JP2004532404A - 多数のアナライトを検出するための装置および方法 - Google Patents

多数のアナライトを検出するための装置および方法 Download PDF

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Abstract

少なくとも1つのサンプルにおける多数のアナライトの検出のための装置が提供される。装置は、テスト表面を備えた固体基板を含む。テスト表面には、少なくとも1つのアレイの離散したテスト部位を含む少なくとも1つの反応領域が規定される。これらのテスト部位の各々にはテスト分子が固定され、異なったテスト部位は異なったテスト分子を固定される。仕切りが固体基板に装着するために設けられる。仕切りは装着表面に複数の穴を含む。装着表面は、固体装置のテスト表面と相補であり、これら2つの部品が装着された場合に各穴がテスト表面の一部と接合して複数の漏れが防止されたチャンバを作るように、リバーシブルな装着に対して適合される。チャンバ内のテスト表面は、チャンバ内に露出する複数のテスト部位を含む。各チャンバは好ましくは、チャンバに導入される流体がテストのために露出したテスト部位に接触し得るように外部からアクセス可能である開口部を設けられる。この発明の別の局面においては、同じサンプル中の多数のアナライトを分析するための方法が提供される。

Description

【技術分野】
【0001】
発明の分野
この発明は、サンプル中の1つ以上のアナライトを検出するための、および/または定量化するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
さまざまな疾病および人体の症状を検出するための、診断用テスト装置が多くの論文および特許文献に記載されている。治療および診断の発展とともに、疾病症状の早期診断のために人体の健康状態を観察することが、ますます重要になった。同じサンプル中の異なったアナライトをテストできる機能は、多くの者が追求している目標である。理想的には、必要な試薬および人的資源を節約するために、単一のテスト装置を用いた単一のサンプルを分析するための方法が、多数のアナライトについての診断用情報をもたらすべきである。
【0003】
ウーデンバーグ(Woudenberg)他の特許文献1は、1つ以上のサンプルアナライトの存在または不在についてサンプルを同時にテストするための方法および装置に向けられる。装置は、一連のチャンバを有し、かつ各チャンバがアナライトと反応するのに有効である特定の試薬を有する、サンプル分配ネットワークを規定する基板を有すると記載される。上述のシステムを用いて多数のアナライトを分析し得るかもしれないが、装置はこのために特に固体の基板が製造されることが必要になるであろういくつものチャンバおよび溝を有する。
【0004】
フィツジェラルド(Fitzgerald)他の特許文献2は、基板と多数の離散した反応部位とがリガンドで共有結合される、多数のアナライトアッセイを行なう固体状態の装置を記載する。この出願は、分析されるべきサンプルを収容するためのさまざまな溝およびチャンバを備えた装置を開示する。この発明はさらに、多数のアナライトを有するフォーマットにおける異なったアナライトを同時に検出するための統合された分析システムを提供する。
【0005】
上述のシステムはサンプルから多数のアナライトを分析することが可能であるが、装置を製造するためのおよびサンプルをテストするためのコストを削減する改良されたシステムを提供する必要性が引き続き存在する。また、サンプルおよび試薬の量を減じる必要性もある。
【特許文献1】
米国特許第6126899号明細書
【特許文献2】
欧州特許出願第EP0874242号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従って、この発明の目的は、多数のアナライトに対する改良された診断システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
発明の要約
この発明の一局面に従うと、少なくとも1つのサンプルにおける多数のアナライトを検出するための装置が提供される。装置は、テスト表面を備えた固体基板を含む。テスト表面上には、少なくとも1アレイの離散テスト部位を含む少なくとも1つの反応領域が規定される。これらの各テスト部位上にはテスト分子が固定され、異なったテスト部位上には異なったテスト分子が固定され得る。固体基板に装着するための仕切りが設けられる。仕切りは、装着表面に設けられる複数の穴を含む。装着表面は、固体装置のテスト表面と相補なものであり、かつ2つの部品が組み立てられたときに各穴がテスト表面の部分と接合して複数の漏れが防止されたチャンバを作るように、リバーシブルにテスト表面に装着されるよう適合される。チャンバ内のテスト表面は、チャンバ内に露出する複数のテスト部位を含む。各チャンバは、好ましくはチャンバに導入される流体がテストのために露出したテスト部位と接触するように、外部からアクセス可能である開口部を設けられる。
【0008】
好ましい実施の形態においては、チャンバは、底としての役割を果たす固体基板のテスト表面と、保持壁としての役割を果たす仕切りの一部とによって作られるウェルであり、それにより、複数のテスト部位がチャンバ内のウェルの底に露出する。
【0009】
この発明の別の局面においては、テスト分子は少なくとも1つのリガンドと少なくとも1つの抗体とからなる。同じサンプル内の対応の交差反応するアナライトの結合反応が同じ反応領域内で同時に達成されるように、リガンドは1つのテスト部位に固定され、抗体は同じチャンバ内の異なったテスト部位に固定される。
【0010】
この検出装置の好ましい実施の形態においては、固体基板は複数の反応領域が規定された平坦な頂部表面を備えたチップである。各テスト領域は、テスト分子が固定された少なくとも1アレイの離散テスト部位を含む。仕切りは、フレームによって規定される穴を有するシートであって、各穴は反応領域に対応する。シートのフレームは、チップの平坦表面との間に漏れが防止されたウェルが作られるように、チップの平坦表面とのリバーシブルな結合に対して適合される。結合は、これに限定されるものではないが、クリップおよびねじなどの機械的手段、ならびに、にかわおよび接着剤などの化学的手段を含むどのような従来の手段を用いて行われてもよい。各ウェル内に、チップの頂部表面の1つの反応領域はウェルの底を形成し、シートのフレームの対応の部分はウェルの間の仕切り壁を形成する。シートは、サンプル反応の後でシートを取り外してチップを結果読出および分析のために標準チップリーダに挿入できるよう、取り外し可能である。この好ましい実施の形態の1つの利点は、多くの標準チップリーダをテスト結果の分析のために用い得ることである。取り外し可能仕切りシートは、チップに装着されると、異なったサンプルの反応が生じ得るウェルのシステムを含む組み立てられた装置を形成する。ウェルの数は、ユーザの要件と、それに従って製作された必要な穴を備えた仕切りシートとに従って決定することができる。この発明は、標準チップフォーマットにおいて多数のアナライトおよびサンプルを検出するための真に多用途のバイオチップおよび方法を提供した。
【0011】
この発明の別の局面に従うと、同じサンプル内の多数のアナライトを分析するための方法が提供される。方法は、テスト表面上に、複数の離散した、および空間的に離れたテスト部位を規定するステップと、複数のテスト分子が固定されるように、1つのテスト分子を各テスト部位に固定するステップとを含む。次いで各テスト領域の周りの流体防止バリアが作られ、分析のためのサンプルが適切なテスト試薬とともに各テスト領域に加えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
詳細な説明
ここでの定義では、サンプルは、これらに限定するものではないが、テストされるべきいかなるアナライトをも含む、いかなる溶液、混合物または生物学的流体をも含む。サンプルは、陽性対照血清と、陰性対照血清と、生物学的流体とを含む。漏れが防止されたチャンバは、流体の体積がチャンバのサイズで収容されるように適合されていれば、チャンバが漏れやこぼれなしに少なくとも1方向において流体を保持可能であることを意味する。漏れが防止されたチャンバは、封鎖された構造または開口部を備えた構造を含む。リガンドは、抗体−抗原結合反応において抗体と反応可能であるいかなる抗原または分子、酵素−基板結合反応における基板、またはこれらに限定するものではないが、核酸、染色体断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、脂質、ポリペプチド、抗生物質、ステロイドおよび他の有機分子を含む、受容体によって認識され結合されることができる分子をも指す。
【0013】
この発明の好ましい実施の形態において、図1Aから図1Dを参照して、ガラススライド20からなるバイオチップには分離頂部仕切りシート22が設けられる。図1Bに示される仕切りシート22は、どのような不活性な物質からなってもよく、好ましくはプラスチック、メンブレン、ラテックス、セラミック、ゴム、樹脂、PVCまたはシリコンなどの可撓性材料からなる。穴22aが、フレーム22bが各穴の周りに形成されるように、仕切りシートに打抜かれる。するとフレーム22bは側壁としての役割を果たし、スライドの頂部表面は底としての役割を果たして、図1Dに示すように、それらの間にウェルまたはチャンバ24を形成する。頂部仕切りシートのサイズは、好ましくはスライドと同じ寸法であるか、または僅かに短く、ガラススライド20に直接にかわ付けされるように、下側ににかわを含む。好ましい実施の形態においては、にかわは頂部仕切りシートをガラススライドに装着させてそれらの間にウェル24を形成させるのに十分に強度がある。ウェルは、適切な量の流体が各ウェルに加えられた場合に流体が接合する領域を通って隣接するウェルに流れ込まないように、漏れを防止するべきである。にかわはまた、不活性であって、ユーザの都合で仕切りシートをスライドから取り外すことを可能にする材料からなるべきである。テスト部位の各アレイにおける行または列の数は、ユーザの必要性に応じてさまざまであり得る。仕切りシートの厚さは、各ウェルにおいて要求される反応の量に依存し、過度の実験を行なうことなく当業者が決定し得る。たとえば、シートは1〜3mm厚さであり得る。穴およびフレームは、ユーザの必要性に応じたどのようなサイズまたは形状でもあり得る。例示のために、内径が0.3cm×0.3cm〜0.4cm×0.6cm〜1.2cm×1.2cmの穴を用い得る。22bまたは34aなどの仕切り壁の幅は、0.15cmから0.6cmに渡り得る。従って穴の数もさまざまであってよく、たとえば1×2、2×3、3×10、3×5、2×5、3×8および4×8アレイフォーマットである。
【0014】
最も簡単な実施の形態においては、単一のテスト分子が、特定のウェルに対応するガラススライドの1つのテスト領域20aに固定され得る。たとえば、図1Bにおいて、穴H1の位置は、図1Aに示されるテスト領域TA1の位置に対応するであろう。頂部仕切りシートがスライド20上に装着されてにかわ付けされた場合に、ウェルW1が形成され、そのウェルの底が図1Cに示すテスト領域TA1に対応するように、1つのテスト分子がテスト領域TA1上に固定される。この特定の例においてはテスト分子は1つしかなく、従って各テスト領域内には1つのテスト部位しかない。図1Eに示すように任意のカバーシート21もまた、結合反応のインキュベーションの間に溶液を覆って蒸発、こぼれまたは汚染を防ぐために仕切りの外側表面上に置くことができる蓋として設けられる。するとカバーシートは、ユーザの必要に応じて取り除くことができる。カバーシートは仕切りのために用いられる材料などの、どのような不活性材料から作られてもよい。例は、ポリエステルフィルムである。
【0015】
別の実施の形態においては、複数のテスト分子が各チャンバまたはウェル内に見出されるように、複数のテスト部位が各テスト領域に規定される。まず図2Aを参照して、この発明に従った別のガラススライド29がその上に2つのテスト領域を規定されて示される。各テスト領域は、点線の矩形として示される。各テスト領域内にあるのは、3×3アレイに規定されて円形で示されるテスト部位32である。図2Bは、2つのより大きな穴36が打ち抜かれた相補的仕切りシート34を示す。シートの残りはフレーム34aを形成する。図2Cおよび図2Dは、2つの大きなウェル40が仕切り34とガラススライド29との間に形成された、この発明のこの実施の形態に従った組立てられた装置を示す。示される図から、この特定の例において、最大9つの異なったテスト分子を同じテスト領域に固定することができ、このフォーマットを用いて多数のアナライトを検出し得ることが明らかである。
【0016】
図3Aは、一方のテスト領域41(1つのチャンバの底に対応)が9アレイの4×4テスト部位を含む、この発明の別の実施の形態を示す。図示をわかりやすくするために、他方のテスト領域および固体装置は図示しない。同様の種類の異なったチャンバまたはテスト領域がユーザの要件に応じて規定され得ることが明らかである。さらに、同じテスト表面上の異なったテスト領域が異なったテスト部位配置を有してもよい。この例においては、白抜き円42はアッセイ分子が固定されたテスト部位を規定する一方、塗りつぶし円44は陽性対照分子が固定された陽性対照部位である。点線円46は陰性対照が固定されたテスト部位を規定する。陽性対照分子はサンプル中に存在することがわかっているアナライトと反応することが期待される一方、陰性の方はサンプル中のどのアナライトとも反応することが期待されないテスト分子を含む。アッセイ分子は、サンプル中未知のレベルでアナライト(説明をわかりやすくするためにアッセイアナライトと称する)と交差反応するものである。アッセイアナライトは診断用テストの対象である。この例のこの単一のテスト領域(すなわち単一ウェル)は、3行の4×4アレイのテスト部位(行AからC)および3列の4×4アレイのテスト部位(列AからC)を含む。アレイA1、A2、A3、B1、B2、B3およびC1は同一である。陽性対照およびアッセイ分子は補間的な位置に配置される。陰性対照はアレイC2およびC3のテスト部位に固定される。ウェル41の全体が、すべてのテスト部位に対する反応が同時に、かつ同じ反応領域内で生じるように、1つのサンプルを受けるように適合される。こうしてこの例においては、3つの異なったテスト分子が、分析のために同じテスト領域に固定される。さらに、テスト分子ごとにテスト部位を多数繰返すことは、極めて正確な検出を行なうことを可能にする。
【0017】
上述の例はアレイA1、A2、A3、B1、B2、B3およびC3に同じ3つのアッセイ分子が同一のフォーマットで配置されるのを示すが、異なったアッセイ分子が同じ反応領域におけるこれらのアレイの各々に固定されてもよいことは明らかである。たとえば、1つのアッセイ分子(たとえば陽性対照分子)がアレイA1の8つの反応部位に固定される一方、第2のおよび異なったアッセイ分子(たとえば陰性アッセイ分子)がアレイB3の8つの反応部位に固定されてもよい。さらに、所望のレベルの精度をもたらすために要求される重複の数に依存して、さまざまな異なったアッセイ分子がこれらの7つのアレイに固定されてもよいことは明らかである。
【0018】
図3Bは、1つのウェルまたはチャンバに対応するテスト領域48が、4つの四半分に囲まれる中心行および中心列を有する9×9アレイを含む、この発明の別の実施の形態を示す。陰性対照54は中心列および中心行に沿って「十字(cross)」または十字型(cruciform)構成に固定される一方、陽性対照50およびアッセイ分子52は4つの四半分内に補間的な位置で配置される。このフォーマットを使用すれば、陰性対照が期待通りに無のまたは低い信号を生じる成功した実験例においては、4つの四半分がはっきりと解明されることは明らかである。こうして、このフォーマットには、簡単な目視検査によってさえも明らかで曖昧さのない結果をもたらす利点がある。
【0019】
以下の実施例は、この発明のさまざまな特定の実施の形態を示し、本発明を実施し使用することを当業者に教示することを意味するものである。これらの実施例は例示のみを意味し、前掲の特許請求の範囲を限定することを意図しない。以下の実施例においては、テスト分子はプローブまたはマーカーとも称する。テスト領域はしばしば、グリッドと称し、テスト部位はサブグリッドと称する。
【0020】
実施例1
リガンドをテスト部位に固定する方法
マイクロアレイヤーによって微小サイズの固体基板上に予め定められたグリッドおよびサブグリッドパターンでプローブをプリントおよび固定することにより、タンパク質チップを調製した。プローブは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの形の抗原であっても抗体であってもよく、テストサンプル中のターゲットタンパク質に結合することが可能である。マイクロ固体基板はガラス顕微鏡スライド由来物、ニトロセルロースメンブレン、またはシリカであり得る。ガラス基板の1cm×1cm面積ごとに2390個のタンパク質スポットをプリントし得る。反応において用いられたサンプルは、プラズマ、血清、血液または他の体液の形であり得る。全反応工程は固体基板上でそのままの場所で行なわれる。
【0021】
バイオチップの作製:
1.適切な希釈溶液中のプローブを、ソースプレートとしても公知であるマイクロタイタープレートの個々のウェルに加える。
【0022】
2.ソースプレートをロボットマイクロアレイヤー(米国カリフォルニア州Cartesian TechnologyのProsys4510)の適切なスロットに置く。
【0023】
3.ソフトウェアがマイクロアレイピンを制御してソースプレートからサンプルを引出す。
【0024】
4.スライドの表面にサンプルを満たしたピンを置くことにより、顕微鏡スライド由来物上にサンプルがプリントされる。
【0025】
5.プリントされたバイオチップを37℃で1時間インキュベートしてタンパク質プローブを基板表面に固定する。
【0026】
6.基板の残りの表面をTBS緩衝剤(0.02M Tris−HCl、0.137M NaCl、pH7.6)中のウシ血清アルブミン(BSA)およびTween 20によって37℃で1時間ブロックする。
【0027】
7.二回蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させる。
【0028】
8.バイオチップを0.3%水酸化ホウ素ナトリウム(NaBH)で37℃で5〜10分間インキュベートし、ガラス表面の遊離アルデヒド基を減じる。
【0029】
9.二回蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させる。
【0030】
10.作製されたバイオチップを4℃の暗所で密封する。
【0031】
装置の組立て方法:
1.マルチチャンバプラスチック装置(仕切りシート)を作るためのプラスチック材料の外側寸法は、固体基板の外側寸法と一致するべきである。
【0032】
2.装置ごとのチャンバの数は1×2から4×10の範囲にわたり得る。
【0033】
3.2つの隣接するチャンバの各々の中心間の距離は、4.5mmの倍数であり、これは384および96マイクロタイタープレートのジオメトリ、マイクロアレイのピンヘッドのピン距離およびマルチチャネルピペットマンと一致する。
【0034】
4.各チャンバの深さを決定するプラスチックの厚さは少なくとも1mmであるべきで、1〜3mmの範囲にわたり得る。
【0035】
5.マルチチャンバプラスチック装置の一方は粘着性があるべきで、固体基板にしっかりと接着することができ、反応のための漏れが防止されたウェルを形成する。そのような装置は、水性溶液に浸され水圧下で用いられた場合に、耐水性があり、漏れが防止され、剛性があり、かつ不活性であるべきである。
【0036】
6.タンパク質プローブは、多数のマーカー、多数の標本の用途のためのバイオチップ作製のために、各チャンバ上にマイクロアレイ化される。
【0037】
7.マルチチャンバプラスチック装置の外側寸法と一致するサイズであり、片側に接着部を備えるポリエステルフィルムを、任意でマルチチャンババイオチップを覆うために用いて、ウェルで隔離され封鎖された反応のためのチャンバを形成する。
【0038】
8.マルチチャンババイオチップにおける完全なセットアップは−40°〜95℃の反応温度、UV処理に耐えることができ、耐水性がある。
【0039】
9.ポリエステルフィルムとマルチチャンバ装置のプラスチックとの間の結合は、装置と固体基板との間の結合よりも弱いべきである。各反応ステップにおけるフィルムの除去は、マルチチャンババイオチップの構造を変更してはならない。
【0040】
10.反応が完了すると、従来のマイクロアレイスキャナ(Scanarray4000、Packard Bioscience(現在はPerkinElmer Life Sciences)、米国コネティカット州)で分析するために、プラスチック装置を固体基板からはずし得る。タンパク質の固体基板への固定は、物理的相互作用、たとえば帯電により(たとえば負に帯電したタンパク質が正に帯電したメンブレンまたは正に帯電した金属表面と結合する)、疎水性相互作用により(疎水性タンパク質が疎水性メンブレンと結合する)、滞留により(ある大きさのタンパク質が、メンブレンのまたはゲルタイプの基板などの多孔性基板によって妨げられる)、または化学相互作用(たとえば、エポキシスライド、シラン化スライド、シリル化スライドとの結合)により達成されてもよい。
【0041】
実施例2
バイオチップ上に固定された交差反応抗原を用いたヒト血清中の抗体を検出する方法
反応および検出:
1.バイオチップをパッケージから取出す。
【0042】
2.テストサンプル(患者サンプル、陽性および陰性血清対照)を別々に、バイオチップ内の個々のチャンバに加え、37℃で1時間反応させる。
【0043】
3.結合していない反応物をPBSまたはTBSなどのナトリウム塩を含む洗浄緩衝剤で洗浄する(PBS:0.137M NaCl、0.027M KCl、0.0043M NaHPO・7H0、0.0014M KHPO、pH7.3)(TBS:0.002M Tris−Cl、0.137M NaCl、pH7.6)。
【0044】
4.余分な緩衝剤を除去して5分間室温で乾燥させる。
【0045】
5.ブロック溶液(TBSまたはPBS中の1%ウシ血清アルブミン)をバイオチップに加える。
【0046】
6.バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【0047】
7.蛍光標識した化合物(二次抗体または抗原)をブロック溶液で希釈し、バイオチップに加えて37℃で0.5時間インキュベートする。
【0048】
8.洗浄してバイオチップから仕切りシートを取り除き、遠心脱水する。
【0049】
9.画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの蛍光強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【0050】
別の実施の形態においては、上述のステップ7〜9は、以下のステップ7a〜13aに置きかえられる。
【0051】
7a.ビオチン結合二次抗体をブロック溶液で希釈し、バイオチップに加えて37℃で0.5時間インキュベートする。
【0052】
8a.バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【0053】
9a.ブロック溶液中のストレプトアビジン分子を加えて37℃で0.5時間インキュベートする。
【0054】
10a.洗浄して乾燥させる。
【0055】
11a.ブロック溶液で蛍光化合物(ビオチンまたは抗ストレプトアビジン抗体)を希釈して37℃で0.5時間インキュベートする。
【0056】
12a.洗浄してバイオチップから仕切りシートを取り除き、遠心脱水する。
【0057】
13a.画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの蛍光強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【0058】
実施例3
交差反応抗体を固定したチップを用いた抗原の検出方法
反応および検出:
1.バイオチップをパッケージから取出す。
【0059】
2.テストサンプル(患者血清、陽性および陰性血清対照)をバイオチップに加え、37℃で1時間反応させる。
【0060】
3.結合していない反応物をPBSまたはTBSなどのナトリウム塩を含む洗浄緩衝剤で洗浄する(PBS:0.137M NaCl、0.027M KCl、0.0043M NaHPO・7H0、0.0014M KHPO、pH7.3)(TBS:0.002M Tris−Cl、0.137M NaCl、pH7.6)。
【0061】
4.余分な緩衝剤を除去して5分間室温で軽く乾燥させる。
【0062】
5.ブロック溶液(TBSまたはPBS中の1%ウシ血清アルブミン)をバイオチップに加える。
【0063】
6.バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【0064】
7.ブロック溶液で希釈した2番目の一次抗体をバイオチップに加えて37℃で0.5時間インキュベートする。
【0065】
8.洗浄し、遠心脱水して再びブロックする。
【0066】
9.ブロック溶液で希釈したアルカリホスファターゼ(AP)またはホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgG抗体(二次抗体)を加えて37℃で0.5時間インキュベートする。
【0067】
10.適切な化学ルミネセンス基板(ICN Biomedicals Inc(米国カリフォルニア州)のHRPのためのルミノール、または、Pierce Chemical Company(米国イリノイ州)のAPのための1,2−ジオキセタン系基板)を加えて室温で1分間インキュベートする(製造元のマニュアルに従う)。
【0068】
11.画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの化学ルミネセンス強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【0069】
実施例4A
ヒト血清中の肝炎の診断
この実施の形態は、タンパク質チップの作製と、肝炎ウイルス感染によって引き起こされる急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、および肝臓ガンの診断における、その適用とを含む。
【0070】
A型肝炎感染診断のためのマーカーは、A型肝炎抗体(抗HAV IgGまたはIgMAb)であり;B型肝炎についてはB型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎「e」抗原(HBeAg)、B型肝炎表面抗体(HBsAb)、B型肝炎「e」抗体(HBeAb)、および肝炎コア抗体(HBcAb)であり;C型肝炎についてはC型肝炎抗体(抗HCV IgGまたはIgM)であり;D型肝炎についてはD型肝炎抗体(抗HDV IgGまたはIgM)であり;E型肝炎についてはE型肝炎抗体(抗HEV IgGまたはIgM)である。α−フェトプロテイン(AFP)は、肝臓ガン診断のためにバイオチップに含めるマーカーである。これらのマーカーに特異に反応し得るプローブまたはテスト分子を、バイオチップ作製の間に固体基板にプリントする。
【0071】
テスト領域の例を図4A、図4B、図4C、図4D、および図4Eに示す。この例はデータ分析のために同じチップ(図4A)上の2つのテスト領域56および58に設けられる多数の繰返しを用いることを示す。これらのテスト領域は、このバイオチップ上にサンプル導入のために2つの対応する穴を備えた適切な仕切りが置かれた場合に、2つのウェルの底としての役割を果たす。この配置の利点は、以下の図面の説明から明らかとなるであろう。各テスト分子を多く繰返すと、データ分析における信頼性を高めデータ収集の間の地理的および機械ばらつきを最小化するので、各バイオチップ実験における精度を高める。さらに、以下に示す明確なパターンは,高密度アレイにおけるスポットの識別を容易にする。
【0072】
この実施例においては、このバイオチップ上に規定される2つのテスト領域またはグリッド56および58がある。グリッドまたはテスト領域56はテスト部位の7つのサブグリッドまたはアレイ56aを含む。各サブグリッド56a内に、陽性対照およびアッセイ分子がアレイ構成になるよう多数繰返されて固定される。点線56bは陰性対照が規定される多数のテスト部位の位置を表す。
【0073】
図4Bを参照して、テスト領域またはグリッド56がより詳細に示される。点線円62は陰性対照を表すが、これは各サブグリッドの境界を描く行および列をわたって多数繰返してスポットされるのが見出される。各サブグリッドにおいて、陽性対照60およびテスト分子(肝炎抗原の1つ)が固定される。各サブグリッドに固定されるテスト分子は異なった肝炎ウイルス抗原である。
【0074】
たとえば、アレイA1には、ヒトIgGを陽性対照60とした、4×4配置の16個のテスト部位があり;テスト分子A型肝炎抗原(HAV Ag)64が補間的に配置されて固定される。他の6個のアレイ(A2−A7)が示されるが、固定されるテスト分子のみが異なる(HAV抗原64、HCV抗原66、HDV抗原68、HBs抗原70、HBeAg72、HB抗原74、およびHEV抗原76が、それぞれサブグリッドA1〜A7に固定される)。
【0075】
図4Cに示されるテスト領域58を参照すると、この領域のテスト部位配置はテスト領域56とは異なる。テスト領域58においては、陰性対照は図4Aの線58aに沿ってテスト領域の中心を横切る十字形構成に配置される多数のテスト部位に固定される。陰性対照テスト部位の十字形構成は、テスト領域を4つの四半分に分割する。4つの他のアレイまたはサブグリッド(B1〜B4)がその周りに設けられる。図4Cに示すアレイB1内には、陽性対照B型肝炎表面抗原60aおよびテスト分子抗B型肝炎表面抗原抗体(HBsAb)78は補間的関係で別々の離散した16個のテスト部位に固定される。他の3つの四半分(B2〜B4)はそれぞれ、陽性対照B型肝炎BeAg60bおよび抗B型肝炎「e」抗体80と、陽性対照AFP60cおよび抗AFP抗体82と、陽性対照D型肝炎ウイルス抗原60dおよび抗D型肝炎ウイルス抗体84とを含む。
【0076】
結合反応のための方法
表1は、バイオチップ上のテスト分子ごとのスポット条件を示す。第2欄は、スポットのために用いられたタンパク質溶液の濃度を示し、第3欄は各スポットの推定サイズを示す。各テスト部位に実際に固定されたタンパク質の量は、各反応部位に半球状スポットが与えられたと仮定して推定される。全スポットを乾燥させて、ほとんどのタンパク質がテスト部位の表面に固定されたと考えられる。
【0077】
【表1】
Figure 2004532404
【0078】
結合反応中に、患者の血清をそれぞれ実施例2および実施例3に説明した方法と同様の方法を用いてチャンバ56および58に加えた。この実施例においては、バイオチップには2つのテスト領域しか示されず、一方は肝炎抗体をテストするものであり、他方は血清中の肝炎抗原の存在をテストするものであるから、1つのテスト血清だけをテストできる。陽性および陰性対照血清などの他のテスト血清を、2つの別々で同様のバイオチップに与えて陰性および陽性結果を得ることができる。反応が完了した後で、チップをスキャンして各スポットからの蛍光信号強度を記録する。
【0079】
実施例4B
多数のウェルを用いたヒト血清中の肝炎の診断
この実施例は、どのように実施例4Aに説明したシステムを多数のウェルを含むバイオチップの使用に適合して、同じバイオチップでテストされ得るサンプルの数を増大させるかを示す。この実施例においては、図1Aに示すもののような3行および8列のアレイが患者の肝炎の診断に用いられる。説明を容易にするために、テスト領域の行を上から下に向かって行A、B、Cと称し、テスト領域の列をそれぞれ行1〜8と称する。この実施例においては、バイオチップの列1〜4内の12個のテスト領域は、図4Bのテスト領域56に示すものと同一のテスト部位を含む。列5〜8内の12個のテスト領域は各々が図4Cのテスト領域58に見出されるものと同一のテスト部位のアレイを含む。この配置を用いて、血清中の肝炎抗原の診断のために、合計12個のテスト領域(すなわちウェル)があることが明らかにわかる。この実施例においては、既知の肝炎感染の患者から得られた陽性対照血清がテスト領域A1に加えられる。肝炎に感染していない健康な個人から得た陰性対照血清がウェルB1において診断的反応のために用いられる。残りの10個のウェル(ウェルA2〜A4、B2〜B4、およびC1〜C4)は肝炎抗原の存在が未知である患者の血清をテストするために用い得る。同様の態様で、陽性対照血清をウェルA5で用いて肝炎抗体に対する陽性対照を提供する一方、陰性対照血清をウェルB5に加え得る。残りのウェル(A6〜A8、B6〜B8、およびC5〜C8)は、未知の血清をテストするために用い得る。用いられる結合反応と検出システムは、実施例4Aで説明したものと同様である。
【0080】
結果分析の方法
R値=95%ガウス分布内に入るテストプローブの信号強度の平均値を、同じサブグリッド内の陽性対照プローブのもので除算したもの。
【0081】
テストチャンバにおけるテストサンプルからのR値はRsである。
【0082】
陽性参照チャンバにおける陽性対照サンプルからのR値はRpである。
【0083】
陰性参照チャンバにおける陰性対照サンプルからのR値はRnである。
【0084】
Rco=1/2(Rn+Rp)である。
【0085】
データを解釈する3つのアプローチがある。
【0086】
a.方法I:Rsが0.05よりも大きい個々のサンプルがテストプローブに対して陽性であると規定される;0.02と0.05との間のRsはボーダーラインであり、テストを繰返すべきである;0.02よりも小さなものは陰性である。
【0087】
b.方法II:Rs/Rnが2.1よりも大きい個々のサンプルが陽性であると規定され、1.5と2.1との間のRs/Rnはボーダーラインであり;1.5よりも小さなRs/Rnは陰性である。
【0088】
c.方法III:Rcoよりも大きいRsの個々のテストサンプルが陽性であり;Rcoよりも小さなものが陰性である。
【0089】
この発明は、チャンバ内の、および同じチップにわたるチャンバ間のデータ比較を容易にする。マイクロアレイおよびデータ操作方法においてこの設計を用いることにより、信号強度に影響を与える恐れのある地理的ばらつきは最小化される。
【0090】
上述の方法を採用して、中国国家薬品監督管理局(SDA)から肝炎標準血清を得て、本件に従った方法および装置の精度および感度を調べるためにテスト血清として用いた。
【0091】
中国における診断キットの精度および精密度を確実にするために、SDAは感度および特異度の標準を設定している。感度テストは、診断キットの最も弱い反応範囲を設定する。この発明に従った方法は、100%の精度で感度テストに合格した。表2の第2欄は、中国国家薬品監督管理局から、臨床用途で中国で登録されているすべての診断キットの感度を調べるために用いなければならない参照サンプルとして提供されたサンプルを示す。HbsAgおよびHbsAbについては、1ng/mlおよび10mIU/mlの参照標準をそれぞれ用いた。
【0092】
【表2】
Figure 2004532404
【0093】
1.SDA標準パネルキットロット番号9909
2.HbsAG(B型肝炎表面抗原);3.HBsAb(B型肝炎表面抗原に対する抗体);4.HBeAg(B型肝炎「e」抗原);5.HbeAb(B型肝炎「e」抗原に対する抗体);6.HbcAb(B型肝炎コア抗原に対する抗体)。
【0094】
【表3】
Figure 2004532404
【0095】
1.SDA標準パネルキットロット番号9909
2.HbsAG(B型肝炎表面抗原);3.HbsAb(B型肝炎表面抗原に対する抗体);4.HBeAg(B型肝炎「e」抗原);5.HbeAb(B型肝炎「e」抗原に対する抗体);6.HbcAb(B型肝炎コア抗原に対する抗体)。
【0096】
上述のこれらの3つの方法を用いた結果をその次の3つの欄に示す。HbeAg、HbeAbおよびHbcAbについては、3つの別々の未知のサンプルがSDAにより提供され、第2欄に示すように血清を希釈するためにさまざまな希釈剤を用いた(HbeAgについてはサンプル番号1、2および3;HbeAbについては番号55、57および61;HbcAbについては番号2、3および4)。結合反応後の蛍光強度検出の結果を、次の対応の欄に示す。
【0097】
表3は、SDAによって要求される特異度テストの結果を示す。これらのテストにおいて、第1欄に示すように、それぞれの抗原または抗体をテストするためにSDAにより陰性血清が提供された。結果をその次のいくつかの欄に示す。第2欄において、分数の分母はSDAによって提供されたサンプルの数を示し、比の分子は陰性と判定されたサンプルの数を示す。SDA要件に従うと、偽陽性は許容できない。
【0098】
こうして、この発明に従った方法を用いると、特異度は極めて高く、さまざまな非特異性抗原または抗体を備えた患者の血清の間に交差反応はほとんどない。
【0099】
図4Dは、HAV感染患者の期待される結果の例である。陽性信号は、テスト領域56のみのテスト部位64および両方のテスト領域56および58のすべての陽性対照で記録される。そのような結果は、テスト血清抗体が他のテスト分子ではなくHAV Agに対して向けられ、テストの特異度が良好であることを示すであろう。
【0100】
図4Eは、HBV感染患者の期待される結果の例である。陽性信号がテスト領域56のテスト部位74およびテスト領域58のテスト部位78および80において;かつテスト領域56およびテスト領域58のすべての陽性対照において期待される。
【0101】
実施例5
妊娠患者の出産前テスト
この実施の形態は、出産前テスト目的での妊婦の血清をテストするために用いるべきバイオチップを説明する。集合的にToRCHとして公知であるトキソプラズマ、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ならびにI型およびII型単純ヘルペスウイルスについて、これらの疾病の罹患率が高い妊婦の検診が定期的に行なわれる。疾病は妊娠中または出産時に胎児に伝染し、新生児に重篤な障害をもたらす。これらの合併症のために、妊婦および妊娠可能年齢の女性の免疫状態を評価することは重要である。5つのToRCHマーカーについて特異的である抗原に対応するプローブならびに陽性および陰性対照が、上述のようにマルチチャンバチップの上にプリントされる。バイオチップは、それぞれのチャンバに蛍光標識した抗ヒトIgG抗体または蛍光標識した抗ヒトIgM抗体のいずれかを加えることにより、近接するチャンバにおいてIgGおよびIgMを同時に検出することを可能にする。ToRCH診断におけるIgMの検出は、疾病の早期診断を可能にするが、なぜならばIgMは感染の直後に生成する抗体である一方、IgGはより長いラグタイムの後で生成されるからである。しかしながらIgG標識は、感染症が治癒した後でさえもより長い期間に渡って高く留まる。よって、患者の血清中の高いレベルのIgMと低いレベルのIgGとの組合せは、進行中の急性感染症を示す。
【0102】
方法:
1.トキソプラズマから分離された抗原に対応するプローブ86、風疹ウイルス88、サイトメガロウイルス(CMV)90ならびに単純ヘルペスウイルスI型92およびII型94、ヒトIgG陽性対照96およびヒト血清アルブミン(HSA)陰性対照98を、3×3アレイにまたは図5Aに示すように配置されるテスト部位に繰返しプリントする。これらの異なったサブグリッドを、適切な仕切りを上に装着した場合に単一のウェルに見出される同じテスト領域100内に規定する。好ましい実施の形態においては、この実施例のバイオチップは図5Aに示すものと同一である8個のテスト領域を含む。2つのテストされた領域を陽性血清でのインキュベーションに用いる一方、他の2つを陰性対照血清のために用いる。すると、患者の血清をさらに2つ、このバイオチップで重複してテストし得る。
【0103】
2.実施例2に記載の通り、固定、乾燥、ブロック、反応、洗浄を行なう。
【0104】
3.血清中のToRCH IgGを検出するために、蛍光標識した抗ヒトIgG抗体を、上述のように血清でインキュベートしたウェルの1つに用いる。
【0105】
4.ToRCH IgMを検出するために、蛍光標識した抗ヒトIgM抗体をそれぞれの血清で以前にインキュベートしておいた重複ウェルに加える。
【0106】
5.図5Bは風疹ウイルス感染患者からの血清を用いたアッセイの実験結果を示す。陽性信号はテスト分子88および陽性対照96において検出可能であった。
【0107】
6.図5CはCMV感染患者の血清を用いたアッセイの実験結果を示す。陽性信号はテスト分子90および陽性対照96において検出可能であった。
【0108】
実施例6
汎用増幅システムとしてのストレプトアビジン/ビオチンシステムの使用
この実施の形態は、タンパク質チップ分析における増強された報告システムとして蛍光/酵素標識したストレプトアビジンおよびビオチン方法(FLSAB/ELSAB)を用いる。現在のタンパク質チップ技術においては、蛍光または酵素結合抗体が報告システムにおいて一般に用いられる。この実施の形態はこの報告システムに信号増幅ステップを導入する。この増幅システムを用いると、タンパク質チップの感度は10倍に増大する。従って、プリントにより少ない量のプローブを用い得る。これにより、バックグラウンドが低減され、信号対ノイズ比は向上し、偽陽性結果の可能性は最小化される。これは酸性タンパク質への蛍光染色標識における困難なステップを省略することをも容易にする。
【0109】
タンパク質チップの作製:
1.アルデヒドスライド、ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンなどの固体基板上にタンパク質プローブをアレイする。
【0110】
2.スライド上のタンパク質プローブを室温で一晩、または37℃で1時間乾燥させて固定する。
【0111】
3.ウシ血清アルブミン(BSA)およびTween20を含む緩衝剤で基板表面を37℃で1時間ブロックする。
【0112】
4.二回蒸留水で洗浄し、乾燥させて室温で保存する。
【0113】
方法:
1.標本サンプルをタンパク質チップの各チャンバに加えて37℃で1時間インキュベートする。
【0114】
2.余分な標本を洗浄緩衝剤で洗浄して、遠心脱水する。
【0115】
3.上述のようにチップをブロック緩衝剤でブロックして洗浄緩衝剤で洗浄する。
【0116】
4.洗浄して遠心脱水する。
【0117】
5.ターゲットマーカーに特異的に結合するビオチン結合生体分子をブロック緩衝剤で希釈して各チャンバに加え、37℃で30分間インキュベートする。
【0118】
6.洗浄して遠心脱水する。
【0119】
7.ストレプトアビジンをブロック緩衝剤で希釈してチップに加え、37℃で30分間インキュベートする。
【0120】
8.洗浄して遠心脱水する。
【0121】
9.ブロック緩衝剤で希釈した酵素アルカリペルオキシダーゼ(AP)またはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、または蛍光結合ビオチンをチップに加えて暗所で37℃で30分間インキュベートする。
【0122】
10.もし(9)で酵素結合ビオチンを用いるのであれば、適切な化学ルミネセンス基板である、Pierce Chemical Company(米国イリノイ州)のHRPのためのルミノール、または、ICN Biomedicals Inc(米国カリフォルニア州)の1,2−ジオキセタン系基板を加えて室温で1分間インキュベートする(製造元のマニュアルに従う)。完了した後で、チップを洗浄して仕切りシートを取り除き、チップを遠心脱水してマイクロアレイスキャナでスキャンする。
【0123】
実施例7
ガン診断のための方法および装置
この実施の形態は、ガンのための高いスループットおよび高感度の診断方法およびバイオチップを説明する。このチップは、ガンの早期診断を可能にすると同時に、ガンのタイプおよびサブタイプを判断する。プローブは、組織特異腫瘍マーカーに対応する抗体であり;陽性対照は対応の腫瘍マーカーである。ヒト血清アルブミンは陰性対照である。
【0124】
ガンチップは、臓器/組織タイプに従ってカテゴリ化される。ガンチップの各タイプは、組織特異腫瘍マーカーに反応する抗体のパネルからなる。各抗体パネル内の発現プロファイルはガンをさらにサブタイプに分類することを可能にする。たとえば、γ−GTI’、II、II’は肝臓ガンにしか見出されず;コンカナバリンA反応α−フェトプロテイン(R Con A AFP)は主に原発性肝臓ガンの血清サンプルに見出される一方、続発性肝臓ガン、性腺および性腺外胚細胞腫瘍においては顕著にR Con A AFPが低減し無反応型が増大した。従って、ガンバイオチップにおいて腫瘍マーカーのパネルを用いるとガンの診断ならびに、タイプおよびサブタイプの分類が容易になる。
【0125】
図6Aは、16アレイ(A1〜D4)のガンチップにおける1つのテスト領域を示す。各アレイは、同じテスト分子が固定された9個の離散したテスト部位を含む。アレイA1はテスト分子抗α−フェトプロテイン(AFP)抗体をプリントされ;A2は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ(γ−GT)アイソザイムI抗体をプリントされ;A3は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ(γ−GT)アイソザイムI’抗体をプリントされ;A4は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ(γ−GT)アイソザイムII抗体をプリントされ;B1は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ(γ−GT)アイソザイムII’抗体をプリントされ;B2は抗des-γカルボキシプロトロンビン(DPC)抗体をプリントされ;B3は抗α−L−フコシダーゼ抗体をプリントされ;B4は抗5’ヌクレオチドホスホジエステラーゼアイソザイムV抗体をプリントし;C1は抗グルタチオンS−トランスフェラーゼ胎盤型抗体をプリントし;C2は抗α−1−抗トリプシン抗体をプリントし;C3は抗フェリチン抗体をプリントし;C4は抗酸性イソフェリチン(AIF)抗体をプリントし;D1は抗B型肝炎表面抗原抗体をプリントし;D2およびD3は13種の腫瘍マーカーおよびヒトIgGに対応する陽性対照をプリントし;D4は陰性対照をプリントする。
【0126】
図6Bは肝臓ガン患者から得られる診断結果の種類の例を示し、たとえば、アレイA1、A3、A4、A5およびD1ならびに陽性対照D2およびD3において陽性信号が検出される。
【0127】
実施例9
自己免疫疾患の診断
自己免疫疾患は、患者の血清中に循環する高レベルのIgMおよびIgG自己抗体の存在によって特徴付けられる。自己免疫疾患には2つのカテゴリがある:単器官または細胞タイプ、および全身性タイプである。前者の例は、自己免疫性溶血性貧血(AIHA)、すなわちIgG自己抗体およびIgM抗体が高まり、体が自身の赤血球(RBC)を攻撃するもの;重症筋無力症、すなわちアセチルコリン受容体に対する自己抗体が高まり、患者が重篤な筋肉の弱化を被るもの;および橋本甲状腺炎、すなわち抗チログロブリン抗体および抗マイクロゾーム抗体が高まるもの、である。後者の例は、全身性エリテマトーデス(SLE)、すなわち抗核リボヌクレオタンパク質抗体(抗−dsDNAおよび抗SM)が検出されるもの;およびリウマチ様関節炎、すなわちリウマチ因子が検出されるもの、である。
【0128】
方法:
1.自己免疫タンパク質チップは患者の血清中の自己抗体を検出すべきものである。自己免疫疾患マーカーの抗原に対応するプローブを製作のためにマルチチャンバチップにプリントする。マーカーは抗核リボヌクレオタンパク質抗体、リウマチ因子、抗アセチルコリン受容体抗体、抗赤血球抗体、抗チログロブリン抗体および抗マイクロゾーム抗体である。
【0129】
図7Aに、自己免疫診断タンパク質チップの設計の例を示す。同じテスト領域(組立てられた装置の1つのウェルまたはチャンバを代表する)内に、9個の離散したアレイ(A1〜C3)を規定する。各アレイには、他のアレイとは互いに異なる1つのタイプの分子を固定する。同じアレイ内で、16個のテスト部位(4×4)は同一のテスト分子を含む。A1は二本鎖DNA分子をプリントし;A2はSMITH抗原をプリントし;A3はアセチルコリン受容体をプリントし;B1はチログロブリンをプリントし;B2はミクロゾーム抗原をプリントし;B3は異常IgGをプリントし;C1はヒトIgG陽性対照をプリントし;C2は陰性対照をプリントし;C3は赤血球をプリントする。SMITHはDNAを正しい形状に保つ助けをする、RNAおよび非ヒストン核タンパク質の複合体であり;細胞の溶解時にDNAとともに血流中に放出されるものであって、SLEのマーカーである。
【0130】
2.自己免疫タンパク質チップは、間接的な免疫に基づくアッセイである。患者の血清を個々のチャンバに加える。上述の実施例8に記載のように、IgMの検出と比較してIgGを検出するために、各血清を重複チャンバに加え得る。血清中の自己抗体は定常期プローブと反応する。洗浄後に、蛍光標識した抗ヒトIgG抗体をチャンバに加えて交差反応IgGを検出する。
【0131】
3.交差反応二価または多価IgMを検出するために、二重抗原サンドイッチ法をも自己免疫タンパク質チップに適用し得る。血清との反応後に、蛍光標識抗原を反応チャンバに加えて検出する。
【0132】
4.反応が完了した後で、バイオチップをマイクロアレイスキャナでスキャンする。
【0133】
図7Bに全身性エリテマトーデス患者の診断結果の例を示す。陽性信号がテスト部位A1およびA2、ならびに陽性対照部位C1に現れるであろう。
【0134】
図7Cにリューマチ様関節炎患者の診断結果の例を示す。陽性信号がテスト部位B3および陽性対照部位C1に現れるであろう。
【0135】
上述の特定の実施の形態についての詳細な説明は、例示および説明の目的で提供された。提供される教示に鑑みて多くの変形例および展開例が可能であるので、これは排他的であること、または開示される厳密な形に発明を限定することを意図しない。たとえば、図4Aから図4Cに示す配置は例示のためのみであって、同じバイオチップにより小さなテスト領域を規定し得ることは明らかである。展開例として、テスト領域56および58と同様のものを3つ同じチップに設けて、テスト血清ならびに陽性および陰性血清を同じバイオチップでテストできるようにしてもよい。さらに、対応する数の穴を備えた好適な仕切りとともにさらなるテスト領域をもバイオチップに規定して、多数の患者のサンプルを同じバイオチップ上でテストできるようにしてもよい。
【0136】
さらなる例として、患者の抗体プロファイルを分析することによる急性感染症の診断のために抗ヒトIgMおよび抗ヒトIgG抗体を用いることを、実施例5に開示されるものに加えて多くの疾病に適用し得る。
【図面の簡単な説明】
【0137】
【図1A】この発明の1つの実施の形態に従った、固体基板の頂部図である。
【図1B】同じ実施の形態に従った、図1Aに示す基板と相補な仕切りシートの頂部図である。
【図1C】図1Bに示す頂部仕切りシートが図1Aに示す基板に装着された、この発明に従った装置の頂部平面図である。
【図1D】図1Cの線A−Aに沿った断面図である。
【図1E】図1Cに示す装置をカバーするための、同じ実施の形態に従ったカバーシートの図である。
【図2A】この発明の第2の実施の形態に従った、基板の頂部図である。テスト部位の位置を点線円で示す。
【図2B】同じ実施の形態に従った、図2Aに示す基板と相補な仕切りシートの頂部図である。
【図2C】固体基板の頂部表面に仕切りシートが装着された、この発明の第2の実施の形態に従った組み立てられた装置の頂部図である。やはり、テスト部位の位置を点線円で示す。
【図2D】図2Cの線B−Bに沿った断面図である。
【図3A】この発明の第3の実施の形態に従ったテスト領域を示す図である。
【図3B】この発明の第4の実施の形態に従ったテスト領域を示す図である。
【図4A】1つの好ましい実施の形態に従った肝炎バイオチップの頂部図である。
【図4B】同じ好ましい実施の形態の、さまざまな肝炎抗体を検出するための肝炎タンパク質チップにおけるテスト領域の図である。60:ヒトIgG陽性対照;62:ヒト血清アルブミン(HSA)陰性対照;64:HAV Ag;66:HCV Ag;68:HDV Ag;70:HBs Ag;72:HBe Ag;74:HBc Ag;76:HEV Ag。
【図4C】同じ好ましい実施の形態の、さまざまな肝炎抗体を検出するための肝炎タンパク質チップにおけるテスト領域の図である。60a:HBsAg陽性対照;60b:HBeAg陽性対照;60c:AFP陽性対照;60d:HDVAg陽性対照;62:陰性対照;78:HBs Ab;80:HBe Ab;82:AFP Ab;84:HDV Ab。
【図4D】図4Aから図4Cに示すチップを用いた血清中に存在する抗HAV−IgGでのHAV感染患者の診断の期待される結果の例を示す図である。チップの2つの領域を示す。
【図4E】図4Aから図4Cに示すチップを用いたHBsAg、HBeAg、HBcAbを含む血清でのHBV感染患者の診断の期待される結果の例を示す図である。チップの2つの領域を示す。
【図5A】この発明のさらなる好ましい実施の形態に従ったToRCHタンパク質チップのテスト領域を示す図である。86:トキソプラズマ;88:風疹ウイルス;90:CMV;92:HSV1;94:HSV2;96:陽性対照;98:陰性対照。
【図5B】ToRCHタンパク質チップを用いた、風疹ウイルス感染患者の診断における図5Aの期待される結果の例を示す図である(図示をわかりやすくするために、1つのテスト領域またはウェルのみを示す;RV IgGを含む患者血清を用いてテストを行なった)。
【図5C】CMV感染患者の診断における図5Bの結果の例を示す図である(図示をわかりやすくするために、1つのテスト領域またはウェルのみを示す;CMV IgMを含む患者血清を用いてテストを行なった)。
【図6A】この発明のさらに別に実施の形態に従った、ガンタンパク質チップのテスト領域を示す図である。
【図6B】患者の血清を用いた肝臓ガン患者の診断における図6Aの期待される結果の例を示す図である。
【図7A】自己免疫疾患タンパク質チップのテスト領域を示す図である。
【図7B】自己免疫疾患タンパク質チップを用いた全身性エリテマトーデスの診断における図7Aの期待される結果の例を示す図である(図示をわかりやすくするために、1つのテスト領域のみを示す)。
【図7C】自己免疫疾患タンパク質チップを用いたリウマチ様関節炎の患者の診断における図7Aの期待される結果の例を示す図である。(図示をわかりやすくするために、1つのテスト領域のみを示す)。

Claims (16)

  1. 固体基板と仕切りとを含む多数のアナライトを検出するための装置であって、前記基板は複数の離散したテスト部位が規定されたテスト表面を有し、各前記テスト部位はテスト分子を固定され、
    前記仕切りは装着表面に設けられる予め定められた位置に複数の穴を有し、前記装着表面は前記テスト表面と相補的であって前記テスト表面への装着に対して適合され、前記仕切りは、各前記穴が前記テスト表面の一部と接合して複数の漏れが防止されたチャンバを作るように前記固体基板にリバーシブルに装着可能であり、前記チャンバ内の前記テスト表面はその中に露出する複数のテスト部位を有し、前記チャンバはさらに、前記チャンバに導入される流体がテストのために前記露出するテスト部位と接触するように外部からアクセス可能である開口部を有する、装置。
  2. 前記テスト分子は抗原または抗体である、請求項1に記載の装置。
  3. カバーが設けられ、前記カバーは、こぼれまたは異なったチャンバの溶液間の汚染を防止するために前記チャンバの前記開口部を閉鎖するよう適合されるカバー表面を有する、請求項1に記載の装置。
  4. 前記カバーはポリエステルシートである、請求項3に記載の装置。
  5. 多数のアナライトを検出するための装置であって、
    (a) 平坦な表面を備えたチップを含み,前記平坦な表面には複数の反応領域が規定され、各前記反応領域はさらに、少なくとも1つのアレイの離散したテスト部位を含み、各前記テスト部位はテスト分子を固定され、さらに
    (b) フレーム内に規定される複数の穴を有する仕切りシートを含み、各前記穴は反応領域に対応し、前記フレームは、複数の漏れが防止されたウェルが前記平坦な表面との間に作られ、各反応領域が対応のウェルの底を形成し、かつ前記シートのフレームが近接するウェルとの間に仕切り壁を形成するように、前記平坦な表面とのリバーシブルな結合に対して適合される、装置。
  6. 前記テスト分子は抗原または抗体である、請求項5に記載の装置。
  7. サンプル中の多数のアナライトを分析するための方法であって、
    (a) 複数の離散しかつ空間的に離れたテスト部位を、テスト表面の少なくとも1つのテスト領域に規定するステップと、
    (b) テスト分子を、複数のテスト分子が固定されるように、各前記テスト部位に固定するステップと、
    (c) 各前記テスト領域の周りに流体に耐性のあるバリアを設けるステップと、
    (d) 各前記テスト領域を分析のために適切なテスト試薬およびサンプルで接触するステップと、
    (e) 反応しないサンプルおよび試薬を除去するステップと、
    (f) 前記バリアを除去するステップと、
    (g) 前記サンプル内のアナライトと前記テスト分子との間の反応について前記テスト表面を分析するステップとを含む、方法。
  8. 請求項7に記載の同じサンプルからの多数のアナライトを分析する方法であって、前記テスト表面はチップの一方側であり、前記テスト分子は抗体またはリガンドであり、前記ステップ(d)および(e)はさらに、
    前記サンプルを各テスト領域内に固定したテスト分子とインキュベートして前記アナライトをそこへ結合させるステップを含み、前記アナライトは交差反応リガンドまたは抗体であり、さらに
    結合しない材料を除去するステップと、
    前記反応領域に適切な二次分子の混合物を加えてそこでインキュベートするステップとを含み、各前記二次分子は信号分子を結合され、前記二次分子はさらに、適切なアナライトに特異的に結合するよう適合され、さらに
    結合しない二次分子を除去するステップと、
    各前記テスト部位の前記信号分子の存在を検出するステップとを含む、方法。
  9. 前記テスト分子はホルモン、薬剤、受容体、酵素、核酸、抗生物質またはリガンドである、請求項7に記載の方法。
  10. 前記二次分子は前記適切なアナライトと交差反応する二次抗体であり、前記信号分子は励起光子の励起の際に放出光子を放出可能である蛍光分子であり、前記信号分子の存在を検出するステップはさらに、前記信号分子を前記励起光で励起するステップと、蛍光検出器を用いた放出光子の放出を検出するために検出器を用いるステップとを含む、請求項7に記載の方法。
  11. 前記信号分子は酵素であり、前記信号分子の存在を検出するステップはさらに、前記酵素に適切な基板を与えてインキュベートするステップを含み、前記酵素は前記基板を、前記テスト部位に堆積される着色物に変換するよう適合される、請求項8に記載の方法。
  12. 前記二次分子は前記適切なアナライトと交差反応する二次抗体であり、前記信号分子はビオチンであり、前記信号分子の存在を検出するステップはさらに、前記信号分子をストレプトアビジンまたはアビジンで接触してそこへ結合させるステップと;結合しないストレプトアビジンまたはアビジンを除去するステップと;前記結合したストレプトアビジンまたはアビジンを二次ビオチンを含む溶液で接触するステップとを含み、前記二次ビオチンは蛍光分子と結合し、前記蛍光分子は放出光子を放出することが可能であり、さらに;前記チップに励起光子を照射するステップと、前記蛍光分子からの放出光子の放出を検出するために検出器を用いるステップとを含む、請求項8に記載の方法。
  13. 前記テスト分子は、A型肝炎ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、D型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎表面抗原、B型肝炎「e」抗原、B型肝炎コア抗原、E型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎表面抗原に対する抗体、B型肝炎「e」抗原に対する抗体、α−フェトプロテイン抗原に対する抗体、およびD型肝炎ウイルス抗原に対する抗体からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
  14. 前記テスト分子は、トキソプラズマ、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、I型単純ヘルペスウイルスおよびII型単純ヘルペスウイルスからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
  15. 前記テスト分子は、抗α−フェトプロテイン、抗γ−グルタミルトランスフェラーゼアイソザイムI抗体、抗γ−グルタミルトランスフェラーゼアイソザイムI’抗体、抗γ−グルタミルトランスフェラーゼアイソザイムII抗体、抗γ−グルタミルトランスフェラーゼアイソザイムII’抗体、抗des-γカルボキシプロトロンビン抗体、抗α−L−フコシダーゼ抗体、抗5’ヌクレオチドホスホジエステラーゼアイソザイムV抗体、抗グルタチオンS−トランスフェラーゼ胎盤型抗体、抗α−1−抗トリプシン抗体、抗フェリチン抗体、抗酸性イソフェリチン抗体、および抗B型肝炎表面抗原抗体からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
  16. 前記テスト分子は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、SMITH抗原、アセチルコリン受容体、チログロブリン、マイクロゾーム抗原、異常ヒトIgGおよび赤血球タンパク質からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
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