CN102175860A - 一种检测寄生虫病的蛋白芯片及其试剂盒和制备方法 - Google Patents

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CN102175860A CN2010105923397A CN201010592339A CN102175860A CN 102175860 A CN102175860 A CN 102175860A CN 2010105923397 A CN2010105923397 A CN 2010105923397A CN 201010592339 A CN201010592339 A CN 201010592339A CN 102175860 A CN102175860 A CN 102175860A
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陈木新
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张永年
郭俭
李�浩
蔡玉春
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张玲玲
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Abstract

本发明提供了一种检测寄生虫病的蛋白芯片，由一个固相载体构成，所述的固相载体上分别固定有囊虫抗原、广州管圆线虫抗原、卫生并殖吸虫抗原、旋毛虫抗原和裂头蚴抗原。本发明还提供了一种检测寄生虫病的蛋白芯片的制备方法，还提供了一种含有上述蛋白芯片的试剂盒。本发明操作简便，每次反应约需1.5-2h，仅需极少量抽一次血即可准确地完成对囊虫病、广州管圆线虫病、卫生并殖吸虫病、旋毛虫病和裂头蚴病的检测，从而快速实现多指标并行检测寄生虫病，省去了传统ELISA需要多次检测才能获得多指标结果的麻烦。

Description

一种检测寄生虫病的蛋白芯片及其试剂盒和制备方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种工程蛋白质芯片，具体来说是一种检测寄生虫病的蛋白芯片及其试剂盒和制备方法。
背景技术
生物芯片技术是指通过微加工技术和微电子技术在固相基质表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。经过长足的发展，生物芯片技术已广泛应用于生命科学、医学诊断、药物筛选、农业、环保和食品科学等领域，并取得了丰硕的成果。生物芯片根据功能、研究对象的差异可分为基因芯片(包括DNA和RNA芯片)、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片和糖芯片等；根据其物理结构不同又可分为微点阵芯片、微珠芯片、微流控芯片和芯片实验室等。
近半个世纪以来，免疫诊断作为一种高敏感性的方法得到了广泛的应用。自上世纪八十年代末开始，微型蛋白芯片应用在免疫诊断方面的潜在优势才被渐渐得到认可。随着蛋白质组学研究的不断深入，更突出了蛋白芯片在蛋白质组学鉴定和功能研究中的重大意义。
目前，寄生虫病的诊断主要依靠临床症状、流行病史、实验室检查等进行综合判断。往往同一器官可由多种寄生虫寄生，同一种症状也可由多种寄生虫感染所引起。如，广州管圆线虫、猪囊虫、卫氏并殖吸虫、曼氏裂头蚴、旋毛虫等均可寄生于脑部，引起脑部刺激症状或占位性病变，病人均可表现为头晕、头痛、偏瘫、失语或癫痫等症状；肝、肺部、肠道等部位出现症状时，除了需要排除细菌性、病毒性等原因引起外，通常一种方法很难检测多种寄生虫感染，这使得检测成本大大提高，检测效率大大降低。由于感染率及感染度的降低，一般难以查到病原体，且有些组织或器官内寄生的寄生虫也无法用病原学的方法检查。如广州管圆线虫、曼氏裂头蚴、猪囊虫的感染等，很难查见病原体。
所以，研制一种可满足快速、高效及高通量检测的要求的多指标检测寄生虫病的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测寄生虫病的蛋白芯片，所述的这种检测寄生虫病的蛋白芯片要解决现有技术中检测寄生虫病只能单个检测，方法繁琐、检测时间长的技术问题。
本发明的这种检测寄生虫病的蛋白芯片，由一个固相载体构成，所述的固相载体上分别固定有囊虫抗原、广州管圆线虫抗原、卫生并殖吸虫抗原、旋毛虫抗原和裂头蚴抗原，所述的囊虫抗原、广州管圆线虫抗原、卫生并殖吸虫抗原、旋毛虫抗原和裂头蚴抗原呈矩阵式排列。
具体的，所述的固相载体为硅片、或者载玻片、或者尼龙膜。(妥)进一步的，所述的囊虫抗原为囊虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
进一步的，所述的广州管圆线虫抗原为广州管圆线虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
进一步的，所述的卫氏并殖吸虫抗原为卫氏并殖吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
进一步的，所述的旋毛虫抗原为旋毛虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
进一步的，所述的裂头蚴抗原为旋毛虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
进一步的，所述的固相载体上还固定有阴性反应对照，所述的阴性反应对照物为点样的缓冲液。
进一步的，所述的点样的缓冲液为pH值在9.0-10.0之间的碳酸盐缓冲液，具体为NaHCO3-Na2CO3缓冲液。
进一步的，所述的固相载体上还固定有阳性反应对照，所述的阳性反应对照物为羊抗人IgG或者羊抗人IgM。
进一步的，所述的固相载体上还固定有质量控制对照物，所述的质量控制对照物为荧光素标记的羊抗人IgG或者荧光素标记的羊抗人IgM。
进一步的，所述的荧光素标记物为异硫氰酸荧光素或花青类荧光素。
本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有上述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片。
进一步的，所述的试剂盒中还含有反应液、囊虫病病人血清样本、广州管圆线虫病病人血清样本、卫氏并殖吸虫病病人血清样本、旋毛虫病病人血清样本、裂头蚴病病人血清样本、健康人血清样品、稀释液和洗涤液。
进一步的，所述的反应液为荧光素标记的羊抗人IgG或者羊抗人IgM。
进一步的，所述的稀释液内含质量百分比为0.8-0.9％的NaCl、质量百分比为1.1-1.5％Tris、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为.05-0.3％的酪氨酸。
进一步的，所述的洗涤液内含质量百分比为0.8-0.9的NaCl、质量百分比为1.1-1.5％Tris、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20，pH值在7.0-9.0之间。
本发明还提供了上述检测寄生虫病的蛋白芯片的制备方法，包括如下步骤：
1)将囊虫抗原、广州管圆线虫抗原、卫生并殖吸虫抗原、旋毛虫抗原和裂头蚴抗原溶于pH值为9.0-10.0的碳酸盐缓冲液中，然后用芯片自动点样系统将蛋白质点制在固相载体上，点样密度为16-200点/cm2，点样量为0.1-10ng/点；
2)2-8℃放置过夜固定；
3)用封闭液将蛋白芯片的未点样部位封闭并冻干处理，2-8℃贮存备用。
进一步的，所述的封闭液中含有TBS溶液和质量百分比为1-9％的蔗糖、质量百分比为1-9％的牛血清白蛋白(BSA)、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为0.05-0.3％的酪氨酸、质量百分比为0.2-1％NaN3，其中TBS含有质量百分比为0.8-0.9％NaCl和质量百分比为1.1-1.5％Tris。
本发明的一种检测寄生虫病的蛋白芯片的使用方法包括：
1)将结合了5种寄生虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原(A)的固相载体与被检血清中特异抗体(B)接触，使其充分反应形成稳定的复合物A-B；
2)用洗涤液洗去未结合的血清抗体，1000g离心1min；
2)加入反应液，该稳定的复合物A-B进一步与荧光素标记的羊抗人IgG或IgM(C)反应液反应，形成稳定复合物A-B-C-labelled；
3)用洗涤液洗掉未结合的反应液，1000g离心1min；
4)进行信号检测。
本发明的原理是：蛋白芯片是一种将大量的寄生虫抗原蛋白分子有规律地固定在某种固相介质上，利用蛋白质与蛋白质、酶和底物以及蛋白质与其他分子间的相互作用进行检测分析的一项技术，是生物芯片的重要组成部分。
该技术由芯片、样品处理系统和数据分析系统组成。首先将各种吸虫的蛋白质(抗原)有序地固定于载玻片、尼龙膜等各种载体上成为检测用的芯片；待芯片固定好后，用血清、抗体等待测样品在芯片上进行孵育，清洗掉未结合的样品；然后用标记了特定荧光素的抗体或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪(芯片扫描仪)测定芯片上各点的荧光强度，从而达到检测的目的。
本发明的有益效果是：操作简便，每次反应约需1.5-2h，仅需极少量抽一次血即可准确地完成对囊虫病、广州管圆线虫病、卫生并殖吸虫病、旋毛虫病和裂头蚴病的检测，从而快速实现多指标并行检测寄生虫病，省去了传统ELISA需要多次检测才能获得多指标结果的麻烦。
图1是本发明的一种检测寄生虫病的蛋白芯片的芯片点阵结构示意图和检测结果显示图像。其中，a表示芯片点阵，其中：QC表示质量控制；NC表示阴性反应对照；PC表示阳性反应对照；1-5依次表示囊虫、广州管圆线虫、卫生并殖吸虫、旋毛虫和裂头蚴抗原；b-f分别表示检测的囊虫、广州管圆线虫、卫生并殖吸虫、旋毛虫、裂头蚴病人阳性血清；g表示检测的正常人血清；h和i分别表示检测的蛔虫和血吸虫病人血清。
具体实施方式
以下实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明。
对实施例所涉及仪器的说明：
芯片点样仪：中国博奥生物有限公司，Personal ArrayerTM 16；
芯片洗干仪：中国博奥生物有限公司，Slider Washer 8；
芯片扫描仪：中国博奥生物有限公司，晶芯
Figure BSA00000388905500061
LuxScanTM 10K；
实施例1
以玻璃基片为固相载体经过氨基化处理和压穴处理后，利用Personal ArrayerTM 16芯片点样仪把20nL平均浓度为0.5-1.0mg/mL的囊虫、广州管圆线虫、卫生并殖吸虫、旋毛虫和裂头蚴等纯化抗原点阵于该基片的同一反应腔室内，点样重复3次，点间的距离为0.1-1.0mm，蛋白质通过化学键连接于固相载体上；点样后，放置于湿盒中，以含BSA 5％的封闭液进行封闭，晾干后放置于4℃冰箱保存即为蛋白芯片成品，点阵图如图1a所示。
应用检测时，在蛋白芯片每个反应腔室内加入20-30uL用稀释液100倍稀释后待检血清，37℃孵育30min后，在芯片洗干仪SliderWasher 8中操作，用洗涤液漂洗3次，每次5min，1000g离心1min；然后加入用稀释液1000倍稀释的Cy3标记的羊抗人IgG或IgM反应液的20-30uL，37℃孵育30min，用洗涤液漂洗离心同上；最后在晶芯
Figure BSA00000388905500071
LuxScanTM 10K芯片扫描仪中进行扫描和数据分析，依此获得评判结果，在相应的点阵部位出现高信号强度的即为感染此寄生虫病，如图1所示：b-f分别表示检测的囊虫、广州管圆线虫、卫生并殖吸虫、旋毛虫、裂头蚴病人阳性血清；g表示检测的正常人血清；h和i分别表示检测的蛔虫和血吸虫病人血清。(h和i是做交叉反应对照，结果与阴性相同。)
进一步的，所述的固相载体上还固定有阴性反应对照，所述的阴性反应对照物为点样的缓冲液。
进一步的，所述的点样的缓冲液为pH值在9.0-10.0之间的NaHCO3-Na2CO3缓冲液。
进一步的，所述的固相载体上还固定有阳性反应对照，所述的阳性反应对照物为羊抗人IgG或者羊抗人IgM。
进一步的，所述的固相载体上还固定有质量控制对照物，所述的质量控制对照物为荧光素标记的羊抗人IgG或者荧光素标记的羊抗人IgM。
进一步的，所述的荧光素标记物为异硫氰酸荧光素或花青类荧光素。
实施例2：
本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有上述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片。
进一步的，所述的试剂盒中还含有反应液、囊虫病病人血清样本、广州管圆线虫病病人血清样本、卫氏并殖吸虫病病人血清样本、旋毛虫病病人血清样本、裂头蚴病病人血清样本、健康人血清样品、稀释液和洗涤液。
进一步的，所述的反应液为荧光素标记的羊抗人IgG或者羊抗人IgM。
进一步的，所述的稀释液内含质量百分比为0.8-0.9％的NaCl、质量百分比为1.1-1.5％Tris、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为.05-0.3％的酪氨酸。
进一步的，所述的洗涤液内含质量百分比为0.8-0.9的NaCl、质量百分比为1.1-1.5％Tris、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20，pH值在7.0-9.0之间。
实施例3：
本发明还提供了一种检测寄生虫病的蛋白芯片的制备方法，包括如下步骤：
1)将囊虫抗原、广州管圆线虫抗原、卫生并殖吸虫抗原、旋毛虫抗原和裂头蚴抗原溶于pH值为9.0-10.0的碳酸盐缓冲液中，然后用芯片自动点样系统将蛋白质点制在固相载体上，点样密度为16-200点/cm2，点样量为0.1-10ng/点；
2)2-8℃放置过夜固定；
3)用封闭液将蛋白芯片的未点样部位封闭并冻干处理，2-8℃贮存备用。
进一步的，所述的封闭液中含有TBS溶液和质量百分比为1-9％的蔗糖、质量百分比为1-9％的牛血清白蛋白(BSA)、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为0.05-0.3％的酪氨酸、质量百分比为0.2-1％NaN3，其中TBS含有质量百分比为0.8-0.9％NaCl和质量百分比为1.1-1.5％Tris。
本发明的一种检测寄生虫病的蛋白芯片的使用方法包括：
1)将结合了5种寄生虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原(A)的固相载体与被检血清中特异抗体(B)接触，使其充分反应形成稳定的复合物A-B；
2)用洗涤液洗去未结合的血清抗体，1000g离心1min；
2)加入反应液，该稳定的复合物A-B进一步与荧光素标记的羊抗人IgG或IgM(C)反应液反应，形成稳定复合物A-B-C-labelled；
3)用洗涤液洗掉未结合的反应液，1000g离心1min；
4)进行信号检测。
实施例4：
本发明的具体检测过程为：采集受试者外周血0.5-1mL，离心分离血清；1uL待检血清，用稀释液100倍稀释后，取20-30uL加入实施例1的蛋白芯片反应孔，37℃孵育30min，洗涤液漂洗3次，每次5min，1000g离心1min；然后加入用稀释液1000倍稀释的Cy3标记的羊抗人IgG或IgM反应液的20-30uL，37℃孵育30min，用洗涤液漂洗离心同上；最后在晶芯
Figure BSA00000388905500101
LuxScanTM 10K芯片扫描仪中进行扫描和数据分析，依此判段结果(如图1所示)。

Claims (18)

1.一种检测寄生虫病的蛋白芯片，由一个固相载体构成，其特征在于：所述的固相载体上分别固定有囊虫抗原、广州管圆线虫抗原、卫生并殖吸虫抗原、旋毛虫抗原和裂头蚴抗原，所述的囊虫抗原、广州管圆线虫抗原、卫生并殖吸虫抗原、旋毛虫抗原和裂头蚴抗原呈矩阵式排列。
2.如权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的囊虫抗原为囊虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
3.如权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的广州管圆线虫抗原为广州管圆线虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
4.如权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的卫氏并殖吸虫抗原为卫氏并殖吸虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
5.如权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的旋毛虫抗原为旋毛虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
6.如权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的裂头蚴抗原为旋毛虫粗抗原、纯化后的天然抗原蛋白片段或重组表达抗原。
7.如权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的固相载体上还固定有阴性反应对照，所述的阴性反应对照物为点样的缓冲液。
8.如权利要求7所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的点样的缓冲液为pH值在9.0-10.0之间的碳酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的固相载体上还固定有阳性反应对照，所述的阳性反应对照物为羊抗人IgG或者羊抗人IgM。
10.如权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的固相载体上还固定有质量控制对照物，所述的质量控制对照物为荧光素标记的羊抗人IgG或者荧光素标记的羊抗人IgM。
11.如权利要求10所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片，其特征在于：所述的荧光素标记物为异硫氰酸荧光素或花青类荧光素。
12.一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中含有权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片。
13.如权利要求12所述的一种试剂盒，其特征在于：还含有反应液、囊虫病病人血清样本、广州管圆线虫病病人血清样本、卫生并殖吸虫病病人血清样本、旋毛虫病病人血清样本、裂头蚴病病人血清样本、健康人血清样品、稀释液和洗涤液。
14.如权利要求13所述的一种试剂盒，其特征在于：所述的反应液为荧光素标记的羊抗人IgG或者羊抗人IgM。
15.如权利要求13所述的一种试剂盒，其特征在于：所述的稀释液内含质量百分比为0.8-0.9％的NaCl、质量百分比为1.1-1.5％Tris、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为.05-0.3％的酪氨酸。
16.如权利要求13所述的一种试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液内含质量百分比为0.8-0.9的NaCl、质量百分比为1.1-1.5％Tris、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20，pH值在7.0-9.0之间。
17.权利要求1所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将囊虫抗原、广州管圆线虫抗原、卫生并殖吸虫抗原、旋毛虫抗原和裂头蚴抗原溶于pH值为9.0-10.0的碳酸盐缓冲液中，然后用芯片自动点样系统将蛋白质点制在固相载体上，点样密度为16-200点/cm2，点样量为0.1-10ng/点；
2)2-8℃放置过夜固定；
3)用封闭液将蛋白芯片的未点样部位封闭并冻干处理，2-8℃贮存备用。
18.如权利要求17所述的一种检测寄生虫病的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：所述的封闭液中含有TBS溶液和质量百分比为1-9％的蔗糖、质量百分比为1-9％的牛血清白蛋白、质量百分比为0.05-0.2％的Tween 20、质量百分比为0.05-0.3％的酪氨酸、质量百分比为0.2-1％NaN3，其中TBS含有质量百分比为0.8-0.9％NaCl和质量百分比为1.1-1.5％Tris。
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