CN1330271A - 用于产前诊断的蛋白质芯片及制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明用于产前诊断的蛋白质芯片及制造方法,涉及生物芯片技术,蛋白质芯片是一种在固态基底上有序排布的蛋白质或多肽阵列,以实现对蛋白质进行并行检测、识别、鉴定和诊断的器件。本发明用于产前诊断的蛋白质芯片,是将弓形虫、风疹、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒(1型和2型)五项指标的抗原以及阳性对照、阴性对照点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内,蛋白质通过化学键连接于固相载体上而被固定,多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述五项指标的抗原。本发明实现了把ToRCH五项指标的抗原同时点阵于一张玻璃片上,仅通过一次反应即可得到多种指标的逐项反应结果,大大提高了检测速度、效率和灵敏度;检测结果稳定、可靠;操作安全。
Description
技术领域
本发明用于产前诊断的蛋白质芯片及制造方法，涉及生物芯片技术。蛋白质芯片是一种在固态基底上有序排布的蛋白质或多肽阵列，以实现对蛋白质进行并行检测、识别、鉴定和诊断的器件。可应用于生物学、医学及其相关领域。
背景技术
弓形虫(Toxoplasma)、风疹(Rubella)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV，1型和/或2型)是对孕妇进行产前检查的五项重要指标，简称ToRCH。ToRCH是一组广泛传播的病原微生物，孕妇由于内分泌的改变和免疫力下降，易发生原发感染和复发感染，并可通过胎盘、产道或母乳传染给胎儿或新生儿。胎儿感染可导致流产、早产、死胎或胎儿生长迟缓和畸形；新生儿感染可造成智力障碍以及瘫痪、失明、失聪等严重后遗症。其中，子宫内弓形虫感染可导致新生儿严重的中枢神经系统疾病和视觉障碍；风疹感染可导致胎儿死亡或先天性白内障、心脏病、青光眼、耳聋等；CMV感染可诱导肝炎、肺炎或单核细胞增多症等；HSV感染后虽然通常临床症状不明显，可是对新生儿或免疫能力不足者可致命。因此五项若在孕期感染，只其中一项即可使胎儿产生严重缺陷。ToRCH诊断对于了解孕妇的免疫力和胎儿的健康状况有着积极的作用，是孕妇必检的项目之一。
目前临床上进行ToRCH诊断的方法主要是用酶联免疫分析技术(Enzyme-Linked Immunoassay，EIA)的方法检测血清中上述各项的抗体(IgG或IgM)。具体地说，当检测IgG时，酶标板上包被该项目相应的抗原，与血清中相应的IgG孵育结合，然后加入酶标二抗，最后加入底物显色，与阴性对照比色以判断结果；当检测IgM时，酶标板上包被该项目相应的二抗，与血清中相应的IgM孵育结合，然后依次加入抗原、酶标抗体，最后加入底物显色，与阴性对照比色以判断结果。
ToRCH的ELISA试剂盒，目前有两种，一种是逐项进行检查，也就是分别需要10个试剂盒将所有的IgM和IgM检测完毕，每次反应只能检测一个指标，速度慢，效率低；另一种试剂盒将五项IgG或IgM的指标混合在一起，只要最终比色超过阴性对照，就判断为感染，但无法确定哪一项指标异常，如果需要确诊，还要重新逐项检测。因此ELISA方法进行ToRCH诊断费时费力，另外，其灵敏度也有局限，实验中所用底物也是剧毒化学品，对实验人员造成威胁。
发明内容
本发明的目的在于把ToRCH五项指标的抗原同时点阵于一张玻璃片上，仅仅通过一次反应即可得到多种指标的逐项反应结果，因而大大提高检测的速度和效率。
本发明采用了以下两项专利的技术：用于免疫分析的蛋白质芯片(申请号：01105795.5)；多样品微阵列生物芯片(申请号：01112783.X)。利用高速全自动点样机器人把ToRCH五项指标的抗原以及阳性对照、阴性对照点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内，蛋白质通过化学键连接于固相载体(经戊二醛活化的玻璃)上而被固定，多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述五项指标的抗原。
ToRCH五项指标分别为弓形虫、风疹、巨细胞病毒、单纯疱疹病(1型和2型)；在固相载体上点阵的抗原为纯化的上述寄生虫或病毒的特征性抗原。阴性对照采用牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)，阳性对照采用人类免疫球蛋白G或M(IgG/IgM)，
将病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的二抗，在测血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在测血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗。洗去未结合的二抗，样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。用这种蛋白质芯片可以分别检测到血清中针对ToRCH五项指标的IgG和IgM。
用于产前诊断的蛋白质芯片的制造方法：(1)根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片，确定每个样品对应的检测IgG和IgM的腔室，作好记号，并确定点阵的排列方式和点样位置；(2)点样针从多孔板取出蛋白质样品(各项指标的抗原)后直接高密度点印于醛基化的玻璃片上；(3)室温过夜或37℃温育1小时，使蛋白质的氨基和玻璃片上的醛基发生缩合反应，以固定样品；(4)利用制作蛋白质芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
用于产前诊断的蛋白质芯片的使用方法：(1)在点好样的芯片上滴加病人血清样品，37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；(2)用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，室温晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗净晾干；(4)滴加以封阻液稀释过的荧光标记二抗，在测血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在测血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；(5)37℃避光温育30分钟。洗净并室温晾干；(6)反应结束后，对芯片进行读取和分析。
由于采用了多样品微阵列生物芯片技术，可以同时检测多个人份的ToRCH指标。
本发明实现了把ToRCH五项指标的抗原同时点阵于一张玻璃片上，仅仅通过一次反应即可得到多种指标的逐项反应结果，因而大大提高了检测的速度和效率；灵敏度比传统方法提高了约5-10倍；秉承了传统ELISA方法的高度特异性，检测结果稳定，可靠性高；工艺简单，操作安全，不仅效率高而且降低了成本，从而使诊断费用降低，实用性强。
附图说明
图1用本发明可分别检测到血清中针对ToRCH五项指标的IgG和IgM原理图。
图2多样品微阵列生物芯片外观图。
图3点样阵列图。
图4该病人风疹感染图示。
图5该病人CMV急性感染图示。
具体实施方式
如图1用本发明可分别检测到血清中针对ToRCH五项指标的IgG和IgM原理图，图2多样品微阵列生物芯片外观图，图3点样阵列图所示，用于产前诊断的蛋白质芯片，是将纯化的弓形虫、风疹、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒(包括1型和2型)五项指标的特征性抗原以及阳性对照、阴性对照点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内，蛋白质通过化学键连接于固相载体上而被固定，多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述五项指标的抗原。其中，阴性对照采用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，阳性对照采用人类免疫球蛋白G或M(IgG/IgM)。
如图1，将病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的被测抗体分别与固定在芯片上的相对应的固相抗原结合，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的二抗，在测血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在测血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；洗去未结合的二抗，样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。
本发明用于产前诊断的蛋白质芯片的制造方法：(1)根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片，确定每个样品对应的检测IgG和IgM的腔室，作好记号，并确定点阵的排列方式和点样位置；(2)点样针从多孔板取出蛋白质样品(各项指标的抗原)后直接高密度点印于醛基化的玻璃片上；(3)室温过夜或37℃温育1小时，使蛋白质的氨基和玻璃片上的醛基发生缩合反应，以固定样品；(4)利用制作蛋白质芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
用于产前诊断的蛋白质芯片的使用方法：(1)在点好样的芯片上滴加病人血清样品，37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；(2)用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，室温晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗净晾干；(4)滴加以封阻液稀释过的荧光标记二抗，在测血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在测血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；(5)37℃避光温育30分钟，洗净并室温晾干；(6)反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。
本实施例采用1×2的微阵列生物芯片，外观如图2所示，对某病人进行ToRCH检查，在两个腔室内同时按图3点样，检测后该病人风疹抗体IgG阳性，如图4所示，表明该病人曾经感染过风疹；CMV抗体IgM阳性，如图5所示，表明该病人处于CMV急性感染期。
使用本发明进行检测，具有省时、省力，准确度高的特点。
Claims (6)
1.一种用于产前诊断的蛋白质芯片，其特征在于将弓形虫、风疹、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒五项指标的抗原以及阳性对照、阴性对照点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内，蛋白质通过化学键连接于固相载体上而被固定，多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述五项指标的抗原。
2.根据权利要求1所述的用于产前诊断的蛋白质芯片，其特征在于所述在固相载体上点阵的抗原为纯化的上述寄生虫或病毒的特征性抗原。
3.根据权利要求1、2所述的用于产前诊断的蛋白质芯片，其特征在于阴性对照采用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，阳性对照采用人类免疫球蛋白G或M(IgG/IgM)。
4.用于产前诊断的蛋白质芯片的用途，其特征在于将病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的二抗，在测血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在测血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；洗去未结合的二抗，样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。
5.用于产前诊断的蛋白质芯片的制造方法，其特征在于：(1)根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片，确定每个样品对应的检测IgG和IgM的腔室，作好记号，并确定点阵的排列方式和点样位置；(2)点样针从多孔板取出蛋白质样品(各项指标的抗原)后直接高密度点印于醛基化的玻璃片上；(3)室温过夜或37℃温育1小时，使蛋白质的氨基和玻璃片上的醛基发生缩合反应，以固定样品；(4)利用制作蛋白质芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
6.用于产前诊断的蛋白质芯片的使用方法，其特征在于：(1)在点好样的芯片上滴加病人血清样品，37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；(2)用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，室温晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗净晾干；(4)滴加以封阻液稀释过的荧光标记二抗，在测血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在测血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；(5)37℃避光温育30分钟，洗净并室温晾干；(6)反应结束后，对芯片进行读取和分析。
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