CN102141569A

CN102141569A - 一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片及其制备方法

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Publication number: CN102141569A
Application number: CN2010105923452A
Authority: CN
Inventors: 陈家旭; 艾琳; 陈木新; 郭俭; 陈韶红; 蔡玉春; 张永年; 李�浩; 田利光; 张玲玲; 朱兴全
Original assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2011-08-03

Abstract

本发明公开了一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，属于生物工程领域，本发明一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，由一个固相载体构成，所述的固相载体上固定有华支睾吸虫抗原、卫氏并殖吸虫抗原和血吸虫抗原。本发明还提供了一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片的制备方法。本发明的芯片灵敏度高、特异性强，操作简便，一次反应可以同时诊断3种人体吸虫病。

Description

一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种蛋白质芯片，具体来说是一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片。

背景技术

生物芯片技术是九十年代中期兴起的一种新型生物学技术，它基于生物大分子(核酸、蛋白质等)间相互作用的大规模并行分析方法，并结合微电子、微机械、化学、物理、计算机等多领域的技术，将生命科学研究中所涉及的样品反应、检测、分析等过程连续化、集成化、微型化，已成为当今生命科学研究领域发展最快的技术之一。生物芯片可以广泛应用于农业、环境、食品、法庭、军事、科研等领域。不仅如此，由于生物芯片可同时检测多种疾病相关基因或蛋白，从而对遗传病、肿瘤、传染性疾病进行辅助诊断，所以它还具有重要的临床应用价值。

生物芯片主要分为三大类：核酸芯片、蛋白芯片和芯片实验室。蛋白芯片是检测蛋白质之间相互作用的生物芯片。蛋白芯片可通过发现体内特定蛋白质的含量变化，准确地对生理/病理变化作出判断。在临床诊断领域，蛋白芯片具有广泛的应用前景。

随着人们生活水平的不断提高，对生鲜食品的不断追求，我国食源性寄生虫病例，特别是华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病等，也在不断攀升。另，局部疫区的血吸虫病仍然很严重，随着经济的发展，人口的流动也越来越大，血吸虫病人也渐渐分布在全国各地。因此，对此这些吸虫病的诊断显得尤为重要。常规的对这几种吸虫的的诊断主要依靠临床症状、流行病史、实验室检查等进行综合判断。但往往有时同一器官或同一症状，均可这3种吸虫寄生引起，而在感染程度较轻时，不一定能从粪便中找到虫卵进行确诊鉴定。

因此，研制一种可满足快速、高效及高通量检测要求的同时鉴别检测三种吸虫的方法，对我们更好地控制此三种吸虫病具有巨大推动作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，所述的这种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片要解决现有技术中检测吸虫病只能耽搁检测，方法繁琐、检测时间长的技术问题。

本发明的这种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，由一个固相载体构成，所述的固相载体上固定有华支睾吸虫抗原、卫氏并殖吸虫抗原和血吸虫抗原，所述的华支睾吸虫抗原、卫氏并殖吸虫抗原和血吸虫抗原呈矩阵式排列。

具体的，所述的固相载体为硅片、载玻片或者尼龙膜。

进一步的，所述的华支睾吸虫抗原为华支睾吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。

进一步的，卫氏并殖吸虫抗原为卫氏并殖吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。

进一步的，所述的血吸虫抗原为血吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。

进一步的，所述的固相载体上还固定有阴性反应对照，所述的阴性反应对照物为点样的缓冲液。

进一步的，所述的点样的缓冲液为pH值在9.0-10.0之间的碳酸盐缓冲液，具体为NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液。

进一步的，所述的固相载体上还固定有阳性反应对照，所述的阳性反应对照物为羊抗人IgG或者羊抗人IgM。

进一步的，所述的固相载体上还固定有质量控制对照物，所述的质量控制对照物荧光素标记的羊抗人IgG或者荧光素标记的羊抗人IgM。

进一步的，所述的荧光素标记物为异硫氰酸荧光素或花青类。

本发明还提供了上述蛋白芯片的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

1)将有华支睾吸虫抗原、卫氏并殖吸虫抗原和血吸虫抗原探针分别溶于pH值为9.0-10.0的碳酸盐缓冲液中，然后用芯片自动点样系统将蛋白质点制在固相载体上，点样密度为16-200点/cm²，点样量为0.1-10ng/点；

2)2-8℃放置过夜固定；

3)用封闭液将蛋白芯片的未点样部位封闭并冻干处理，2-8℃贮存备用。

进一步的，所述的封闭液中含有TBS溶液和质量百分比为1-9％的蔗糖、质量百分比为1-9％的牛血清白蛋白(BSA)、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为0.05-0.3％的酪氨酸、质量百分比为0.2-1％NaN₃，其中TBS含有质量百分比为0.8-0.9％NaCl和质量百分比为1.1-1.5％Tris。

本发明的原理是：蛋白芯片是一种将大量的吸虫抗原蛋白分子有规律地固定在某种固相介质上，利用蛋白质与蛋白质、酶和底物以及蛋白质与其他分子间的相互作用进行检测分析的一项技术，是生物芯片的重要组成部分。

该技术由芯片、样品处理系统和数据分析系统组成。首先将各种吸虫的蛋白质(抗原)有序地固定于载玻片、尼龙膜等各种载体上成为检测用的芯片；待芯片固定好后，用血清、抗体等待测样品在芯片上进行孵育，清洗掉未结合的样品；然后用标记了特定荧光素的抗体或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪(芯片扫描仪)测定芯片上各点的荧光强度，从而达到检测的目的。

本发明的有益效果是：操作简便，每次反应约需1.5-2h，仅需极少量抽一次血即可准确地完成对华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和血吸虫病的检测，从而快速实现多指标并行检测三种重要吸虫病，省去了传统ELISA需要多次检测才能获得多指标结果的麻烦。

附图说明

图1是本发明的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白的芯片点阵结构示意图和检测结果显示图像。其中，a表示芯片点阵，其中：QC表示质量控制；NC表示阴性反应对照；PC表示阳性反应对照；1-3依次表示华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫和血吸虫抗原；b-d分别表示检测的华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫和血吸虫病人阳性血清；e表示检测的正常人血清；f表示检测的蛔虫病人血清。

具体实施方式

以下实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明。

对实施例所涉及仪器的说明：

芯片点样仪：中国博奥生物有限公司，Personal Arrayer^TM 16；

芯片洗干仪：中国博奥生物有限公司，Slider Washer 8；

芯片扫描仪：中国博奥生物有限公司，晶芯

LuxScan^TM 10K；

实施例1

以玻璃基片为固相载体经过氨基化处理和压穴处理后，利用Personal Arrayer^TM 16芯片点样仪把20nL平均浓度为0.5-1.0mg/mL的华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫和血吸虫等纯化抗原点阵于该基片的同一反应腔室内，点样重复2次，点间的距离为0.1-1.0mm，蛋白质通过化学键连接于固相载体上；点样后，放置于湿盒中，以含BSA 5％的封闭液进行封闭，晾干后放置于4℃冰箱保存即为蛋白芯片成品，点阵图如图1a所示。

进一步的，所述的点样的缓冲液为pH值在9.0-10.0之间的NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液。

进一步的，所述的固相载体上还固定有质量控制对照物，所述的质量控制对照物为荧光素标记的羊抗人IgG或者荧光素标记的羊抗人IgM。

实施例2：

一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片制备方法如下：

1)将华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫和血吸虫的纯化抗原探针溶于pH值为9.0-10.0的NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液中，然后用芯片自动点样系统将蛋白质点制在固相载体上，点样密度为16-200点/cm²，点样量为0.1-10ng/点；

2)4℃放置过夜固定；

3)用封闭液将蛋白芯片的未点样部位封闭并冻干处理，4℃贮存备用。

进一步的，所述的封闭液中含有TBS溶液、质量百分比为1-9％的蔗糖、质量百分比为1-9％的牛血清白蛋白(BSA)、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为0.05-0.3％的酪氨酸、质量百分比为0.2-1％NaN₃，其中TBS含有质量百分比为0.8-0.9％NaCl、质量百分比为1.1-1.5％Tris。

实施例3：

一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片的使用方法，包括：

1)将结合了三种吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原(A)的固相载体与被检血清中特异抗体(B)接触，使其充分反应形成稳定的复合物A-B；

2)用洗涤液洗去未结合的血清抗体，1000g离心1min；

2)加入反应液，该稳定的复合物A-B进一步与荧光素标记的羊抗人IgG/IgM(C)反应液反应，形成稳定复合物A-B-C-labelled；

3)用洗涤液洗掉未结合的反应液，1000g离心1min；

4)进行信号检测。

进一步的，所述的反应液为异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)或花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)标记的羊抗人IgG或者羊抗人IgM。

进一步的，所述的稀释液内含质量百分比为0.8-0.9的NaCl、质量百分比为1.1-1.5％Tris、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为0.05-0.3％的酪氨酸。

进一步的，所述的洗涤液是Tris-HCl缓冲液，其中NaCl在洗涤液中的质量百分比为0.8-0.9％，Tris在洗涤液中的质量百分比为1.1-1.5％，Tween 20在洗涤液中的质量百分比为0.05-0.2％。

实施例4：

检测时，在蛋白芯片每个反应腔室内加入20-30uL用稀释液100倍稀释后的待检血清，37℃孵育30min后，在芯片洗干仪Slider Washer8中操作，用洗涤液漂洗3次，每次5min，1000g离心1min；然后加入用稀释液1000倍稀释的Cy3标记的羊抗人IgG或者羊抗人IgM反应液的20-30uL，37℃孵育30min，用洗涤液漂洗离心同上；最后在晶芯

LuxScan^TM 10K芯片扫描仪中进行扫描和数据分析，依此获得评判结果，在相应的点阵部位出现高信号强度的即为感染此吸虫病，如图1所示：b-d分别表示检测的华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫和血吸虫病人阳性血清；e表示检测的正常人血清；f表示检测的蛔虫病人血清。

实施例5：

检测的具体过程是：采集受试者外周血0.5-1mL，离心分离血清；1uL待检血清，用稀释液100倍稀释后，取20-30uL加入实施例1的蛋白芯片反应孔，37℃孵育30min，洗涤液漂洗3次，每次5min，1000g离心1min；然后加入用稀释液1000倍稀释的Cy3标记的羊抗人IgG或者羊抗人IgM反应液的20-30uL，37℃孵育30min，用洗涤液漂洗离心同上；最后在晶芯

LuxScan^TM 10K芯片扫描仪中进行扫描和数据分析，依此判断结果(如图1所示)。

Claims

1.一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，由一个固相载体构成，其特征在于：所述的固相载体上固定有华支睾吸虫抗原、卫氏并殖吸虫抗原和血吸虫抗原，所述的华支睾吸虫抗原、卫氏并殖吸虫抗原和血吸虫抗原呈矩阵式排列。

2.如权利要求1所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的华支睾吸虫抗原为华支睾吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。

3.如权利要求1所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，其特征在于：卫氏并殖吸虫抗原为卫氏并殖吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。

4.如权利要求1所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的血吸虫抗原为血吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。

5.如权利要求1所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的固相载体上还固定有阴性反应对照，所述的阴性反应对照物为点样的缓冲液。

6.如权利要求5所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的点样的缓冲液为pH值在9.0-10.0之间的碳酸盐缓冲液。

7.如权利要求1所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的固相载体上还固定有阳性反应对照，所述的阳性反应对照物为羊抗人IgG或者羊抗人IgM。

8.如权利要求1所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的固相载体上还固定有质量控制对照物，所述的质量控制对照物为荧光素标记的羊抗人IgG或者荧光素标记的羊抗人IgM。

9.如权利要求8所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的荧光素标记物为异硫氰酸荧光素或花青类。

10.权利要求1所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

2)2-8℃放置过夜固定；

11.如权利要求1所述的一种用于联合诊断三种吸虫病的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：所述的封闭液中含有TBS溶液和质量百分比为1-9％的蔗糖、质量百分比为1-9％的牛血清白蛋白、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为0.05-0.3％的酪氨酸、质量百分比为0.2-1％NaN₃，其中TBS含有质量百分比为0.8-0.9％NaCl和质量百分比为1.1-1.5％Tris。