虫；N：阴性对照；
图4为部分猪膈肌样品4种寄生虫携带情况的多重PCR检测结果；
图5为对照的多重PCR方法的特异性试验结果；其中，Maker：DL2000；1.旋毛虫；2.囊虫；3.肉孢子虫；4.裂头蚴(Ex Taq酶)；5-10.四种寄生虫任意两两组合；11-14.四种寄生虫任意三种组合；15.四种寄生虫的多重PCR；16.阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
本实施例涉及一种用于检测猪肉等产品中猪囊尾蚴、旋毛虫、刚地弓形虫、欧猥裂头蚴的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法。具体步骤如下：
1、引物组设计
本实施例的检测猪肉中猪囊尾蚴、旋毛虫、刚地弓形虫、欧猥裂头蚴的多重PCR引物组如表1所示，包括：
(1)旋毛虫：
Ts-F:5’-GTT CCA TGT GAA CAG CAG T-3’； SEQ ID NO.1
Ts-R:5’-CGA AAA CAT ACG ACA ACT GC-3’； SEQ ID NO.2
预期扩增产物大小为：120bp。
(2)刚地弓形虫：
Tg-F:5’-GAT TTG CAT TCA AGA AGC TGA TAG TAT-3’； SEQ ID NO.3
Tg-R:5’-AGT TAG GAA GCA ATC TGA AAG CAC ATC-3’； SEQ ID NO.4
预期扩增产物大小为：333bp。
(3)猪囊尾蚴：
Cc-F:5’-TGT TTA TTT GAT GGT GGC CT-3’； SEQ ID NO.5
Cc-R:5’-CAT CCA CCC AAC GCA TAT AA-3’； SEQ ID NO.6
预期扩增产物大小为：523bp。
(4)欧猥裂头蚴：
Sm-F:5’-ACT TGA TCA TTT AGA GGA AGT-3’； SEQ ID NO.7
Sm-R:5’-CTC CGC TTA GTG ATA TGC T-3’； SEQ ID NO.8
预期扩增产物大小为：1300bp。
表1四种食源性寄生虫扩增引物
将上述设计的引物，按使用浓度为10μM的各种引物，采用常规方法制备得到上游特异性引物组和下游特异性引物组。
2、反应体系和反应参数
本实施例的多重PCR采用25μL反应体系，其中含Mg2+的10×PCR反应缓冲液2.5μL，每种浓度为2.5mM的dNTP 2μL，浓度为8000U/mL的Ex Taq酶0.5μL，每种浓度为10μM的上游引物组1μL，每种浓度为10μM的下游引物组1μL，模板DNA 2μL，超纯水16μL。
PCR反应参数为：95℃变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；再72℃延伸7min。
取反应产物10μL，在1％琼脂糖凝胶中，以120V电压电泳25min，凝胶成像系统中观察，看是否出现相应的扩增条带。
3、多重PCR扩增结果
以旋毛虫、刚地弓形虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴4种食源性寄生虫中的任何一种寄生虫DNA为模板，进行多重PCR，均只出现大小分别为120、333、523、1300bp左右的单一条带(图1)；
以旋毛虫、刚地弓形虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴4种食源性寄生虫中的任何二种寄生虫DNA为模板，进行多重PCR，均只出现相应的二条特异性条带(图1)；
以旋毛虫、刚地弓形虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴4种食源性寄生虫中的任何三种寄生虫DNA为模板，进行多重PCR，均只出现相应的三条特异性条带(图1)；
以旋毛虫、刚地弓形虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴4种食源性寄生虫DNA混合物为模板，进行多重PCR，出现所有4条特异性条带(图1)。
上述4种食源性寄生虫扩增产物序列具体为：
旋毛虫扩增产物序列如SEQ ID NO.9所示；
刚地弓形虫扩增产物序列如SEQ ID NO.10所示；
猪囊尾蚴扩增产物序列如SEQ ID NO.11所示；
欧猥裂头蚴扩增产物序列如SEQ ID NO.12所示。
4、敏感性试验
以旋毛虫、刚地弓形虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴DNA浓度分别为11.5ng/μL、10.3ng/μL、5.6ng/μL、12.0ng/μL的混合DNA，分别进行100、10-1、10-2、10-3、10-4倍稀释后，进行多重PCR扩增。图2结果显示，旋毛虫在10-4倍稀释后进行多重PCR，仍可以检出阳性；刚地弓形虫在10-1倍稀释后进行多重PCR，仍可以检出阳性；猪囊尾蚴在10-4倍稀释后进行多重PCR，仍可以检出阳性；欧猥裂头蚴在10-1倍稀释后进行多重PCR，仍可以检出阳性，表明多重PCR可分别有效检出1.15pg/μL浓度的旋毛虫、1.03ng/μL浓度的刚地弓形虫、0.56pg/μL浓度的猪囊尾蚴、1.20ng/μL浓度的欧猥裂头蚴的DNA。
5、特异性试验
分别以刚地弓形虫、旋毛虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴、日本血吸虫(Schistosomajaponicum)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)DNA进行多重PCR，结果只有弓形虫、旋毛虫、猪囊尾蚴、欧猥裂头蚴有扩增条带，而日本血吸虫、微小隐孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、细粒棘球绦虫无扩增条带(图3)。
6、田间初步应用
对广州、上海、重庆采集的120、127、173份田间猪膈肌样品，进行多重PCR检测(图4)，结果，发现猪囊尾蚴阳性样品17份，阳性率4.05％；旋毛虫阳性样品1份，阳性率0.24％；欧猥裂头蚴阳性样品15份，阳性率3.57％；393份样品中，弓形虫阳性样品21份，阳性率5.34％，详细见表2。
表2猪膈肌4种寄生虫携带情况的PCR检测
7、试剂盒组装
将含Mg2+的10×PCR反应缓冲液、每种浓度为2.5mM的dNTP、每种浓度为10μM的上游引物组、下游引物组、4种阳性对照DNA、超纯水组装成试剂盒。除超纯水常温保存，其余试剂均在-20℃条件下保存。
并且，本发明进一步用文献报道的引物组合进行本发明的多重PCR检测，作为对照：
旋毛虫Ts基因特异性引物：
TsP1：5’-Biotin-AGGTTCGAAGGCGATCAGATAC-3’，SEQ ID NO.13
TsP2：5’-CTGCTCGCCGAGTCTTAAATG-3’，SEQ ID NO.14
猪囊尾蚴Cc特异性引物：
CcP3：5’-Biotin-AGCGACGAGACGGGCATAC-3’，SEQ ID NO.15
CcP4：5’-CGCTGCTGTTGACTGATGATG-3’SEQ ID NO.16
结果如图5所示，发现存在非特异性条带，特异性差。可见，采用该现有文献报道的猪囊尾蚴扩增引物，极易与其他食源性寄生虫(如欧猥裂头蚴)出现非特异性条带。
综上所述，本发明提供了一种用于检测猪肉等产品中猪囊尾蚴、旋毛虫、刚地弓形虫、欧猥裂头蚴的多重PCR引物组、包括该引物组的多重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的多重PCR检测方法，具有敏感性高、特异性强等优点，适合于屠宰场、养殖场及出入境检验检疫机构等使用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测引物组及试剂盒
<130> DD05849
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttccatgtg aacagcagt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaaaacata cgacaactgc 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatttgcatt caagaagctg atagtat 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agttaggaag caatctgaaa gcacatc 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtttatttg atggtggcct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catccaccca acgcatataa 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acttgatcat ttagaggaag t 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctccgcttag tgatatgct 19
<210> 9
<211> 173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttccatgtg aacagcagtt ggacatgggt cagtcgatcc taagaaaacg gcgaaagctt 60
gttcgaattt gcgacatgaa ttgtaagact gaataattat ttgtgtgtgt gttgtggtgg 120
aggcgattgt gtcgtcacca gttgttgttg tgtgcagttg tcgtatgttt tcg 173
<210> 10
<211> 302
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatttgcatt caagaagcgt gatagtatcg aaaggtatta ttgccttctt catgttggat 60
atcctgcgct gcttccaata ttggaagcca gtgcaggtat ccgggggtgc acagcgaagg 120
ggctcaattt ctggaaattc gtgtctctgt tgggatactg atttccagga gtttcttcag 180
tgtgcattct tttttcccac accgttattt caaacaacaa atctgaggaa catttgagag 240
agagtgaaag attgtatctt tctgcatctc tctcgatgtg ctttcagatt gcttcctaaa 300
ct 302
<210> 11
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tctgcttgcg tattggataa agttttgcat gatacttgat ttgttgttgc tcattttcat 60
tatgttatgt cattagggtc ttatataaga ataataatta tgtttatttg atggtggcct 120
ttaattactg gtttgagatt aaataagtgt ttacttcagt gtcaatgtat aatatctaaa 180
attggattta atttatgttt ttttcctatg cattattttg gactgtgtgg attgcctcgt 240
cgtgtttgta tttatgaatg tgcttataat tgggttaaaa ttgtgtgtac tgtgggttct 300
tttatttctg cttttagtgg gtgttttttt atttttatac tttgagaatc aatggttaat 360
cgtaatgagg ttttaggttc atatggttcg tctagttgtt atgtggattt ttttatgagt 420
cctgtggctt ctcataatga ttatttttgt tatccatata gtgtggatta tacttatggt 480
gtatattata tgcgttgggt ggatgattgt aca 513
<210> 12
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acttgatcat ttagaggaag taaaagtcgt aacaaggttt ccgtaggtga acctgcggaa 60
ggatcattac acgttccgtc tttatgcgcg agatagtgca tgctatctcg tgtattctta 120
ctgctgctgc catgctactg cttaaggcta gtggtgtggt ggtatgcatc ggatctgtcc 180
gtcatggcag tccacaaata ttgcggtggg gtgtctgtcc tgtcggctgc ccgccaggtg 240
tgctcgcttt cctccagatc gccagttaac accggggtga cagggtagtg cacgtatgag 300
gttgagctgt ttgtgtgcct gtgcgcagct gctccttgta cgagtgcaag gcgtaagact 360
cgggactcgc taacacggcg atctcggcgc cccactatgt gtcagttgtt ttgtgttgtt 420
gttgttgttg ttgttttaca ccctgtgggc gtggttcttc catgctctcg cttaccatgc 480
tcttctgcat agttgagcag ggtggtgcac tccttgttgg ttggttggtc gctgaccggc 540
tggcccaagt tctagtgtgc ctaacaagat cggcggtctt atgacattgt cggtcgaaag 600
tacaactcta tgcggtggat cactcggctc gtgtgtcgat gaagagcgca gccaactgtg 660
tgaattaatg tgaatcgcag actgctttga acatcgacct cttgaacgca cattgcggcc 720
gtaggcttgc ctacggccac gtctggccga gggtcggctt ataaactatc acggtgcgct 780
aaaagccgtg gcttggaggg ttgccaactg gcgggataac tcaggcctcc tacgttgctg 840
ctgctgcttc tttcgtgcgt gtctatgtgt gtgtgtgtgt gtgtgcacgt atgggaggag 900
acggaggact gagagccagg ttgcaatggc tccttctcaa tgtggccttt atggcattta 960
agcgagttgc ctcctatgtg tgccttctgg taccggcggc ggcttctcct catcccctgc 1020
ctcgtgtgct tgtcctgcct ctctctctgt cgctctctgt ctgtgtatgg gagttgcgag 1080
ggcagcacat gtgtgttagt gcgtttgtgt ggcctgcgtc cctgtgtgtg gttgtgtgca 1140
tggggcgccg gtacgcactg gccgtggctc agtatgtgtg tagcacgccg tgcgagctct 1200
aacacacgca cacgtgtgtg tgtgtctggt agtggtgatg ttggggataa aaagctgcta 1260
tgttgatgtg tgccgatact gatggtggtg gtggtggtag ctactgcttg ctattcttta 1320
ttgcctgacc tcggatcagt cgtgattacc cgctgaactt aagcatatca ctaagcggag 1380
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggttcgaag gcgatcagat ac 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgctcgccg agtcttaaat g 21
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcgacgaga cgggcatac 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgctgctgtt gactgatgat g 21

Claims (10)

1.一种猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组包括如下四对引物：
旋毛虫检测引物：
Ts-F：5’-GTT CCA TGT GAA CAG CAG T-3’，
Ts-R:5’-CGA AAA CAT ACG ACA ACT GC-3’；
刚地弓形虫检测引物：
Tg-F:5’-GAT TTG CAT TCA AGA AGC TGA TAG TAT-3’，
Tg-R:5’-AGT TAG GAA GCA ATC TGA AAG CAC ATC-3’；
猪囊尾蚴检测引物：
Cc-F:5’-TCT GCT TGC GTA TTG GAT AA-3’，
Cc-R:5’-TGT ACA ATC ATC CAC CCA AC-3’；
欧猥裂头蚴检测引物：
Sm-F:5’-ACT TGA TCA TTT AGA GGA AGT-3’，
Sm-R:5’-CTC CGC TTA GTG ATA TGC T-3’。
2.一种权利要求1所述的多重PCR检测引物组在制备检测猪肉中食源性寄生虫的试剂盒中的用途，其特征在于，所述食源性寄生虫包括旋毛虫、刚地弓形虫、猪囊尾蚴和欧猥裂头蚴。
3.一种猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的多重PCR检测引物组。
4.如权利要求3所述的猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括混装在一起的所述四对引物，四对引物的摩尔比为Ts:Tg:Cc:Sm＝1:1:1:1。
5.如权利要求3所述的猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立包装的所述四对引物。
6.如权利要求3所述的猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：含Mg2+的10×PCR反应缓冲液、每种浓度为2.5mM的dNTP、每种浓度为10μM的上游引物、每种浓度为10μM的下游引物、4种阳性对照DNA和超纯水。
7.一种用于非诊断目的的猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、提取待测样品的总DNA；
S2、采用权利要求2所述试剂盒中的四对引物，以所述总DNA为模板进行多重PCR反应，获得扩增后的物料；
S3、琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增后的物料中含120bp的扩增产物，则样品中含有旋毛虫；若扩增后的物料中含333bp的扩增产物，则样品中含有刚地弓形虫；若扩增后的物料中含523bp的扩增产物，则样品中含有猪囊尾蚴；若扩增后的物料中含1300bp的扩增产物，则样品中含有欧猥裂头蚴。
8.如权利要求7所述的猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测方法，其特征在于，所述多重PCR反应中，所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为Ts-F/R 0.5～10μM，Tg-F/R0.5～10μM，Cc-F/R 0.5～10μM，Sm-F/R 0.5～10μM。
9.如权利要求7所述的猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测方法，其特征在于，所述多重PCR反应条件为：95℃变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；再72℃延伸7min。
10.如权利要求7所述的猪肉中食源性寄生虫的多重PCR检测方法，其特征在于，所述多重PCR反应采用25μL反应体系，其中含Mg2+的10×PCR反应缓冲液2.5μL，每种浓度为2.5mM的dNTP 2μL，浓度为8000U/mL的Ex Taq酶0.5μL，每种浓度为10μM的上游引物组1μL，每种浓度为10μM的下游引物组1μL，模板DNA 2μL，超纯水16μL。
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