JP2004532404A - 多数のアナライトを検出するための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
少なくとも１つのサンプルにおける多数のアナライトの検出のための装置が提供される。装置は、テスト表面を備えた固体基板を含む。テスト表面には、少なくとも１つのアレイの離散したテスト部位を含む少なくとも１つの反応領域が規定される。これらのテスト部位の各々にはテスト分子が固定され、異なったテスト部位は異なったテスト分子を固定される。仕切りが固体基板に装着するために設けられる。仕切りは装着表面に複数の穴を含む。装着表面は、固体装置のテスト表面と相補であり、これら２つの部品が装着された場合に各穴がテスト表面の一部と接合して複数の漏れが防止されたチャンバを作るように、リバーシブルな装着に対して適合される。チャンバ内のテスト表面は、チャンバ内に露出する複数のテスト部位を含む。各チャンバは好ましくは、チャンバに導入される流体がテストのために露出したテスト部位に接触し得るように外部からアクセス可能である開口部を設けられる。この発明の別の局面においては、同じサンプル中の多数のアナライトを分析するための方法が提供される。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は、サンプル中の１つ以上のアナライトを検出するための、および／または定量化するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
さまざまな疾病および人体の症状を検出するための、診断用テスト装置が多くの論文および特許文献に記載されている。治療および診断の発展とともに、疾病症状の早期診断のために人体の健康状態を観察することが、ますます重要になった。同じサンプル中の異なったアナライトをテストできる機能は、多くの者が追求している目標である。理想的には、必要な試薬および人的資源を節約するために、単一のテスト装置を用いた単一のサンプルを分析するための方法が、多数のアナライトについての診断用情報をもたらすべきである。
【０００３】
ウーデンバーグ（Woudenberg）他の特許文献１は、１つ以上のサンプルアナライトの存在または不在についてサンプルを同時にテストするための方法および装置に向けられる。装置は、一連のチャンバを有し、かつ各チャンバがアナライトと反応するのに有効である特定の試薬を有する、サンプル分配ネットワークを規定する基板を有すると記載される。上述のシステムを用いて多数のアナライトを分析し得るかもしれないが、装置はこのために特に固体の基板が製造されることが必要になるであろういくつものチャンバおよび溝を有する。
【０００４】
フィツジェラルド（Fitzgerald）他の特許文献２は、基板と多数の離散した反応部位とがリガンドで共有結合される、多数のアナライトアッセイを行なう固体状態の装置を記載する。この出願は、分析されるべきサンプルを収容するためのさまざまな溝およびチャンバを備えた装置を開示する。この発明はさらに、多数のアナライトを有するフォーマットにおける異なったアナライトを同時に検出するための統合された分析システムを提供する。
【０００５】
上述のシステムはサンプルから多数のアナライトを分析することが可能であるが、装置を製造するためのおよびサンプルをテストするためのコストを削減する改良されたシステムを提供する必要性が引き続き存在する。また、サンプルおよび試薬の量を減じる必要性もある。
【特許文献１】
米国特許第６１２６８９９号明細書
【特許文献２】
欧州特許出願第ＥＰ０８７４２４２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、この発明の目的は、多数のアナライトに対する改良された診断システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
この発明の一局面に従うと、少なくとも１つのサンプルにおける多数のアナライトを検出するための装置が提供される。装置は、テスト表面を備えた固体基板を含む。テスト表面上には、少なくとも１アレイの離散テスト部位を含む少なくとも１つの反応領域が規定される。これらの各テスト部位上にはテスト分子が固定され、異なったテスト部位上には異なったテスト分子が固定され得る。固体基板に装着するための仕切りが設けられる。仕切りは、装着表面に設けられる複数の穴を含む。装着表面は、固体装置のテスト表面と相補なものであり、かつ２つの部品が組み立てられたときに各穴がテスト表面の部分と接合して複数の漏れが防止されたチャンバを作るように、リバーシブルにテスト表面に装着されるよう適合される。チャンバ内のテスト表面は、チャンバ内に露出する複数のテスト部位を含む。各チャンバは、好ましくはチャンバに導入される流体がテストのために露出したテスト部位と接触するように、外部からアクセス可能である開口部を設けられる。
【０００８】
好ましい実施の形態においては、チャンバは、底としての役割を果たす固体基板のテスト表面と、保持壁としての役割を果たす仕切りの一部とによって作られるウェルであり、それにより、複数のテスト部位がチャンバ内のウェルの底に露出する。
【０００９】
この発明の別の局面においては、テスト分子は少なくとも１つのリガンドと少なくとも１つの抗体とからなる。同じサンプル内の対応の交差反応するアナライトの結合反応が同じ反応領域内で同時に達成されるように、リガンドは１つのテスト部位に固定され、抗体は同じチャンバ内の異なったテスト部位に固定される。
【００１０】
この検出装置の好ましい実施の形態においては、固体基板は複数の反応領域が規定された平坦な頂部表面を備えたチップである。各テスト領域は、テスト分子が固定された少なくとも１アレイの離散テスト部位を含む。仕切りは、フレームによって規定される穴を有するシートであって、各穴は反応領域に対応する。シートのフレームは、チップの平坦表面との間に漏れが防止されたウェルが作られるように、チップの平坦表面とのリバーシブルな結合に対して適合される。結合は、これに限定されるものではないが、クリップおよびねじなどの機械的手段、ならびに、にかわおよび接着剤などの化学的手段を含むどのような従来の手段を用いて行われてもよい。各ウェル内に、チップの頂部表面の１つの反応領域はウェルの底を形成し、シートのフレームの対応の部分はウェルの間の仕切り壁を形成する。シートは、サンプル反応の後でシートを取り外してチップを結果読出および分析のために標準チップリーダに挿入できるよう、取り外し可能である。この好ましい実施の形態の１つの利点は、多くの標準チップリーダをテスト結果の分析のために用い得ることである。取り外し可能仕切りシートは、チップに装着されると、異なったサンプルの反応が生じ得るウェルのシステムを含む組み立てられた装置を形成する。ウェルの数は、ユーザの要件と、それに従って製作された必要な穴を備えた仕切りシートとに従って決定することができる。この発明は、標準チップフォーマットにおいて多数のアナライトおよびサンプルを検出するための真に多用途のバイオチップおよび方法を提供した。
【００１１】
この発明の別の局面に従うと、同じサンプル内の多数のアナライトを分析するための方法が提供される。方法は、テスト表面上に、複数の離散した、および空間的に離れたテスト部位を規定するステップと、複数のテスト分子が固定されるように、１つのテスト分子を各テスト部位に固定するステップとを含む。次いで各テスト領域の周りの流体防止バリアが作られ、分析のためのサンプルが適切なテスト試薬とともに各テスト領域に加えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
詳細な説明
ここでの定義では、サンプルは、これらに限定するものではないが、テストされるべきいかなるアナライトをも含む、いかなる溶液、混合物または生物学的流体をも含む。サンプルは、陽性対照血清と、陰性対照血清と、生物学的流体とを含む。漏れが防止されたチャンバは、流体の体積がチャンバのサイズで収容されるように適合されていれば、チャンバが漏れやこぼれなしに少なくとも１方向において流体を保持可能であることを意味する。漏れが防止されたチャンバは、封鎖された構造または開口部を備えた構造を含む。リガンドは、抗体−抗原結合反応において抗体と反応可能であるいかなる抗原または分子、酵素−基板結合反応における基板、またはこれらに限定するものではないが、核酸、染色体断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、脂質、ポリペプチド、抗生物質、ステロイドおよび他の有機分子を含む、受容体によって認識され結合されることができる分子をも指す。
【００１３】
この発明の好ましい実施の形態において、図１Ａから図１Ｄを参照して、ガラススライド２０からなるバイオチップには分離頂部仕切りシート２２が設けられる。図１Ｂに示される仕切りシート２２は、どのような不活性な物質からなってもよく、好ましくはプラスチック、メンブレン、ラテックス、セラミック、ゴム、樹脂、ＰＶＣまたはシリコンなどの可撓性材料からなる。穴２２ａが、フレーム２２ｂが各穴の周りに形成されるように、仕切りシートに打抜かれる。するとフレーム２２ｂは側壁としての役割を果たし、スライドの頂部表面は底としての役割を果たして、図１Ｄに示すように、それらの間にウェルまたはチャンバ２４を形成する。頂部仕切りシートのサイズは、好ましくはスライドと同じ寸法であるか、または僅かに短く、ガラススライド２０に直接にかわ付けされるように、下側ににかわを含む。好ましい実施の形態においては、にかわは頂部仕切りシートをガラススライドに装着させてそれらの間にウェル２４を形成させるのに十分に強度がある。ウェルは、適切な量の流体が各ウェルに加えられた場合に流体が接合する領域を通って隣接するウェルに流れ込まないように、漏れを防止するべきである。にかわはまた、不活性であって、ユーザの都合で仕切りシートをスライドから取り外すことを可能にする材料からなるべきである。テスト部位の各アレイにおける行または列の数は、ユーザの必要性に応じてさまざまであり得る。仕切りシートの厚さは、各ウェルにおいて要求される反応の量に依存し、過度の実験を行なうことなく当業者が決定し得る。たとえば、シートは１〜３ｍｍ厚さであり得る。穴およびフレームは、ユーザの必要性に応じたどのようなサイズまたは形状でもあり得る。例示のために、内径が０．３ｃｍ×０．３ｃｍ〜０．４ｃｍ×０．６ｃｍ〜１．２ｃｍ×１．２ｃｍの穴を用い得る。２２ｂまたは３４ａなどの仕切り壁の幅は、０．１５ｃｍから０．６ｃｍに渡り得る。従って穴の数もさまざまであってよく、たとえば１×２、２×３、３×１０、３×５、２×５、３×８および４×８アレイフォーマットである。
【００１４】
最も簡単な実施の形態においては、単一のテスト分子が、特定のウェルに対応するガラススライドの１つのテスト領域２０ａに固定され得る。たとえば、図１Ｂにおいて、穴Ｈ１の位置は、図１Ａに示されるテスト領域ＴＡ１の位置に対応するであろう。頂部仕切りシートがスライド２０上に装着されてにかわ付けされた場合に、ウェルＷ１が形成され、そのウェルの底が図１Ｃに示すテスト領域ＴＡ１に対応するように、１つのテスト分子がテスト領域ＴＡ１上に固定される。この特定の例においてはテスト分子は１つしかなく、従って各テスト領域内には１つのテスト部位しかない。図１Ｅに示すように任意のカバーシート２１もまた、結合反応のインキュベーションの間に溶液を覆って蒸発、こぼれまたは汚染を防ぐために仕切りの外側表面上に置くことができる蓋として設けられる。するとカバーシートは、ユーザの必要に応じて取り除くことができる。カバーシートは仕切りのために用いられる材料などの、どのような不活性材料から作られてもよい。例は、ポリエステルフィルムである。
【００１５】
別の実施の形態においては、複数のテスト分子が各チャンバまたはウェル内に見出されるように、複数のテスト部位が各テスト領域に規定される。まず図２Ａを参照して、この発明に従った別のガラススライド２９がその上に２つのテスト領域を規定されて示される。各テスト領域は、点線の矩形として示される。各テスト領域内にあるのは、３×３アレイに規定されて円形で示されるテスト部位３２である。図２Ｂは、２つのより大きな穴３６が打ち抜かれた相補的仕切りシート３４を示す。シートの残りはフレーム３４ａを形成する。図２Ｃおよび図２Ｄは、２つの大きなウェル４０が仕切り３４とガラススライド２９との間に形成された、この発明のこの実施の形態に従った組立てられた装置を示す。示される図から、この特定の例において、最大９つの異なったテスト分子を同じテスト領域に固定することができ、このフォーマットを用いて多数のアナライトを検出し得ることが明らかである。
【００１６】
図３Ａは、一方のテスト領域４１（１つのチャンバの底に対応）が９アレイの４×４テスト部位を含む、この発明の別の実施の形態を示す。図示をわかりやすくするために、他方のテスト領域および固体装置は図示しない。同様の種類の異なったチャンバまたはテスト領域がユーザの要件に応じて規定され得ることが明らかである。さらに、同じテスト表面上の異なったテスト領域が異なったテスト部位配置を有してもよい。この例においては、白抜き円４２はアッセイ分子が固定されたテスト部位を規定する一方、塗りつぶし円４４は陽性対照分子が固定された陽性対照部位である。点線円４６は陰性対照が固定されたテスト部位を規定する。陽性対照分子はサンプル中に存在することがわかっているアナライトと反応することが期待される一方、陰性の方はサンプル中のどのアナライトとも反応することが期待されないテスト分子を含む。アッセイ分子は、サンプル中未知のレベルでアナライト（説明をわかりやすくするためにアッセイアナライトと称する）と交差反応するものである。アッセイアナライトは診断用テストの対象である。この例のこの単一のテスト領域（すなわち単一ウェル）は、３行の４×４アレイのテスト部位（行ＡからＣ）および３列の４×４アレイのテスト部位（列ＡからＣ）を含む。アレイＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＣ１は同一である。陽性対照およびアッセイ分子は補間的な位置に配置される。陰性対照はアレイＣ２およびＣ３のテスト部位に固定される。ウェル４１の全体が、すべてのテスト部位に対する反応が同時に、かつ同じ反応領域内で生じるように、１つのサンプルを受けるように適合される。こうしてこの例においては、３つの異なったテスト分子が、分析のために同じテスト領域に固定される。さらに、テスト分子ごとにテスト部位を多数繰返すことは、極めて正確な検出を行なうことを可能にする。
【００１７】
上述の例はアレイＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＣ３に同じ３つのアッセイ分子が同一のフォーマットで配置されるのを示すが、異なったアッセイ分子が同じ反応領域におけるこれらのアレイの各々に固定されてもよいことは明らかである。たとえば、１つのアッセイ分子（たとえば陽性対照分子）がアレイＡ１の８つの反応部位に固定される一方、第２のおよび異なったアッセイ分子（たとえば陰性アッセイ分子）がアレイＢ３の８つの反応部位に固定されてもよい。さらに、所望のレベルの精度をもたらすために要求される重複の数に依存して、さまざまな異なったアッセイ分子がこれらの７つのアレイに固定されてもよいことは明らかである。
【００１８】
図３Ｂは、１つのウェルまたはチャンバに対応するテスト領域４８が、４つの四半分に囲まれる中心行および中心列を有する９×９アレイを含む、この発明の別の実施の形態を示す。陰性対照５４は中心列および中心行に沿って「十字（cross）」または十字型（cruciform）構成に固定される一方、陽性対照５０およびアッセイ分子５２は４つの四半分内に補間的な位置で配置される。このフォーマットを使用すれば、陰性対照が期待通りに無のまたは低い信号を生じる成功した実験例においては、４つの四半分がはっきりと解明されることは明らかである。こうして、このフォーマットには、簡単な目視検査によってさえも明らかで曖昧さのない結果をもたらす利点がある。
【００１９】
以下の実施例は、この発明のさまざまな特定の実施の形態を示し、本発明を実施し使用することを当業者に教示することを意味するものである。これらの実施例は例示のみを意味し、前掲の特許請求の範囲を限定することを意図しない。以下の実施例においては、テスト分子はプローブまたはマーカーとも称する。テスト領域はしばしば、グリッドと称し、テスト部位はサブグリッドと称する。
【００２０】
実施例１
リガンドをテスト部位に固定する方法
マイクロアレイヤーによって微小サイズの固体基板上に予め定められたグリッドおよびサブグリッドパターンでプローブをプリントおよび固定することにより、タンパク質チップを調製した。プローブは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの形の抗原であっても抗体であってもよく、テストサンプル中のターゲットタンパク質に結合することが可能である。マイクロ固体基板はガラス顕微鏡スライド由来物、ニトロセルロースメンブレン、またはシリカであり得る。ガラス基板の１ｃｍ×１ｃｍ面積ごとに２３９０個のタンパク質スポットをプリントし得る。反応において用いられたサンプルは、プラズマ、血清、血液または他の体液の形であり得る。全反応工程は固体基板上でそのままの場所で行なわれる。
【００２１】
バイオチップの作製：
１．適切な希釈溶液中のプローブを、ソースプレートとしても公知であるマイクロタイタープレートの個々のウェルに加える。
【００２２】
２．ソースプレートをロボットマイクロアレイヤー（米国カリフォルニア州Cartesian TechnologyのProsys4510）の適切なスロットに置く。
【００２３】
３．ソフトウェアがマイクロアレイピンを制御してソースプレートからサンプルを引出す。
【００２４】
４．スライドの表面にサンプルを満たしたピンを置くことにより、顕微鏡スライド由来物上にサンプルがプリントされる。
【００２５】
５．プリントされたバイオチップを３７℃で１時間インキュベートしてタンパク質プローブを基板表面に固定する。
【００２６】
６．基板の残りの表面をＴＢＳ緩衝剤（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびTween 20によって３７℃で１時間ブロックする。
【００２７】
７．二回蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させる。
【００２８】
８．バイオチップを０．３％水酸化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）で３７℃で５〜１０分間インキュベートし、ガラス表面の遊離アルデヒド基を減じる。
【００２９】
９．二回蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させる。
【００３０】
１０．作製されたバイオチップを４℃の暗所で密封する。
【００３１】
装置の組立て方法：
１．マルチチャンバプラスチック装置（仕切りシート）を作るためのプラスチック材料の外側寸法は、固体基板の外側寸法と一致するべきである。
【００３２】
２．装置ごとのチャンバの数は１×２から４×１０の範囲にわたり得る。
【００３３】
３．２つの隣接するチャンバの各々の中心間の距離は、４．５ｍｍの倍数であり、これは３８４および９６マイクロタイタープレートのジオメトリ、マイクロアレイのピンヘッドのピン距離およびマルチチャネルピペットマンと一致する。
【００３４】
４．各チャンバの深さを決定するプラスチックの厚さは少なくとも１ｍｍであるべきで、１〜３ｍｍの範囲にわたり得る。
【００３５】
５．マルチチャンバプラスチック装置の一方は粘着性があるべきで、固体基板にしっかりと接着することができ、反応のための漏れが防止されたウェルを形成する。そのような装置は、水性溶液に浸され水圧下で用いられた場合に、耐水性があり、漏れが防止され、剛性があり、かつ不活性であるべきである。
【００３６】
６．タンパク質プローブは、多数のマーカー、多数の標本の用途のためのバイオチップ作製のために、各チャンバ上にマイクロアレイ化される。
【００３７】
７．マルチチャンバプラスチック装置の外側寸法と一致するサイズであり、片側に接着部を備えるポリエステルフィルムを、任意でマルチチャンババイオチップを覆うために用いて、ウェルで隔離され封鎖された反応のためのチャンバを形成する。
【００３８】
８．マルチチャンババイオチップにおける完全なセットアップは−４０°〜９５℃の反応温度、ＵＶ処理に耐えることができ、耐水性がある。
【００３９】
９．ポリエステルフィルムとマルチチャンバ装置のプラスチックとの間の結合は、装置と固体基板との間の結合よりも弱いべきである。各反応ステップにおけるフィルムの除去は、マルチチャンババイオチップの構造を変更してはならない。
【００４０】
１０．反応が完了すると、従来のマイクロアレイスキャナ（Scanarray4000、Packard Bioscience（現在はPerkinElmer Life Sciences）、米国コネティカット州）で分析するために、プラスチック装置を固体基板からはずし得る。タンパク質の固体基板への固定は、物理的相互作用、たとえば帯電により（たとえば負に帯電したタンパク質が正に帯電したメンブレンまたは正に帯電した金属表面と結合する）、疎水性相互作用により（疎水性タンパク質が疎水性メンブレンと結合する）、滞留により（ある大きさのタンパク質が、メンブレンのまたはゲルタイプの基板などの多孔性基板によって妨げられる）、または化学相互作用（たとえば、エポキシスライド、シラン化スライド、シリル化スライドとの結合）により達成されてもよい。
【００４１】
実施例２
バイオチップ上に固定された交差反応抗原を用いたヒト血清中の抗体を検出する方法
反応および検出：
１．バイオチップをパッケージから取出す。
【００４２】
２．テストサンプル（患者サンプル、陽性および陰性血清対照）を別々に、バイオチップ内の個々のチャンバに加え、３７℃で１時間反応させる。
【００４３】
３．結合していない反応物をＰＢＳまたはＴＢＳなどのナトリウム塩を含む洗浄緩衝剤で洗浄する（ＰＢＳ：０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、０．００４３Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２０、０．００１４Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）（ＴＢＳ：０．００２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）。
【００４４】
４．余分な緩衝剤を除去して５分間室温で乾燥させる。
【００４５】
５．ブロック溶液（ＴＢＳまたはＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン）をバイオチップに加える。
【００４６】
６．バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【００４７】
７．蛍光標識した化合物（二次抗体または抗原）をブロック溶液で希釈し、バイオチップに加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００４８】
８．洗浄してバイオチップから仕切りシートを取り除き、遠心脱水する。
【００４９】
９．画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの蛍光強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【００５０】
別の実施の形態においては、上述のステップ７〜９は、以下のステップ７ａ〜１３ａに置きかえられる。
【００５１】
７ａ．ビオチン結合二次抗体をブロック溶液で希釈し、バイオチップに加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００５２】
８ａ．バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【００５３】
９ａ．ブロック溶液中のストレプトアビジン分子を加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００５４】
１０ａ．洗浄して乾燥させる。
【００５５】
１１ａ．ブロック溶液で蛍光化合物（ビオチンまたは抗ストレプトアビジン抗体）を希釈して３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００５６】
１２ａ．洗浄してバイオチップから仕切りシートを取り除き、遠心脱水する。
【００５７】
１３ａ．画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの蛍光強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【００５８】
実施例３
交差反応抗体を固定したチップを用いた抗原の検出方法
反応および検出：
１．バイオチップをパッケージから取出す。
【００５９】
２．テストサンプル（患者血清、陽性および陰性血清対照）をバイオチップに加え、３７℃で１時間反応させる。
【００６０】
３．結合していない反応物をＰＢＳまたはＴＢＳなどのナトリウム塩を含む洗浄緩衝剤で洗浄する（ＰＢＳ：０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、０．００４３Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２０、０．００１４Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）（ＴＢＳ：０．００２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）。
【００６１】
４．余分な緩衝剤を除去して５分間室温で軽く乾燥させる。
【００６２】
５．ブロック溶液（ＴＢＳまたはＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン）をバイオチップに加える。
【００６３】
６．バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【００６４】
７．ブロック溶液で希釈した２番目の一次抗体をバイオチップに加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００６５】
８．洗浄し、遠心脱水して再びブロックする。
【００６６】
９．ブロック溶液で希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（二次抗体）を加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００６７】
１０．適切な化学ルミネセンス基板（ICN Biomedicals Inc（米国カリフォルニア州）のＨＲＰのためのルミノール、または、Pierce Chemical Company（米国イリノイ州）のＡＰのための１，２−ジオキセタン系基板）を加えて室温で１分間インキュベートする（製造元のマニュアルに従う）。
【００６８】
１１．画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの化学ルミネセンス強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【００６９】
実施例４Ａ
ヒト血清中の肝炎の診断
この実施の形態は、タンパク質チップの作製と、肝炎ウイルス感染によって引き起こされる急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、および肝臓ガンの診断における、その適用とを含む。
【００７０】
Ａ型肝炎感染診断のためのマーカーは、Ａ型肝炎抗体（抗ＨＡＶ ＩｇＧまたはＩｇＭＡｂ）であり；Ｂ型肝炎についてはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎「ｅ」抗原（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎表面抗体（ＨＢｓＡｂ）、Ｂ型肝炎「ｅ」抗体（ＨＢｅＡｂ）、および肝炎コア抗体（ＨＢｃＡｂ）であり；Ｃ型肝炎についてはＣ型肝炎抗体（抗ＨＣＶ ＩｇＧまたはＩｇＭ）であり；Ｄ型肝炎についてはＤ型肝炎抗体（抗ＨＤＶ ＩｇＧまたはＩｇＭ）であり；Ｅ型肝炎についてはＥ型肝炎抗体（抗ＨＥＶ ＩｇＧまたはＩｇＭ）である。α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、肝臓ガン診断のためにバイオチップに含めるマーカーである。これらのマーカーに特異に反応し得るプローブまたはテスト分子を、バイオチップ作製の間に固体基板にプリントする。
【００７１】
テスト領域の例を図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、および図４Ｅに示す。この例はデータ分析のために同じチップ（図４Ａ）上の２つのテスト領域５６および５８に設けられる多数の繰返しを用いることを示す。これらのテスト領域は、このバイオチップ上にサンプル導入のために２つの対応する穴を備えた適切な仕切りが置かれた場合に、２つのウェルの底としての役割を果たす。この配置の利点は、以下の図面の説明から明らかとなるであろう。各テスト分子を多く繰返すと、データ分析における信頼性を高めデータ収集の間の地理的および機械ばらつきを最小化するので、各バイオチップ実験における精度を高める。さらに、以下に示す明確なパターンは，高密度アレイにおけるスポットの識別を容易にする。
【００７２】
この実施例においては、このバイオチップ上に規定される２つのテスト領域またはグリッド５６および５８がある。グリッドまたはテスト領域５６はテスト部位の７つのサブグリッドまたはアレイ５６ａを含む。各サブグリッド５６ａ内に、陽性対照およびアッセイ分子がアレイ構成になるよう多数繰返されて固定される。点線５６ｂは陰性対照が規定される多数のテスト部位の位置を表す。
【００７３】
図４Ｂを参照して、テスト領域またはグリッド５６がより詳細に示される。点線円６２は陰性対照を表すが、これは各サブグリッドの境界を描く行および列をわたって多数繰返してスポットされるのが見出される。各サブグリッドにおいて、陽性対照６０およびテスト分子（肝炎抗原の１つ）が固定される。各サブグリッドに固定されるテスト分子は異なった肝炎ウイルス抗原である。
【００７４】
たとえば、アレイＡ１には、ヒトＩｇＧを陽性対照６０とした、４×４配置の１６個のテスト部位があり；テスト分子Ａ型肝炎抗原（ＨＡＶ Ａｇ）６４が補間的に配置されて固定される。他の６個のアレイ（Ａ２−Ａ７）が示されるが、固定されるテスト分子のみが異なる（ＨＡＶ抗原６４、ＨＣＶ抗原６６、ＨＤＶ抗原６８、ＨＢｓ抗原７０、ＨＢｅＡｇ７２、ＨＢ抗原７４、およびＨＥＶ抗原７６が、それぞれサブグリッドＡ１〜Ａ７に固定される）。
【００７５】
図４Ｃに示されるテスト領域５８を参照すると、この領域のテスト部位配置はテスト領域５６とは異なる。テスト領域５８においては、陰性対照は図４Ａの線５８ａに沿ってテスト領域の中心を横切る十字形構成に配置される多数のテスト部位に固定される。陰性対照テスト部位の十字形構成は、テスト領域を４つの四半分に分割する。４つの他のアレイまたはサブグリッド（Ｂ１〜Ｂ４）がその周りに設けられる。図４Ｃに示すアレイＢ１内には、陽性対照Ｂ型肝炎表面抗原６０ａおよびテスト分子抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体（ＨＢｓＡｂ）７８は補間的関係で別々の離散した１６個のテスト部位に固定される。他の３つの四半分（Ｂ２〜Ｂ４）はそれぞれ、陽性対照Ｂ型肝炎ＢｅＡｇ６０ｂおよび抗Ｂ型肝炎「ｅ」抗体８０と、陽性対照ＡＦＰ６０ｃおよび抗ＡＦＰ抗体８２と、陽性対照Ｄ型肝炎ウイルス抗原６０ｄおよび抗Ｄ型肝炎ウイルス抗体８４とを含む。
【００７６】
結合反応のための方法
表１は、バイオチップ上のテスト分子ごとのスポット条件を示す。第２欄は、スポットのために用いられたタンパク質溶液の濃度を示し、第３欄は各スポットの推定サイズを示す。各テスト部位に実際に固定されたタンパク質の量は、各反応部位に半球状スポットが与えられたと仮定して推定される。全スポットを乾燥させて、ほとんどのタンパク質がテスト部位の表面に固定されたと考えられる。
【００７７】
【表１】
【００７８】
結合反応中に、患者の血清をそれぞれ実施例２および実施例３に説明した方法と同様の方法を用いてチャンバ５６および５８に加えた。この実施例においては、バイオチップには２つのテスト領域しか示されず、一方は肝炎抗体をテストするものであり、他方は血清中の肝炎抗原の存在をテストするものであるから、１つのテスト血清だけをテストできる。陽性および陰性対照血清などの他のテスト血清を、２つの別々で同様のバイオチップに与えて陰性および陽性結果を得ることができる。反応が完了した後で、チップをスキャンして各スポットからの蛍光信号強度を記録する。
【００７９】
実施例４Ｂ
多数のウェルを用いたヒト血清中の肝炎の診断
この実施例は、どのように実施例４Ａに説明したシステムを多数のウェルを含むバイオチップの使用に適合して、同じバイオチップでテストされ得るサンプルの数を増大させるかを示す。この実施例においては、図１Ａに示すもののような３行および８列のアレイが患者の肝炎の診断に用いられる。説明を容易にするために、テスト領域の行を上から下に向かって行Ａ、Ｂ、Ｃと称し、テスト領域の列をそれぞれ行１〜８と称する。この実施例においては、バイオチップの列１〜４内の１２個のテスト領域は、図４Ｂのテスト領域５６に示すものと同一のテスト部位を含む。列５〜８内の１２個のテスト領域は各々が図４Ｃのテスト領域５８に見出されるものと同一のテスト部位のアレイを含む。この配置を用いて、血清中の肝炎抗原の診断のために、合計１２個のテスト領域（すなわちウェル）があることが明らかにわかる。この実施例においては、既知の肝炎感染の患者から得られた陽性対照血清がテスト領域Ａ１に加えられる。肝炎に感染していない健康な個人から得た陰性対照血清がウェルＢ１において診断的反応のために用いられる。残りの１０個のウェル（ウェルＡ２〜Ａ４、Ｂ２〜Ｂ４、およびＣ１〜Ｃ４）は肝炎抗原の存在が未知である患者の血清をテストするために用い得る。同様の態様で、陽性対照血清をウェルＡ５で用いて肝炎抗体に対する陽性対照を提供する一方、陰性対照血清をウェルＢ５に加え得る。残りのウェル（Ａ６〜Ａ８、Ｂ６〜Ｂ８、およびＣ５〜Ｃ８）は、未知の血清をテストするために用い得る。用いられる結合反応と検出システムは、実施例４Ａで説明したものと同様である。
【００８０】
結果分析の方法
Ｒ値＝９５％ガウス分布内に入るテストプローブの信号強度の平均値を、同じサブグリッド内の陽性対照プローブのもので除算したもの。
【００８１】
テストチャンバにおけるテストサンプルからのＲ値はＲｓである。
【００８２】
陽性参照チャンバにおける陽性対照サンプルからのＲ値はＲｐである。
【００８３】
陰性参照チャンバにおける陰性対照サンプルからのＲ値はＲｎである。
【００８４】
Ｒｃｏ＝１／２（Ｒｎ＋Ｒｐ）である。
【００８５】
データを解釈する３つのアプローチがある。
【００８６】
ａ．方法Ｉ：Ｒｓが０．０５よりも大きい個々のサンプルがテストプローブに対して陽性であると規定される；０．０２と０．０５との間のＲｓはボーダーラインであり、テストを繰返すべきである；０．０２よりも小さなものは陰性である。
【００８７】
ｂ．方法ＩＩ：Ｒｓ／Ｒｎが２．１よりも大きい個々のサンプルが陽性であると規定され、１．５と２．１との間のＲｓ／Ｒｎはボーダーラインであり；１．５よりも小さなＲｓ／Ｒｎは陰性である。
【００８８】
ｃ．方法ＩＩＩ：Ｒｃｏよりも大きいＲｓの個々のテストサンプルが陽性であり；Ｒｃｏよりも小さなものが陰性である。
【００８９】
この発明は、チャンバ内の、および同じチップにわたるチャンバ間のデータ比較を容易にする。マイクロアレイおよびデータ操作方法においてこの設計を用いることにより、信号強度に影響を与える恐れのある地理的ばらつきは最小化される。
【００９０】
上述の方法を採用して、中国国家薬品監督管理局（ＳＤＡ）から肝炎標準血清を得て、本件に従った方法および装置の精度および感度を調べるためにテスト血清として用いた。
【００９１】
中国における診断キットの精度および精密度を確実にするために、ＳＤＡは感度および特異度の標準を設定している。感度テストは、診断キットの最も弱い反応範囲を設定する。この発明に従った方法は、１００％の精度で感度テストに合格した。表２の第２欄は、中国国家薬品監督管理局から、臨床用途で中国で登録されているすべての診断キットの感度を調べるために用いなければならない参照サンプルとして提供されたサンプルを示す。ＨｂｓＡｇおよびＨｂｓＡｂについては、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｍＩＵ／ｍｌの参照標準をそれぞれ用いた。
【００９２】
【表２】
【００９３】
１．ＳＤＡ標準パネルキットロット番号９９０９
２．ＨｂｓＡＧ（Ｂ型肝炎表面抗原）；３．ＨＢｓＡｂ（Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体）；４．ＨＢｅＡｇ（Ｂ型肝炎「ｅ」抗原）；５．ＨｂｅＡｂ（Ｂ型肝炎「ｅ」抗原に対する抗体）；６．ＨｂｃＡｂ（Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体）。
【００９４】
【表３】
【００９５】
１．ＳＤＡ標準パネルキットロット番号９９０９
２．ＨｂｓＡＧ（Ｂ型肝炎表面抗原）；３．ＨｂｓＡｂ（Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体）；４．ＨＢｅＡｇ（Ｂ型肝炎「ｅ」抗原）；５．ＨｂｅＡｂ（Ｂ型肝炎「ｅ」抗原に対する抗体）；６．ＨｂｃＡｂ（Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体）。
【００９６】
上述のこれらの３つの方法を用いた結果をその次の３つの欄に示す。ＨｂｅＡｇ、ＨｂｅＡｂおよびＨｂｃＡｂについては、３つの別々の未知のサンプルがＳＤＡにより提供され、第２欄に示すように血清を希釈するためにさまざまな希釈剤を用いた（ＨｂｅＡｇについてはサンプル番号１、２および３；ＨｂｅＡｂについては番号５５、５７および６１；ＨｂｃＡｂについては番号２、３および４）。結合反応後の蛍光強度検出の結果を、次の対応の欄に示す。
【００９７】
表３は、ＳＤＡによって要求される特異度テストの結果を示す。これらのテストにおいて、第１欄に示すように、それぞれの抗原または抗体をテストするためにＳＤＡにより陰性血清が提供された。結果をその次のいくつかの欄に示す。第２欄において、分数の分母はＳＤＡによって提供されたサンプルの数を示し、比の分子は陰性と判定されたサンプルの数を示す。ＳＤＡ要件に従うと、偽陽性は許容できない。
【００９８】
こうして、この発明に従った方法を用いると、特異度は極めて高く、さまざまな非特異性抗原または抗体を備えた患者の血清の間に交差反応はほとんどない。
【００９９】
図４Ｄは、ＨＡＶ感染患者の期待される結果の例である。陽性信号は、テスト領域５６のみのテスト部位６４および両方のテスト領域５６および５８のすべての陽性対照で記録される。そのような結果は、テスト血清抗体が他のテスト分子ではなくＨＡＶ Ａｇに対して向けられ、テストの特異度が良好であることを示すであろう。
【０１００】
図４Ｅは、ＨＢＶ感染患者の期待される結果の例である。陽性信号がテスト領域５６のテスト部位７４およびテスト領域５８のテスト部位７８および８０において；かつテスト領域５６およびテスト領域５８のすべての陽性対照において期待される。
【０１０１】
実施例５
妊娠患者の出産前テスト
この実施の形態は、出産前テスト目的での妊婦の血清をテストするために用いるべきバイオチップを説明する。集合的にＴｏＲＣＨとして公知であるトキソプラズマ、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ならびにＩ型およびＩＩ型単純ヘルペスウイルスについて、これらの疾病の罹患率が高い妊婦の検診が定期的に行なわれる。疾病は妊娠中または出産時に胎児に伝染し、新生児に重篤な障害をもたらす。これらの合併症のために、妊婦および妊娠可能年齢の女性の免疫状態を評価することは重要である。５つのＴｏＲＣＨマーカーについて特異的である抗原に対応するプローブならびに陽性および陰性対照が、上述のようにマルチチャンバチップの上にプリントされる。バイオチップは、それぞれのチャンバに蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体または蛍光標識した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかを加えることにより、近接するチャンバにおいてＩｇＧおよびＩｇＭを同時に検出することを可能にする。ＴｏＲＣＨ診断におけるＩｇＭの検出は、疾病の早期診断を可能にするが、なぜならばＩｇＭは感染の直後に生成する抗体である一方、ＩｇＧはより長いラグタイムの後で生成されるからである。しかしながらＩｇＧ標識は、感染症が治癒した後でさえもより長い期間に渡って高く留まる。よって、患者の血清中の高いレベルのＩｇＭと低いレベルのＩｇＧとの組合せは、進行中の急性感染症を示す。
【０１０２】
方法：
１．トキソプラズマから分離された抗原に対応するプローブ８６、風疹ウイルス８８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）９０ならびに単純ヘルペスウイルスＩ型９２およびＩＩ型９４、ヒトＩｇＧ陽性対照９６およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）陰性対照９８を、３×３アレイにまたは図５Ａに示すように配置されるテスト部位に繰返しプリントする。これらの異なったサブグリッドを、適切な仕切りを上に装着した場合に単一のウェルに見出される同じテスト領域１００内に規定する。好ましい実施の形態においては、この実施例のバイオチップは図５Ａに示すものと同一である８個のテスト領域を含む。２つのテストされた領域を陽性血清でのインキュベーションに用いる一方、他の２つを陰性対照血清のために用いる。すると、患者の血清をさらに２つ、このバイオチップで重複してテストし得る。
【０１０３】
２．実施例２に記載の通り、固定、乾燥、ブロック、反応、洗浄を行なう。
【０１０４】
３．血清中のＴｏＲＣＨ ＩｇＧを検出するために、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を、上述のように血清でインキュベートしたウェルの１つに用いる。
【０１０５】
４．ＴｏＲＣＨ ＩｇＭを検出するために、蛍光標識した抗ヒトＩｇＭ抗体をそれぞれの血清で以前にインキュベートしておいた重複ウェルに加える。
【０１０６】
５．図５Ｂは風疹ウイルス感染患者からの血清を用いたアッセイの実験結果を示す。陽性信号はテスト分子８８および陽性対照９６において検出可能であった。
【０１０７】
６．図５ＣはＣＭＶ感染患者の血清を用いたアッセイの実験結果を示す。陽性信号はテスト分子９０および陽性対照９６において検出可能であった。
【０１０８】
実施例６
汎用増幅システムとしてのストレプトアビジン／ビオチンシステムの使用
この実施の形態は、タンパク質チップ分析における増強された報告システムとして蛍光／酵素標識したストレプトアビジンおよびビオチン方法（ＦＬＳＡＢ／ＥＬＳＡＢ）を用いる。現在のタンパク質チップ技術においては、蛍光または酵素結合抗体が報告システムにおいて一般に用いられる。この実施の形態はこの報告システムに信号増幅ステップを導入する。この増幅システムを用いると、タンパク質チップの感度は１０倍に増大する。従って、プリントにより少ない量のプローブを用い得る。これにより、バックグラウンドが低減され、信号対ノイズ比は向上し、偽陽性結果の可能性は最小化される。これは酸性タンパク質への蛍光染色標識における困難なステップを省略することをも容易にする。
【０１０９】
タンパク質チップの作製：
１．アルデヒドスライド、ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンなどの固体基板上にタンパク質プローブをアレイする。
【０１１０】
２．スライド上のタンパク質プローブを室温で一晩、または３７℃で１時間乾燥させて固定する。
【０１１１】
３．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝剤で基板表面を３７℃で１時間ブロックする。
【０１１２】
４．二回蒸留水で洗浄し、乾燥させて室温で保存する。
【０１１３】
方法：
１．標本サンプルをタンパク質チップの各チャンバに加えて３７℃で１時間インキュベートする。
【０１１４】
２．余分な標本を洗浄緩衝剤で洗浄して、遠心脱水する。
【０１１５】
３．上述のようにチップをブロック緩衝剤でブロックして洗浄緩衝剤で洗浄する。
【０１１６】
４．洗浄して遠心脱水する。
【０１１７】
５．ターゲットマーカーに特異的に結合するビオチン結合生体分子をブロック緩衝剤で希釈して各チャンバに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１１８】
６．洗浄して遠心脱水する。
【０１１９】
７．ストレプトアビジンをブロック緩衝剤で希釈してチップに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１２０】
８．洗浄して遠心脱水する。
【０１２１】
９．ブロック緩衝剤で希釈した酵素アルカリペルオキシダーゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、または蛍光結合ビオチンをチップに加えて暗所で３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１２２】
１０．もし（９）で酵素結合ビオチンを用いるのであれば、適切な化学ルミネセンス基板である、Pierce Chemical Company（米国イリノイ州）のＨＲＰのためのルミノール、または、ICN Biomedicals Inc（米国カリフォルニア州）の１，２−ジオキセタン系基板を加えて室温で１分間インキュベートする（製造元のマニュアルに従う）。完了した後で、チップを洗浄して仕切りシートを取り除き、チップを遠心脱水してマイクロアレイスキャナでスキャンする。
【０１２３】
実施例７
ガン診断のための方法および装置
この実施の形態は、ガンのための高いスループットおよび高感度の診断方法およびバイオチップを説明する。このチップは、ガンの早期診断を可能にすると同時に、ガンのタイプおよびサブタイプを判断する。プローブは、組織特異腫瘍マーカーに対応する抗体であり；陽性対照は対応の腫瘍マーカーである。ヒト血清アルブミンは陰性対照である。
【０１２４】
ガンチップは、臓器／組織タイプに従ってカテゴリ化される。ガンチップの各タイプは、組織特異腫瘍マーカーに反応する抗体のパネルからなる。各抗体パネル内の発現プロファイルはガンをさらにサブタイプに分類することを可能にする。たとえば、γ−ＧＴＩ’、ＩＩ、ＩＩ’は肝臓ガンにしか見出されず；コンカナバリンＡ反応α−フェトプロテイン（Ｒ Ｃｏｎ Ａ ＡＦＰ）は主に原発性肝臓ガンの血清サンプルに見出される一方、続発性肝臓ガン、性腺および性腺外胚細胞腫瘍においては顕著にＲ Ｃｏｎ Ａ ＡＦＰが低減し無反応型が増大した。従って、ガンバイオチップにおいて腫瘍マーカーのパネルを用いるとガンの診断ならびに、タイプおよびサブタイプの分類が容易になる。
【０１２５】
図６Ａは、１６アレイ（Ａ１〜Ｄ４）のガンチップにおける１つのテスト領域を示す。各アレイは、同じテスト分子が固定された９個の離散したテスト部位を含む。アレイＡ１はテスト分子抗α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体をプリントされ；Ａ２は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）アイソザイムＩ抗体をプリントされ；Ａ３は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）アイソザイムＩ’抗体をプリントされ；Ａ４は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）アイソザイムＩＩ抗体をプリントされ；Ｂ１は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）アイソザイムＩＩ’抗体をプリントされ；Ｂ２は抗des-γカルボキシプロトロンビン（ＤＰＣ）抗体をプリントされ；Ｂ３は抗α−Ｌ−フコシダーゼ抗体をプリントされ；Ｂ４は抗５’ヌクレオチドホスホジエステラーゼアイソザイムＶ抗体をプリントし；Ｃ１は抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ胎盤型抗体をプリントし；Ｃ２は抗α−１−抗トリプシン抗体をプリントし；Ｃ３は抗フェリチン抗体をプリントし；Ｃ４は抗酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）抗体をプリントし；Ｄ１は抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体をプリントし；Ｄ２およびＤ３は１３種の腫瘍マーカーおよびヒトＩｇＧに対応する陽性対照をプリントし；Ｄ４は陰性対照をプリントする。
【０１２６】
図６Ｂは肝臓ガン患者から得られる診断結果の種類の例を示し、たとえば、アレイＡ１、Ａ３、Ａ４、Ａ５およびＤ１ならびに陽性対照Ｄ２およびＤ３において陽性信号が検出される。
【０１２７】
実施例９
自己免疫疾患の診断
自己免疫疾患は、患者の血清中に循環する高レベルのＩｇＭおよびＩｇＧ自己抗体の存在によって特徴付けられる。自己免疫疾患には２つのカテゴリがある：単器官または細胞タイプ、および全身性タイプである。前者の例は、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、すなわちＩｇＧ自己抗体およびＩｇＭ抗体が高まり、体が自身の赤血球（ＲＢＣ）を攻撃するもの；重症筋無力症、すなわちアセチルコリン受容体に対する自己抗体が高まり、患者が重篤な筋肉の弱化を被るもの；および橋本甲状腺炎、すなわち抗チログロブリン抗体および抗マイクロゾーム抗体が高まるもの、である。後者の例は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、すなわち抗核リボヌクレオタンパク質抗体（抗−ｄｓＤＮＡおよび抗ＳＭ）が検出されるもの；およびリウマチ様関節炎、すなわちリウマチ因子が検出されるもの、である。
【０１２８】
方法：
１．自己免疫タンパク質チップは患者の血清中の自己抗体を検出すべきものである。自己免疫疾患マーカーの抗原に対応するプローブを製作のためにマルチチャンバチップにプリントする。マーカーは抗核リボヌクレオタンパク質抗体、リウマチ因子、抗アセチルコリン受容体抗体、抗赤血球抗体、抗チログロブリン抗体および抗マイクロゾーム抗体である。
【０１２９】
図７Ａに、自己免疫診断タンパク質チップの設計の例を示す。同じテスト領域（組立てられた装置の１つのウェルまたはチャンバを代表する）内に、９個の離散したアレイ（Ａ１〜Ｃ３）を規定する。各アレイには、他のアレイとは互いに異なる１つのタイプの分子を固定する。同じアレイ内で、１６個のテスト部位（４×４）は同一のテスト分子を含む。Ａ１は二本鎖ＤＮＡ分子をプリントし；Ａ２はＳＭＩＴＨ抗原をプリントし；Ａ３はアセチルコリン受容体をプリントし；Ｂ１はチログロブリンをプリントし；Ｂ２はミクロゾーム抗原をプリントし；Ｂ３は異常ＩｇＧをプリントし；Ｃ１はヒトＩｇＧ陽性対照をプリントし；Ｃ２は陰性対照をプリントし；Ｃ３は赤血球をプリントする。ＳＭＩＴＨはＤＮＡを正しい形状に保つ助けをする、ＲＮＡおよび非ヒストン核タンパク質の複合体であり；細胞の溶解時にＤＮＡとともに血流中に放出されるものであって、ＳＬＥのマーカーである。
【０１３０】
２．自己免疫タンパク質チップは、間接的な免疫に基づくアッセイである。患者の血清を個々のチャンバに加える。上述の実施例８に記載のように、ＩｇＭの検出と比較してＩｇＧを検出するために、各血清を重複チャンバに加え得る。血清中の自己抗体は定常期プローブと反応する。洗浄後に、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体をチャンバに加えて交差反応ＩｇＧを検出する。
【０１３１】
３．交差反応二価または多価ＩｇＭを検出するために、二重抗原サンドイッチ法をも自己免疫タンパク質チップに適用し得る。血清との反応後に、蛍光標識抗原を反応チャンバに加えて検出する。
【０１３２】
４．反応が完了した後で、バイオチップをマイクロアレイスキャナでスキャンする。
【０１３３】
図７Ｂに全身性エリテマトーデス患者の診断結果の例を示す。陽性信号がテスト部位Ａ１およびＡ２、ならびに陽性対照部位Ｃ１に現れるであろう。
【０１３４】
図７Ｃにリューマチ様関節炎患者の診断結果の例を示す。陽性信号がテスト部位Ｂ３および陽性対照部位Ｃ１に現れるであろう。
【０１３５】
上述の特定の実施の形態についての詳細な説明は、例示および説明の目的で提供された。提供される教示に鑑みて多くの変形例および展開例が可能であるので、これは排他的であること、または開示される厳密な形に発明を限定することを意図しない。たとえば、図４Ａから図４Ｃに示す配置は例示のためのみであって、同じバイオチップにより小さなテスト領域を規定し得ることは明らかである。展開例として、テスト領域５６および５８と同様のものを３つ同じチップに設けて、テスト血清ならびに陽性および陰性血清を同じバイオチップでテストできるようにしてもよい。さらに、対応する数の穴を備えた好適な仕切りとともにさらなるテスト領域をもバイオチップに規定して、多数の患者のサンプルを同じバイオチップ上でテストできるようにしてもよい。
【０１３６】
さらなる例として、患者の抗体プロファイルを分析することによる急性感染症の診断のために抗ヒトＩｇＭおよび抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることを、実施例５に開示されるものに加えて多くの疾病に適用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１Ａ】この発明の１つの実施の形態に従った、固体基板の頂部図である。
【図１Ｂ】同じ実施の形態に従った、図１Ａに示す基板と相補な仕切りシートの頂部図である。
【図１Ｃ】図１Ｂに示す頂部仕切りシートが図１Ａに示す基板に装着された、この発明に従った装置の頂部平面図である。
【図１Ｄ】図１Ｃの線Ａ−Ａに沿った断面図である。
【図１Ｅ】図１Ｃに示す装置をカバーするための、同じ実施の形態に従ったカバーシートの図である。
【図２Ａ】この発明の第２の実施の形態に従った、基板の頂部図である。テスト部位の位置を点線円で示す。
【図２Ｂ】同じ実施の形態に従った、図２Ａに示す基板と相補な仕切りシートの頂部図である。
【図２Ｃ】固体基板の頂部表面に仕切りシートが装着された、この発明の第２の実施の形態に従った組み立てられた装置の頂部図である。やはり、テスト部位の位置を点線円で示す。
【図２Ｄ】図２Ｃの線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。
【図３Ａ】この発明の第３の実施の形態に従ったテスト領域を示す図である。
【図３Ｂ】この発明の第４の実施の形態に従ったテスト領域を示す図である。
【図４Ａ】１つの好ましい実施の形態に従った肝炎バイオチップの頂部図である。
【図４Ｂ】同じ好ましい実施の形態の、さまざまな肝炎抗体を検出するための肝炎タンパク質チップにおけるテスト領域の図である。６０：ヒトＩｇＧ陽性対照；６２：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）陰性対照；６４：ＨＡＶ Ａｇ；６６：ＨＣＶ Ａｇ；６８：ＨＤＶ Ａｇ；７０：ＨＢｓ Ａｇ；７２：ＨＢｅ Ａｇ；７４：ＨＢｃ Ａｇ；７６：ＨＥＶ Ａｇ。
【図４Ｃ】同じ好ましい実施の形態の、さまざまな肝炎抗体を検出するための肝炎タンパク質チップにおけるテスト領域の図である。６０ａ：ＨＢｓＡｇ陽性対照；６０ｂ：ＨＢｅＡｇ陽性対照；６０ｃ：ＡＦＰ陽性対照；６０ｄ：ＨＤＶＡｇ陽性対照；６２：陰性対照；７８：ＨＢｓ Ａｂ；８０：ＨＢｅ Ａｂ；８２：ＡＦＰ Ａｂ；８４：ＨＤＶ Ａｂ。
【図４Ｄ】図４Ａから図４Ｃに示すチップを用いた血清中に存在する抗ＨＡＶ−ＩｇＧでのＨＡＶ感染患者の診断の期待される結果の例を示す図である。チップの２つの領域を示す。
【図４Ｅ】図４Ａから図４Ｃに示すチップを用いたＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂを含む血清でのＨＢＶ感染患者の診断の期待される結果の例を示す図である。チップの２つの領域を示す。
【図５Ａ】この発明のさらなる好ましい実施の形態に従ったＴｏＲＣＨタンパク質チップのテスト領域を示す図である。８６：トキソプラズマ；８８：風疹ウイルス；９０：ＣＭＶ；９２：ＨＳＶ１；９４：ＨＳＶ２；９６：陽性対照；９８：陰性対照。
【図５Ｂ】ＴｏＲＣＨタンパク質チップを用いた、風疹ウイルス感染患者の診断における図５Ａの期待される結果の例を示す図である（図示をわかりやすくするために、１つのテスト領域またはウェルのみを示す；ＲＶ ＩｇＧを含む患者血清を用いてテストを行なった）。
【図５Ｃ】ＣＭＶ感染患者の診断における図５Ｂの結果の例を示す図である（図示をわかりやすくするために、１つのテスト領域またはウェルのみを示す；ＣＭＶ ＩｇＭを含む患者血清を用いてテストを行なった）。
【図６Ａ】この発明のさらに別に実施の形態に従った、ガンタンパク質チップのテスト領域を示す図である。
【図６Ｂ】患者の血清を用いた肝臓ガン患者の診断における図６Ａの期待される結果の例を示す図である。
【図７Ａ】自己免疫疾患タンパク質チップのテスト領域を示す図である。
【図７Ｂ】自己免疫疾患タンパク質チップを用いた全身性エリテマトーデスの診断における図７Ａの期待される結果の例を示す図である（図示をわかりやすくするために、１つのテスト領域のみを示す）。
【図７Ｃ】自己免疫疾患タンパク質チップを用いたリウマチ様関節炎の患者の診断における図７Ａの期待される結果の例を示す図である。（図示をわかりやすくするために、１つのテスト領域のみを示す）。
【０００１】
発明の分野
この発明は、サンプル中の１つ以上のアナライトを検出するための、および／または定量化するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
さまざまな疾病および人体の症状を検出するための、診断用テスト装置が多くの論文および特許文献に記載されている。治療および診断の発展とともに、疾病症状の早期診断のために人体の健康状態を観察することが、ますます重要になった。同じサンプル中の異なったアナライトをテストできる機能は、多くの者が追求している目標である。理想的には、必要な試薬および人的資源を節約するために、単一のテスト装置を用いた単一のサンプルを分析するための方法が、多数のアナライトについての診断用情報をもたらすべきである。
【０００３】
ウーデンバーグ（Woudenberg）他の特許文献１は、１つ以上のサンプルアナライトの存在または不在についてサンプルを同時にテストするための方法および装置に向けられる。装置は、一連のチャンバを有し、かつ各チャンバがアナライトと反応するのに有効である特定の試薬を有する、サンプル分配ネットワークを規定する基板を有すると記載される。上述のシステムを用いて多数のアナライトを分析し得るかもしれないが、装置はこのために特に固体の基板が製造されることが必要になるであろういくつものチャンバおよび溝を有する。
【０００４】
フィツジェラルド（Fitzgerald）他の特許文献２は、基板と多数の離散した反応部位とがリガンドで共有結合される、多数のアナライトアッセイを行なう固体状態の装置を記載する。この出願は、分析されるべきサンプルを収容するためのさまざまな溝およびチャンバを備えた装置を開示する。この発明はさらに、多数のアナライトを有するフォーマットにおける異なったアナライトを同時に検出するための統合された分析システムを提供する。
【０００５】
上述のシステムはサンプルから多数のアナライトを分析することが可能であるが、装置を製造するためのおよびサンプルをテストするためのコストを削減する改良されたシステムを提供する必要性が引き続き存在する。また、サンプルおよび試薬の量を減じる必要性もある。
【特許文献１】
米国特許第６１２６８９９号明細書
【特許文献２】
欧州特許出願第ＥＰ０８７４２４２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、この発明の目的は、多数のアナライトに対する改良された診断システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
この発明の一局面に従うと、少なくとも１つのサンプルにおける多数のアナライトを検出するための装置が提供される。装置は、テスト表面を備えた固体基板を含む。テスト表面上には、少なくとも１アレイの離散テスト部位を含む少なくとも１つの反応領域が規定される。これらの各テスト部位上にはテスト分子が固定され、異なったテスト部位上には異なったテスト分子が固定され得る。固体基板に装着するための仕切りが設けられる。仕切りは、装着表面に設けられる複数の穴を含む。装着表面は、固体装置のテスト表面と相補なものであり、かつ２つの部品が組み立てられたときに各穴がテスト表面の部分と接合して複数の漏れが防止されたチャンバを作るように、リバーシブルにテスト表面に装着されるよう適合される。チャンバ内のテスト表面は、チャンバ内に露出する複数のテスト部位を含む。各チャンバは、好ましくはチャンバに導入される流体がテストのために露出したテスト部位と接触するように、外部からアクセス可能である開口部を設けられる。
【０００８】
好ましい実施の形態においては、チャンバは、底としての役割を果たす固体基板のテスト表面と、保持壁としての役割を果たす仕切りの一部とによって作られるウェルであり、それにより、複数のテスト部位がチャンバ内のウェルの底に露出する。
【０００９】
この発明の別の局面においては、テスト分子は少なくとも１つのリガンドと少なくとも１つの抗体とからなる。同じサンプル内の対応の交差反応するアナライトの結合反応が同じ反応領域内で同時に達成されるように、リガンドは１つのテスト部位に固定され、抗体は同じチャンバ内の異なったテスト部位に固定される。
【００１０】
この検出装置の好ましい実施の形態においては、固体基板は複数の反応領域が規定された平坦な頂部表面を備えたチップである。各テスト領域は、テスト分子が固定された少なくとも１アレイの離散テスト部位を含む。仕切りは、フレームによって規定される穴を有するシートであって、各穴は反応領域に対応する。シートのフレームは、チップの平坦表面との間に漏れが防止されたウェルが作られるように、チップの平坦表面とのリバーシブルな結合に対して適合される。結合は、これに限定されるものではないが、クリップおよびねじなどの機械的手段、ならびに、にかわおよび接着剤などの化学的手段を含むどのような従来の手段を用いて行われてもよい。各ウェル内に、チップの頂部表面の１つの反応領域はウェルの底を形成し、シートのフレームの対応の部分はウェルの間の仕切り壁を形成する。シートは、サンプル反応の後でシートを取り外してチップを結果読出および分析のために標準チップリーダに挿入できるよう、取り外し可能である。この好ましい実施の形態の１つの利点は、多くの標準チップリーダをテスト結果の分析のために用い得ることである。取り外し可能仕切りシートは、チップに装着されると、異なったサンプルの反応が生じ得るウェルのシステムを含む組み立てられた装置を形成する。ウェルの数は、ユーザの要件と、それに従って製作された必要な穴を備えた仕切りシートとに従って決定することができる。この発明は、標準チップフォーマットにおいて多数のアナライトおよびサンプルを検出するための真に多用途のバイオチップおよび方法を提供した。
【００１１】
この発明の別の局面に従うと、同じサンプル内の多数のアナライトを分析するための方法が提供される。方法は、テスト表面上に、複数の離散した、および空間的に離れたテスト部位を規定するステップと、複数のテスト分子が固定されるように、１つのテスト分子を各テスト部位に固定するステップとを含む。次いで各テスト領域の周りの流体防止バリアが作られ、分析のためのサンプルが適切なテスト試薬とともに各テスト領域に加えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
詳細な説明
ここでの定義では、サンプルは、これらに限定するものではないが、テストされるべきいかなるアナライトをも含む、いかなる溶液、混合物または生物学的流体をも含む。サンプルは、陽性対照血清と、陰性対照血清と、生物学的流体とを含む。漏れが防止されたチャンバは、流体の体積がチャンバのサイズで収容されるように適合されていれば、チャンバが漏れやこぼれなしに少なくとも１方向において流体を保持可能であることを意味する。漏れが防止されたチャンバは、封鎖された構造または開口部を備えた構造を含む。リガンドは、抗体−抗原結合反応において抗体と反応可能であるいかなる抗原または分子、酵素−基板結合反応における基板、またはこれらに限定するものではないが、核酸、染色体断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、脂質、ポリペプチド、抗生物質、ステロイドおよび他の有機分子を含む、受容体によって認識され結合されることができる分子をも指す。
【００１３】
この発明の好ましい実施の形態において、図１Ａから図１Ｄを参照して、ガラススライド２０からなるバイオチップには分離頂部仕切りシート２２が設けられる。図１Ｂに示される仕切りシート２２は、どのような不活性な物質からなってもよく、好ましくはプラスチック、メンブレン、ラテックス、セラミック、ゴム、樹脂、ＰＶＣまたはシリコンなどの可撓性材料からなる。穴２２ａが、フレーム２２ｂが各穴の周りに形成されるように、仕切りシートに打抜かれる。するとフレーム２２ｂは側壁としての役割を果たし、スライドの頂部表面は底としての役割を果たして、図１Ｄに示すように、それらの間にウェルまたはチャンバ２４を形成する。頂部仕切りシートのサイズは、好ましくはスライドと同じ寸法であるか、または僅かに短く、ガラススライド２０に直接にかわ付けされるように、下側ににかわを含む。好ましい実施の形態においては、にかわは頂部仕切りシートをガラススライドに装着させてそれらの間にウェル２４を形成させるのに十分に強度がある。ウェルは、適切な量の流体が各ウェルに加えられた場合に流体が接合する領域を通って隣接するウェルに流れ込まないように、漏れを防止するべきである。にかわはまた、不活性であって、ユーザの都合で仕切りシートをスライドから取り外すことを可能にする材料からなるべきである。テスト部位の各アレイにおける行または列の数は、ユーザの必要性に応じてさまざまであり得る。仕切りシートの厚さは、各ウェルにおいて要求される反応の量に依存し、過度の実験を行なうことなく当業者が決定し得る。たとえば、シートは１〜３ｍｍ厚さであり得る。穴およびフレームは、ユーザの必要性に応じたどのようなサイズまたは形状でもあり得る。例示のために、内径が０．３ｃｍ×０．３ｃｍ〜０．４ｃｍ×０．６ｃｍ〜１．２ｃｍ×１．２ｃｍの穴を用い得る。２２ｂまたは３４ａなどの仕切り壁の幅は、０．１５ｃｍから０．６ｃｍに渡り得る。従って穴の数もさまざまであってよく、たとえば１×２、２×３、３×１０、３×５、２×５、３×８および４×８アレイフォーマットである。
【００１４】
最も簡単な実施の形態においては、単一のテスト分子が、特定のウェルに対応するガラススライドの１つのテスト領域２０ａに固定され得る。たとえば、図１Ｂにおいて、穴Ｈ１の位置は、図１Ａに示されるテスト領域ＴＡ１の位置に対応するであろう。頂部仕切りシートがスライド２０上に装着されてにかわ付けされた場合に、ウェルＷ１が形成され、そのウェルの底が図１Ｃに示すテスト領域ＴＡ１に対応するように、１つのテスト分子がテスト領域ＴＡ１上に固定される。この特定の例においてはテスト分子は１つしかなく、従って各テスト領域内には１つのテスト部位しかない。図１Ｅに示すように任意のカバーシート２１もまた、結合反応のインキュベーションの間に溶液を覆って蒸発、こぼれまたは汚染を防ぐために仕切りの外側表面上に置くことができる蓋として設けられる。するとカバーシートは、ユーザの必要に応じて取り除くことができる。カバーシートは仕切りのために用いられる材料などの、どのような不活性材料から作られてもよい。例は、ポリエステルフィルムである。
【００１５】
別の実施の形態においては、複数のテスト分子が各チャンバまたはウェル内に見出されるように、複数のテスト部位が各テスト領域に規定される。まず図２Ａを参照して、この発明に従った別のガラススライド２９がその上に２つのテスト領域を規定されて示される。各テスト領域は、点線の矩形として示される。各テスト領域内にあるのは、３×３アレイに規定されて円形で示されるテスト部位３２である。図２Ｂは、２つのより大きな穴３６が打ち抜かれた相補的仕切りシート３４を示す。シートの残りはフレーム３４ａを形成する。図２Ｃおよび図２Ｄは、２つの大きなウェル４０が仕切り３４とガラススライド２９との間に形成された、この発明のこの実施の形態に従った組立てられた装置を示す。示される図から、この特定の例において、最大９つの異なったテスト分子を同じテスト領域に固定することができ、このフォーマットを用いて多数のアナライトを検出し得ることが明らかである。
【００１６】
図３Ａは、一方のテスト領域４１（１つのチャンバの底に対応）が９アレイの４×４テスト部位を含む、この発明の別の実施の形態を示す。図示をわかりやすくするために、他方のテスト領域および固体装置は図示しない。同様の種類の異なったチャンバまたはテスト領域がユーザの要件に応じて規定され得ることが明らかである。さらに、同じテスト表面上の異なったテスト領域が異なったテスト部位配置を有してもよい。この例においては、白抜き円４２はアッセイ分子が固定されたテスト部位を規定する一方、塗りつぶし円４４は陽性対照分子が固定された陽性対照部位である。点線円４６は陰性対照が固定されたテスト部位を規定する。陽性対照分子はサンプル中に存在することがわかっているアナライトと反応することが期待される一方、陰性の方はサンプル中のどのアナライトとも反応することが期待されないテスト分子を含む。アッセイ分子は、サンプル中未知のレベルでアナライト（説明をわかりやすくするためにアッセイアナライトと称する）と交差反応するものである。アッセイアナライトは診断用テストの対象である。この例のこの単一のテスト領域（すなわち単一ウェル）は、３行の４×４アレイのテスト部位（行ＡからＣ）および３列の４×４アレイのテスト部位（列ＡからＣ）を含む。アレイＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＣ１は同一である。陽性対照およびアッセイ分子は補間的な位置に配置される。陰性対照はアレイＣ２およびＣ３のテスト部位に固定される。ウェル４１の全体が、すべてのテスト部位に対する反応が同時に、かつ同じ反応領域内で生じるように、１つのサンプルを受けるように適合される。こうしてこの例においては、３つの異なったテスト分子が、分析のために同じテスト領域に固定される。さらに、テスト分子ごとにテスト部位を多数繰返すことは、極めて正確な検出を行なうことを可能にする。
【００１７】
上述の例はアレイＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＣ３に同じ３つのアッセイ分子が同一のフォーマットで配置されるのを示すが、異なったアッセイ分子が同じ反応領域におけるこれらのアレイの各々に固定されてもよいことは明らかである。たとえば、１つのアッセイ分子（たとえば陽性対照分子）がアレイＡ１の８つの反応部位に固定される一方、第２のおよび異なったアッセイ分子（たとえば陰性アッセイ分子）がアレイＢ３の８つの反応部位に固定されてもよい。さらに、所望のレベルの精度をもたらすために要求される重複の数に依存して、さまざまな異なったアッセイ分子がこれらの７つのアレイに固定されてもよいことは明らかである。
【００１８】
図３Ｂは、１つのウェルまたはチャンバに対応するテスト領域４８が、４つの四半分に囲まれる中心行および中心列を有する９×９アレイを含む、この発明の別の実施の形態を示す。陰性対照５４は中心列および中心行に沿って「十字（cross）」または十字型（cruciform）構成に固定される一方、陽性対照５０およびアッセイ分子５２は４つの四半分内に補間的な位置で配置される。このフォーマットを使用すれば、陰性対照が期待通りに無のまたは低い信号を生じる成功した実験例においては、４つの四半分がはっきりと解明されることは明らかである。こうして、このフォーマットには、簡単な目視検査によってさえも明らかで曖昧さのない結果をもたらす利点がある。
【００１９】
以下の実施例は、この発明のさまざまな特定の実施の形態を示し、本発明を実施し使用することを当業者に教示することを意味するものである。これらの実施例は例示のみを意味し、前掲の特許請求の範囲を限定することを意図しない。以下の実施例においては、テスト分子はプローブまたはマーカーとも称する。テスト領域はしばしば、グリッドと称し、テスト部位はサブグリッドと称する。
【００２０】
実施例１
リガンドをテスト部位に固定する方法
マイクロアレイヤーによって微小サイズの固体基板上に予め定められたグリッドおよびサブグリッドパターンでプローブをプリントおよび固定することにより、タンパク質チップを調製した。プローブは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの形の抗原であっても抗体であってもよく、テストサンプル中のターゲットタンパク質に結合することが可能である。マイクロ固体基板はガラス顕微鏡スライド由来物、ニトロセルロースメンブレン、またはシリカであり得る。ガラス基板の１ｃｍ×１ｃｍ面積ごとに２３９０個のタンパク質スポットをプリントし得る。反応において用いられたサンプルは、プラズマ、血清、血液または他の体液の形であり得る。全反応工程は固体基板上でそのままの場所で行なわれる。
【００２１】
バイオチップの作製：
１．適切な希釈溶液中のプローブを、ソースプレートとしても公知であるマイクロタイタープレートの個々のウェルに加える。
【００２２】
２．ソースプレートをロボットマイクロアレイヤー（米国カリフォルニア州Cartesian TechnologyのProsys4510）の適切なスロットに置く。
【００２３】
３．ソフトウェアがマイクロアレイピンを制御してソースプレートからサンプルを引出す。
【００２４】
４．スライドの表面にサンプルを満たしたピンを置くことにより、顕微鏡スライド由来物上にサンプルがプリントされる。
【００２５】
５．プリントされたバイオチップを３７℃で１時間インキュベートしてタンパク質プローブを基板表面に固定する。
【００２６】
６．基板の残りの表面をＴＢＳ緩衝剤（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびTween 20によって３７℃で１時間ブロックする。
【００２７】
７．二回蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させる。
【００２８】
８．バイオチップを０．３％水酸化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）で３７℃で５〜１０分間インキュベートし、ガラス表面の遊離アルデヒド基を減じる。
【００２９】
９．二回蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させる。
【００３０】
１０．作製されたバイオチップを４℃の暗所で密封する。
【００３１】
装置の組立て方法：
１．マルチチャンバプラスチック装置（仕切りシート）を作るためのプラスチック材料の外側寸法は、固体基板の外側寸法と一致するべきである。
【００３２】
２．装置ごとのチャンバの数は１×２から４×１０の範囲にわたり得る。
【００３３】
３．２つの隣接するチャンバの各々の中心間の距離は、４．５ｍｍの倍数であり、これは３８４および９６マイクロタイタープレートのジオメトリ、マイクロアレイのピンヘッドのピン距離およびマルチチャネルピペットマンと一致する。
【００３４】
４．各チャンバの深さを決定するプラスチックの厚さは少なくとも１ｍｍであるべきで、１〜３ｍｍの範囲にわたり得る。
【００３５】
５．マルチチャンバプラスチック装置の一方は粘着性があるべきで、固体基板にしっかりと接着することができ、反応のための漏れが防止されたウェルを形成する。そのような装置は、水性溶液に浸され水圧下で用いられた場合に、耐水性があり、漏れが防止され、剛性があり、かつ不活性であるべきである。
【００３６】
６．タンパク質プローブは、多数のマーカー、多数の標本の用途のためのバイオチップ作製のために、各チャンバ上にマイクロアレイ化される。
【００３７】
７．マルチチャンバプラスチック装置の外側寸法と一致するサイズであり、片側に接着部を備えるポリエステルフィルムを、任意でマルチチャンババイオチップを覆うために用いて、ウェルで隔離され封鎖された反応のためのチャンバを形成する。
【００３８】
８．マルチチャンババイオチップにおける完全なセットアップは−４０°〜９５℃の反応温度、ＵＶ処理に耐えることができ、耐水性がある。
【００３９】
９．ポリエステルフィルムとマルチチャンバ装置のプラスチックとの間の結合は、装置と固体基板との間の結合よりも弱いべきである。各反応ステップにおけるフィルムの除去は、マルチチャンババイオチップの構造を変更してはならない。
【００４０】
１０．反応が完了すると、従来のマイクロアレイスキャナ（Scanarray4000、Packard Bioscience（現在はPerkinElmer Life Sciences）、米国コネティカット州）で分析するために、プラスチック装置を固体基板からはずし得る。タンパク質の固体基板への固定は、物理的相互作用、たとえば帯電により（たとえば負に帯電したタンパク質が正に帯電したメンブレンまたは正に帯電した金属表面と結合する）、疎水性相互作用により（疎水性タンパク質が疎水性メンブレンと結合する）、滞留により（ある大きさのタンパク質が、メンブレンのまたはゲルタイプの基板などの多孔性基板によって妨げられる）、または化学相互作用（たとえば、エポキシスライド、シラン化スライド、シリル化スライドとの結合）により達成されてもよい。
【００４１】
実施例２
バイオチップ上に固定された交差反応抗原を用いたヒト血清中の抗体を検出する方法
反応および検出：
１．バイオチップをパッケージから取出す。
【００４２】
２．テストサンプル（患者サンプル、陽性および陰性血清対照）を別々に、バイオチップ内の個々のチャンバに加え、３７℃で１時間反応させる。
【００４３】
３．結合していない反応物をＰＢＳまたはＴＢＳなどのナトリウム塩を含む洗浄緩衝剤で洗浄する（ＰＢＳ：０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、０．００４３Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２０、０．００１４Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）（ＴＢＳ：０．００２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）。
【００４４】
４．余分な緩衝剤を除去して５分間室温で乾燥させる。
【００４５】
５．ブロック溶液（ＴＢＳまたはＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン）をバイオチップに加える。
【００４６】
６．バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【００４７】
７．蛍光標識した化合物（二次抗体または抗原）をブロック溶液で希釈し、バイオチップに加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００４８】
８．洗浄してバイオチップから仕切りシートを取り除き、遠心脱水する。
【００４９】
９．画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの蛍光強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【００５０】
別の実施の形態においては、上述のステップ７〜９は、以下のステップ７ａ〜１３ａに置きかえられる。
【００５１】
７ａ．ビオチン結合二次抗体をブロック溶液で希釈し、バイオチップに加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００５２】
８ａ．バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【００５３】
９ａ．ブロック溶液中のストレプトアビジン分子を加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００５４】
１０ａ．洗浄して乾燥させる。
【００５５】
１１ａ．ブロック溶液で蛍光化合物（ビオチンまたは抗ストレプトアビジン抗体）を希釈して３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００５６】
１２ａ．洗浄してバイオチップから仕切りシートを取り除き、遠心脱水する。
【００５７】
１３ａ．画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの蛍光強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【００５８】
実施例３
交差反応抗体を固定したチップを用いた抗原の検出方法
反応および検出：
１．バイオチップをパッケージから取出す。
【００５９】
２．テストサンプル（患者血清、陽性および陰性血清対照）をバイオチップに加え、３７℃で１時間反応させる。
【００６０】
３．結合していない反応物をＰＢＳまたはＴＢＳなどのナトリウム塩を含む洗浄緩衝剤で洗浄する（ＰＢＳ：０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、０．００４３Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２０、０．００１４Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）（ＴＢＳ：０．００２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）。
【００６１】
４．余分な緩衝剤を除去して５分間室温で軽く乾燥させる。
【００６２】
５．ブロック溶液（ＴＢＳまたはＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン）をバイオチップに加える。
【００６３】
６．バイオチップを洗浄して乾燥させる。
【００６４】
７．ブロック溶液で希釈した２番目の一次抗体をバイオチップに加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００６５】
８．洗浄し、遠心脱水して再びブロックする。
【００６６】
９．ブロック溶液で希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（二次抗体）を加えて３７℃で０．５時間インキュベートする。
【００６７】
１０．適切な化学ルミネセンス基板（ICN Biomedicals Inc（米国カリフォルニア州）のＨＲＰのためのルミノール、または、Pierce Chemical Company（米国イリノイ州）のＡＰのための１，２−ジオキセタン系基板）を加えて室温で１分間インキュベートする（製造元のマニュアルに従う）。
【００６８】
１１．画像をマイクロアレイスキャナでスキャンする。各スポットの化学ルミネセンス強度を記録し、データ分析および診断に用いる。
【００６９】
実施例４Ａ
ヒト血清中の肝炎の診断
この実施の形態は、タンパク質チップの作製と、肝炎ウイルス感染によって引き起こされる急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、および肝臓ガンの診断における、その適用とを含む。
【００７０】
Ａ型肝炎感染診断のためのマーカーは、Ａ型肝炎抗体（抗ＨＡＶ ＩｇＧまたはＩｇＭＡｂ）であり；Ｂ型肝炎についてはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎「ｅ」抗原（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎表面抗体（ＨＢｓＡｂ）、Ｂ型肝炎「ｅ」抗体（ＨＢｅＡｂ）、および肝炎コア抗体（ＨＢｃＡｂ）であり；Ｃ型肝炎についてはＣ型肝炎抗体（抗ＨＣＶ ＩｇＧまたはＩｇＭ）であり；Ｄ型肝炎についてはＤ型肝炎抗体（抗ＨＤＶ ＩｇＧまたはＩｇＭ）であり；Ｅ型肝炎についてはＥ型肝炎抗体（抗ＨＥＶ ＩｇＧまたはＩｇＭ）である。α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、肝臓ガン診断のためにバイオチップに含めるマーカーである。これらのマーカーに特異に反応し得るプローブまたはテスト分子を、バイオチップ作製の間に固体基板にプリントする。
【００７１】
テスト領域の例を図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、および図４Ｅに示す。この例はデータ分析のために同じチップ（図４Ａ）上の２つのテスト領域５６および５８に設けられる多数の繰返しを用いることを示す。これらのテスト領域は、このバイオチップ上にサンプル導入のために２つの対応する穴を備えた適切な仕切りが置かれた場合に、２つのウェルの底としての役割を果たす。この配置の利点は、以下の図面の説明から明らかとなるであろう。各テスト分子を多く繰返すと、データ分析における信頼性を高めデータ収集の間の地理的および機械ばらつきを最小化するので、各バイオチップ実験における精度を高める。さらに、以下に示す明確なパターンは，高密度アレイにおけるスポットの識別を容易にする。
【００７２】
この実施例においては、このバイオチップ上に規定される２つのテスト領域またはグリッド５６および５８がある。グリッドまたはテスト領域５６はテスト部位の７つのサブグリッドまたはアレイ５６ａを含む。各サブグリッド５６ａ内に、陽性対照およびアッセイ分子がアレイ構成になるよう多数繰返されて固定される。点線５６ｂは陰性対照が規定される多数のテスト部位の位置を表す。
【００７３】
図４Ｂを参照して、テスト領域またはグリッド５６がより詳細に示される。点線円６２は陰性対照を表すが、これは各サブグリッドの境界を描く行および列をわたって多数繰返してスポットされるのが見出される。各サブグリッドにおいて、陽性対照６０およびテスト分子（肝炎抗原の１つ）が固定される。各サブグリッドに固定されるテスト分子は異なった肝炎ウイルス抗原である。
【００７４】
たとえば、アレイＡ１には、ヒトＩｇＧを陽性対照６０とした、４×４配置の１６個のテスト部位があり；テスト分子Ａ型肝炎抗原（ＨＡＶ Ａｇ）６４が補間的に配置されて固定される。他の６個のアレイ（Ａ２−Ａ７）が示されるが、固定されるテスト分子のみが異なる（ＨＡＶ抗原６４、ＨＣＶ抗原６６、ＨＤＶ抗原６８、ＨＢｓ抗原７０、ＨＢｅＡｇ７２、ＨＢ抗原７４、およびＨＥＶ抗原７６が、それぞれサブグリッドＡ１〜Ａ７に固定される）。
【００７５】
図４Ｃに示されるテスト領域５８を参照すると、この領域のテスト部位配置はテスト領域５６とは異なる。テスト領域５８においては、陰性対照は図４Ａの線５８ａに沿ってテスト領域の中心を横切る十字形構成に配置される多数のテスト部位に固定される。陰性対照テスト部位の十字形構成は、テスト領域を４つの四半分に分割する。４つの他のアレイまたはサブグリッド（Ｂ１〜Ｂ４）がその周りに設けられる。図４Ｃに示すアレイＢ１内には、陽性対照Ｂ型肝炎表面抗原６０ａおよびテスト分子抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体（ＨＢｓＡｂ）７８は補間的関係で別々の離散した１６個のテスト部位に固定される。他の３つの四半分（Ｂ２〜Ｂ４）はそれぞれ、陽性対照Ｂ型肝炎ＢｅＡｇ６０ｂおよび抗Ｂ型肝炎「ｅ」抗体８０と、陽性対照ＡＦＰ６０ｃおよび抗ＡＦＰ抗体８２と、陽性対照Ｄ型肝炎ウイルス抗原６０ｄおよび抗Ｄ型肝炎ウイルス抗体８４とを含む。
【００７６】
結合反応のための方法
表１は、バイオチップ上のテスト分子ごとのスポット条件を示す。第２欄は、スポットのために用いられたタンパク質溶液の濃度を示し、第３欄は各スポットの推定サイズを示す。各テスト部位に実際に固定されたタンパク質の量は、各反応部位に半球状スポットが与えられたと仮定して推定される。全スポットを乾燥させて、ほとんどのタンパク質がテスト部位の表面に固定されたと考えられる。
【００７７】
【表１】
結合反応中に、患者の血清をそれぞれ実施例２および実施例３に説明した方法と同様の方法を用いてチャンバ５６および５８に加えた。この実施例においては、バイオチップには２つのテスト領域しか示されず、一方は肝炎抗体をテストするものであり、他方は血清中の肝炎抗原の存在をテストするものであるから、１つのテスト血清だけをテストできる。陽性および陰性対照血清などの他のテスト血清を、２つの別々で同様のバイオチップに与えて陰性および陽性結果を得ることができる。反応が完了した後で、チップをスキャンして各スポットからの蛍光信号強度を記録する。
【００７９】
実施例４Ｂ
多数のウェルを用いたヒト血清中の肝炎の診断
この実施例は、どのように実施例４Ａに説明したシステムを多数のウェルを含むバイオチップの使用に適合して、同じバイオチップでテストされ得るサンプルの数を増大させるかを示す。この実施例においては、図１Ａに示すもののような３行および８列のアレイが患者の肝炎の診断に用いられる。説明を容易にするために、テスト領域の行を上から下に向かって行Ａ、Ｂ、Ｃと称し、テスト領域の列をそれぞれ行１〜８と称する。この実施例においては、バイオチップの列１〜４内の１２個のテスト領域は、図４Ｂのテスト領域５６に示すものと同一のテスト部位を含む。列５〜８内の１２個のテスト領域は各々が図４Ｃのテスト領域５８に見出されるものと同一のテスト部位のアレイを含む。この配置を用いて、血清中の肝炎抗原の診断のために、合計１２個のテスト領域（すなわちウェル）があることが明らかにわかる。この実施例においては、既知の肝炎感染の患者から得られた陽性対照血清がテスト領域Ａ１に加えられる。肝炎に感染していない健康な個人から得た陰性対照血清がウェルＢ１において診断的反応のために用いられる。残りの１０個のウェル（ウェルＡ２〜Ａ４、Ｂ２〜Ｂ４、およびＣ１〜Ｃ４）は肝炎抗原の存在が未知である患者の血清をテストするために用い得る。同様の態様で、陽性対照血清をウェルＡ５で用いて肝炎抗体に対する陽性対照を提供する一方、陰性対照血清をウェルＢ５に加え得る。残りのウェル（Ａ６〜Ａ８、Ｂ６〜Ｂ８、およびＣ５〜Ｃ８）は、未知の血清をテストするために用い得る。用いられる結合反応と検出システムは、実施例４Ａで説明したものと同様である。
【００８０】
結果分析の方法
Ｒ値＝９５％ガウス分布内に入るテストプローブの信号強度の平均値を、同じサブグリッド内の陽性対照プローブのもので除算したもの。
【００８１】
テストチャンバにおけるテストサンプルからのＲ値はＲｓである。
【００８２】
陽性参照チャンバにおける陽性対照サンプルからのＲ値はＲｐである。
【００８３】
陰性参照チャンバにおける陰性対照サンプルからのＲ値はＲｎである。
【００８４】
Ｒｃｏ＝１／２（Ｒｎ＋Ｒｐ）である。
【００８５】
データを解釈する３つのアプローチがある。
【００８６】
ａ．方法Ｉ：Ｒｓが０．０５よりも大きい個々のサンプルがテストプローブに対して陽性であると規定される；０．０２と０．０５との間のＲｓはボーダーラインであり、テストを繰返すべきである；０．０２よりも小さなものは陰性である。
【００８７】
ｂ．方法ＩＩ：Ｒｓ／Ｒｎが２．１よりも大きい個々のサンプルが陽性であると規定され、１．５と２．１との間のＲｓ／Ｒｎはボーダーラインであり；１．５よりも小さなＲｓ／Ｒｎは陰性である。
【００８８】
ｃ．方法ＩＩＩ：Ｒｃｏよりも大きいＲｓの個々のテストサンプルが陽性であり；Ｒｃｏよりも小さなものが陰性である。
【００８９】
この発明は、チャンバ内の、および同じチップにわたるチャンバ間のデータ比較を容易にする。マイクロアレイおよびデータ操作方法においてこの設計を用いることにより、信号強度に影響を与える恐れのある地理的ばらつきは最小化される。
【００９０】
上述の方法を採用して、中国国家薬品監督管理局（ＳＤＡ）から肝炎標準血清を得て、本件に従った方法および装置の精度および感度を調べるためにテスト血清として用いた。
【００９１】
中国における診断キットの精度および精密度を確実にするために、ＳＤＡは感度および特異度の標準を設定している。感度テストは、診断キットの最も弱い反応範囲を設定する。この発明に従った方法は、１００％の精度で感度テストに合格した。表２の第２欄は、中国国家薬品監督管理局から、臨床用途で中国で登録されているすべての診断キットの感度を調べるために用いなければならない参照サンプルとして提供されたサンプルを示す。ＨｂｓＡｇおよびＨｂｓＡｂについては、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｍＩＵ／ｍｌの参照標準をそれぞれ用いた。
【００９２】
【表２】
１．ＳＤＡ標準パネルキットロット番号９９０９
２．ＨｂｓＡＧ（Ｂ型肝炎表面抗原）；３．ＨＢｓＡｂ（Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体）；４．ＨＢｅＡｇ（Ｂ型肝炎「ｅ」抗原）；５．ＨｂｅＡｂ（Ｂ型肝炎「ｅ」抗原に対する抗体）；６．ＨｂｃＡｂ（Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体）。
【００９４】
【表３】
１．ＳＤＡ標準パネルキットロット番号９９０９
２．ＨｂｓＡＧ（Ｂ型肝炎表面抗原）；３．ＨｂｓＡｂ（Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体）；４．ＨＢｅＡｇ（Ｂ型肝炎「ｅ」抗原）；５．ＨｂｅＡｂ（Ｂ型肝炎「ｅ」抗原に対する抗体）；６．ＨｂｃＡｂ（Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体）。
【００９６】
上述のこれらの３つの方法を用いた結果をその次の３つの欄に示す。ＨｂｅＡｇ、ＨｂｅＡｂおよびＨｂｃＡｂについては、３つの別々の未知のサンプルがＳＤＡにより提供され、第２欄に示すように血清を希釈するためにさまざまな希釈剤を用いた（ＨｂｅＡｇについてはサンプル番号１、２および３；ＨｂｅＡｂについては番号５５、５７および６１；ＨｂｃＡｂについては番号２、３および４）。結合反応後の蛍光強度検出の結果を、次の対応の欄に示す。
【００９７】
表３は、ＳＤＡによって要求される特異度テストの結果を示す。これらのテストにおいて、第１欄に示すように、それぞれの抗原または抗体をテストするためにＳＤＡにより陰性血清が提供された。結果をその次のいくつかの欄に示す。第２欄において、分数の分母はＳＤＡによって提供されたサンプルの数を示し、比の分子は陰性と判定されたサンプルの数を示す。ＳＤＡ要件に従うと、偽陽性は許容できない。
【００９８】
こうして、この発明に従った方法を用いると、特異度は極めて高く、さまざまな非特異性抗原または抗体を備えた患者の血清の間に交差反応はほとんどない。
【００９９】
図４Ｄは、ＨＡＶ感染患者の期待される結果の例である。陽性信号は、テスト領域５６のみのテスト部位６４および両方のテスト領域５６および５８のすべての陽性対照で記録される。そのような結果は、テスト血清抗体が他のテスト分子ではなくＨＡＶ Ａｇに対して向けられ、テストの特異度が良好であることを示すであろう。
【０１００】
図４Ｅは、ＨＢＶ感染患者の期待される結果の例である。陽性信号がテスト領域５６のテスト部位７４およびテスト領域５８のテスト部位７８および８０において；かつテスト領域５６およびテスト領域５８のすべての陽性対照において期待される。
【０１０１】
実施例５
妊娠患者の出産前テスト
この実施の形態は、出産前テスト目的での妊婦の血清をテストするために用いるべきバイオチップを説明する。集合的にＴｏＲＣＨとして公知であるトキソプラズマ、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ならびにＩ型およびＩＩ型単純ヘルペスウイルスについて、これらの疾病の罹患率が高い妊婦の検診が定期的に行なわれる。疾病は妊娠中または出産時に胎児に伝染し、新生児に重篤な障害をもたらす。これらの合併症のために、妊婦および妊娠可能年齢の女性の免疫状態を評価することは重要である。５つのＴｏＲＣＨマーカーについて特異的である抗原に対応するプローブならびに陽性および陰性対照が、上述のようにマルチチャンバチップの上にプリントされる。バイオチップは、それぞれのチャンバに蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体または蛍光標識した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかを加えることにより、近接するチャンバにおいてＩｇＧおよびＩｇＭを同時に検出することを可能にする。ＴｏＲＣＨ診断におけるＩｇＭの検出は、疾病の早期診断を可能にするが、なぜならばＩｇＭは感染の直後に生成する抗体である一方、ＩｇＧはより長いラグタイムの後で生成されるからである。しかしながらＩｇＧ標識は、感染症が治癒した後でさえもより長い期間に渡って高く留まる。よって、患者の血清中の高いレベルのＩｇＭと低いレベルのＩｇＧとの組合せは、進行中の急性感染症を示す。
【０１０２】
方法：
１．トキソプラズマから分離された抗原に対応するプローブ８６、風疹ウイルス８８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）９０ならびに単純ヘルペスウイルスＩ型９２およびＩＩ型９４、ヒトＩｇＧ陽性対照９６およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）陰性対照９８を、３×３アレイにまたは図５Ａに示すように配置されるテスト部位に繰返しプリントする。これらの異なったサブグリッドを、適切な仕切りを上に装着した場合に単一のウェルに見出される同じテスト領域１００内に規定する。好ましい実施の形態においては、この実施例のバイオチップは図５Ａに示すものと同一である８個のテスト領域を含む。２つのテストされた領域を陽性血清でのインキュベーションに用いる一方、他の２つを陰性対照血清のために用いる。すると、患者の血清をさらに２つ、このバイオチップで重複してテストし得る。
【０１０３】
２．実施例２に記載の通り、固定、乾燥、ブロック、反応、洗浄を行なう。
【０１０４】
３．血清中のＴｏＲＣＨ ＩｇＧを検出するために、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を、上述のように血清でインキュベートしたウェルの１つに用いる。
【０１０５】
４．ＴｏＲＣＨ ＩｇＭを検出するために、蛍光標識した抗ヒトＩｇＭ抗体をそれぞれの血清で以前にインキュベートしておいた重複ウェルに加える。
【０１０６】
５．図５Ｂは風疹ウイルス感染患者からの血清を用いたアッセイの実験結果を示す。陽性信号はテスト分子８８および陽性対照９６において検出可能であった。
【０１０７】
６．図５ＣはＣＭＶ感染患者の血清を用いたアッセイの実験結果を示す。陽性信号はテスト分子９０および陽性対照９６において検出可能であった。
【０１０８】
実施例６
汎用増幅システムとしてのストレプトアビジン／ビオチンシステムの使用
この実施の形態は、タンパク質チップ分析における増強された報告システムとして蛍光／酵素標識したストレプトアビジンおよびビオチン方法（ＦＬＳＡＢ／ＥＬＳＡＢ）を用いる。現在のタンパク質チップ技術においては、蛍光または酵素結合抗体が報告システムにおいて一般に用いられる。この実施の形態はこの報告システムに信号増幅ステップを導入する。この増幅システムを用いると、タンパク質チップの感度は１０倍に増大する。従って、プリントにより少ない量のプローブを用い得る。これにより、バックグラウンドが低減され、信号対ノイズ比は向上し、偽陽性結果の可能性は最小化される。これは酸性タンパク質への蛍光染色標識における困難なステップを省略することをも容易にする。
【０１０９】
タンパク質チップの作製：
１．アルデヒドスライド、ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンなどの固体基板上にタンパク質プローブをアレイする。
【０１１０】
２．スライド上のタンパク質プローブを室温で一晩、または３７℃で１時間乾燥させて固定する。
【０１１１】
３．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝剤で基板表面を３７℃で１時間ブロックする。
【０１１２】
４．二回蒸留水で洗浄し、乾燥させて室温で保存する。
【０１１３】
方法：
１．標本サンプルをタンパク質チップの各チャンバに加えて３７℃で１時間インキュベートする。
【０１１４】
２．余分な標本を洗浄緩衝剤で洗浄して、遠心脱水する。
【０１１５】
３．上述のようにチップをブロック緩衝剤でブロックして洗浄緩衝剤で洗浄する。
【０１１６】
４．洗浄して遠心脱水する。
【０１１７】
５．ターゲットマーカーに特異的に結合するビオチン結合生体分子をブロック緩衝剤で希釈して各チャンバに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１１８】
６．洗浄して遠心脱水する。
【０１１９】
７．ストレプトアビジンをブロック緩衝剤で希釈してチップに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１２０】
８．洗浄して遠心脱水する。
【０１２１】
９．ブロック緩衝剤で希釈した酵素アルカリペルオキシダーゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、または蛍光結合ビオチンをチップに加えて暗所で３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１２２】
１０．もし（９）で酵素結合ビオチンを用いるのであれば、適切な化学ルミネセンス基板である、Pierce Chemical Company（米国イリノイ州）のＨＲＰのためのルミノール、または、ICN Biomedicals Inc（米国カリフォルニア州）の１，２−ジオキセタン系基板を加えて室温で１分間インキュベートする（製造元のマニュアルに従う）。完了した後で、チップを洗浄して仕切りシートを取り除き、チップを遠心脱水してマイクロアレイスキャナでスキャンする。
【０１２３】
実施例７
ガン診断のための方法および装置
この実施の形態は、ガンのための高いスループットおよび高感度の診断方法およびバイオチップを説明する。このチップは、ガンの早期診断を可能にすると同時に、ガンのタイプおよびサブタイプを判断する。プローブは、組織特異腫瘍マーカーに対応する抗体であり；陽性対照は対応の腫瘍マーカーである。ヒト血清アルブミンは陰性対照である。
【０１２４】
ガンチップは、臓器／組織タイプに従ってカテゴリ化される。ガンチップの各タイプは、組織特異腫瘍マーカーに反応する抗体のパネルからなる。各抗体パネル内の発現プロファイルはガンをさらにサブタイプに分類することを可能にする。たとえば、γ−ＧＴＩ’、ＩＩ、ＩＩ’は肝臓ガンにしか見出されず；コンカナバリンＡ反応α−フェトプロテイン（Ｒ Ｃｏｎ Ａ ＡＦＰ）は主に原発性肝臓ガンの血清サンプルに見出される一方、続発性肝臓ガン、性腺および性腺外胚細胞腫瘍においては顕著にＲ Ｃｏｎ Ａ ＡＦＰが低減し無反応型が増大した。従って、ガンバイオチップにおいて腫瘍マーカーのパネルを用いるとガンの診断ならびに、タイプおよびサブタイプの分類が容易になる。
【０１２５】
図６Ａは、１６アレイ（Ａ１〜Ｄ４）のガンチップにおける１つのテスト領域を示す。各アレイは、同じテスト分子が固定された９個の離散したテスト部位を含む。アレイＡ１はテスト分子抗α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体をプリントされ；Ａ２は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）アイソザイムＩ抗体をプリントされ；Ａ３は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）アイソザイムＩ’抗体をプリントされ；Ａ４は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）アイソザイムＩＩ抗体をプリントされ；Ｂ１は抗γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）アイソザイムＩＩ’抗体をプリントされ；Ｂ２は抗des-γカルボキシプロトロンビン（ＤＰＣ）抗体をプリントされ；Ｂ３は抗α−Ｌ−フコシダーゼ抗体をプリントされ；Ｂ４は抗５’ヌクレオチドホスホジエステラーゼアイソザイムＶ抗体をプリントし；Ｃ１は抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ胎盤型抗体をプリントし；Ｃ２は抗α−１−抗トリプシン抗体をプリントし；Ｃ３は抗フェリチン抗体をプリントし；Ｃ４は抗酸性イソフェリチン（ＡＩＦ）抗体をプリントし；Ｄ１は抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体をプリントし；Ｄ２およびＤ３は１３種の腫瘍マーカーおよびヒトＩｇＧに対応する陽性対照をプリントし；Ｄ４は陰性対照をプリントする。
【０１２６】
図６Ｂは肝臓ガン患者から得られる診断結果の種類の例を示し、たとえば、アレイＡ１、Ａ３、Ａ４、Ａ５およびＤ１ならびに陽性対照Ｄ２およびＤ３において陽性信号が検出される。
【０１２７】
実施例９
自己免疫疾患の診断
自己免疫疾患は、患者の血清中に循環する高レベルのＩｇＭおよびＩｇＧ自己抗体の存在によって特徴付けられる。自己免疫疾患には２つのカテゴリがある：単器官または細胞タイプ、および全身性タイプである。前者の例は、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、すなわちＩｇＧ自己抗体およびＩｇＭ抗体が高まり、体が自身の赤血球（ＲＢＣ）を攻撃するもの；重症筋無力症、すなわちアセチルコリン受容体に対する自己抗体が高まり、患者が重篤な筋肉の弱化を被るもの；および橋本甲状腺炎、すなわち抗チログロブリン抗体および抗マイクロゾーム抗体が高まるもの、である。後者の例は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、すなわち抗核リボヌクレオタンパク質抗体（抗−ｄｓＤＮＡおよび抗ＳＭ）が検出されるもの；およびリウマチ様関節炎、すなわちリウマチ因子が検出されるもの、である。
【０１２８】
方法：
１．自己免疫タンパク質チップは患者の血清中の自己抗体を検出すべきものである。自己免疫疾患マーカーの抗原に対応するプローブを製作のためにマルチチャンバチップにプリントする。マーカーは抗核リボヌクレオタンパク質抗体、リウマチ因子、抗アセチルコリン受容体抗体、抗赤血球抗体、抗チログロブリン抗体および抗マイクロゾーム抗体である。
【０１２９】
図７Ａに、自己免疫診断タンパク質チップの設計の例を示す。同じテスト領域（組立てられた装置の１つのウェルまたはチャンバを代表する）内に、９個の離散したアレイ（Ａ１〜Ｃ３）を規定する。各アレイには、他のアレイとは互いに異なる１つのタイプの分子を固定する。同じアレイ内で、１６個のテスト部位（４×４）は同一のテスト分子を含む。Ａ１は二本鎖ＤＮＡ分子をプリントし；Ａ２はＳＭＩＴＨ抗原をプリントし；Ａ３はアセチルコリン受容体をプリントし；Ｂ１はチログロブリンをプリントし；Ｂ２はミクロゾーム抗原をプリントし；Ｂ３は異常ＩｇＧをプリントし；Ｃ１はヒトＩｇＧ陽性対照をプリントし；Ｃ２は陰性対照をプリントし；Ｃ３は赤血球をプリントする。ＳＭＩＴＨはＤＮＡを正しい形状に保つ助けをする、ＲＮＡおよび非ヒストン核タンパク質の複合体であり；細胞の溶解時にＤＮＡとともに血流中に放出されるものであって、ＳＬＥのマーカーである。
【０１３０】
２．自己免疫タンパク質チップは、間接的な免疫に基づくアッセイである。患者の血清を個々のチャンバに加える。上述の実施例８に記載のように、ＩｇＭの検出と比較してＩｇＧを検出するために、各血清を重複チャンバに加え得る。血清中の自己抗体は定常期プローブと反応する。洗浄後に、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体をチャンバに加えて交差反応ＩｇＧを検出する。
【０１３１】
３．交差反応二価または多価ＩｇＭを検出するために、二重抗原サンドイッチ法をも自己免疫タンパク質チップに適用し得る。血清との反応後に、蛍光標識抗原を反応チャンバに加えて検出する。
【０１３２】
４．反応が完了した後で、バイオチップをマイクロアレイスキャナでスキャンする。
【０１３３】
図７Ｂに全身性エリテマトーデス患者の診断結果の例を示す。陽性信号がテスト部位Ａ１およびＡ２、ならびに陽性対照部位Ｃ１に現れるであろう。
【０１３４】
図７Ｃにリューマチ様関節炎患者の診断結果の例を示す。陽性信号がテスト部位Ｂ３および陽性対照部位Ｃ１に現れるであろう。
【０１３５】
上述の特定の実施の形態についての詳細な説明は、例示および説明の目的で提供された。提供される教示に鑑みて多くの変形例および展開例が可能であるので、これは排他的であること、または開示される厳密な形に発明を限定することを意図しない。たとえば、図４Ａから図４Ｃに示す配置は例示のためのみであって、同じバイオチップにより小さなテスト領域を規定し得ることは明らかである。展開例として、テスト領域５６および５８と同様のものを３つ同じチップに設けて、テスト血清ならびに陽性および陰性血清を同じバイオチップでテストできるようにしてもよい。さらに、対応する数の穴を備えた好適な仕切りとともにさらなるテスト領域をもバイオチップに規定して、多数の患者のサンプルを同じバイオチップ上でテストできるようにしてもよい。
【０１３６】
さらなる例として、患者の抗体プロファイルを分析することによる急性感染症の診断のために抗ヒトＩｇＭおよび抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることを、実施例５に開示されるものに加えて多くの疾病に適用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１Ａ】この発明の１つの実施の形態に従った、固体基板の頂部図である。
【図１Ｂ】同じ実施の形態に従った、図１Ａに示す基板と相補な仕切りシートの頂部図である。
【図１Ｃ】図１Ｂに示す頂部仕切りシートが図１Ａに示す基板に装着された、この発明に従った装置の頂部平面図である。
【図１Ｄ】図１Ｃの線Ａ−Ａに沿った断面図である。
【図１Ｅ】図１Ｃに示す装置をカバーするための、同じ実施の形態に従ったカバーシートの図である。
【図２Ａ】この発明の第２の実施の形態に従った、基板の頂部図である。テスト部位の位置を点線円で示す。
【図２Ｂ】同じ実施の形態に従った、図２Ａに示す基板と相補な仕切りシートの頂部図である。
【図２Ｃ】固体基板の頂部表面に仕切りシートが装着された、この発明の第２の実施の形態に従った組み立てられた装置の頂部図である。やはり、テスト部位の位置を点線円で示す。
【図２Ｄ】図２Ｃの線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。
【図３Ａ】この発明の第３の実施の形態に従ったテスト領域を示す図である。
【図３Ｂ】この発明の第４の実施の形態に従ったテスト領域を示す図である。
【図４Ａ】１つの好ましい実施の形態に従った肝炎バイオチップの頂部図である。
【図４Ｂ】同じ好ましい実施の形態の、さまざまな肝炎抗体を検出するための肝炎タンパク質チップにおけるテスト領域の図である。６０：ヒトＩｇＧ陽性対照；６２：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）陰性対照；６４：ＨＡＶ Ａｇ；６６：ＨＣＶ Ａｇ；６８：ＨＤＶ Ａｇ；７０：ＨＢｓ Ａｇ；７２：ＨＢｅ Ａｇ；７４：ＨＢｃ Ａｇ；７６：ＨＥＶ Ａｇ。
【図４Ｃ】同じ好ましい実施の形態の、さまざまな肝炎抗体を検出するための肝炎タンパク質チップにおけるテスト領域の図である。６０ａ：ＨＢｓＡｇ陽性対照；６０ｂ：ＨＢｅＡｇ陽性対照；６０ｃ：ＡＦＰ陽性対照；６０ｄ：ＨＤＶＡｇ陽性対照；６２：陰性対照；７８：ＨＢｓ Ａｂ；８０：ＨＢｅ Ａｂ；８２：ＡＦＰ Ａｂ；８４：ＨＤＶ Ａｂ。
【図４Ｄ】図４Ａから図４Ｃに示すチップを用いた血清中に存在する抗ＨＡＶ−ＩｇＧでのＨＡＶ感染患者の診断の期待される結果の例を示す図である。チップの２つの領域を示す。
【図４Ｅ】図４Ａから図４Ｃに示すチップを用いたＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂを含む血清でのＨＢＶ感染患者の診断の期待される結果の例を示す図である。チップの２つの領域を示す。
【図５Ａ】この発明のさらなる好ましい実施の形態に従ったＴｏＲＣＨタンパク質チップのテスト領域を示す図である。８６：トキソプラズマ；８８：風疹ウイルス；９０：ＣＭＶ；９２：ＨＳＶ１；９４：ＨＳＶ２；９６：陽性対照；９８：陰性対照。
【図５Ｂ】ＴｏＲＣＨタンパク質チップを用いた、風疹ウイルス感染患者の診断における図５Ａの期待される結果の例を示す図である（図示をわかりやすくするために、１つのテスト領域またはウェルのみを示す；ＲＶ ＩｇＧを含む患者血清を用いてテストを行なった）。
【図５Ｃ】ＣＭＶ感染患者の診断における図５Ｂの結果の例を示す図である（図示をわかりやすくするために、１つのテスト領域またはウェルのみを示す；ＣＭＶ ＩｇＭを含む患者血清を用いてテストを行なった）。
【図６Ａ】この発明のさらに別に実施の形態に従った、ガンタンパク質チップのテスト領域を示す図である。
【図６Ｂ】患者の血清を用いた肝臓ガン患者の診断における図６Ａの期待される結果の例を示す図である。
【図７Ａ】自己免疫疾患タンパク質チップのテスト領域を示す図である。
【図７Ｂ】自己免疫疾患タンパク質チップを用いた全身性エリテマトーデスの診断における図７Ａの期待される結果の例を示す図である（図示をわかりやすくするために、１つのテスト領域のみを示す）。
【図７Ｃ】自己免疫疾患タンパク質チップを用いたリウマチ様関節炎の患者の診断における図７Ａの期待される結果の例を示す図である。（図示をわかりやすくするために、１つのテスト領域のみを示す）。
Claims (16)
- 固体基板と仕切りとを含む多数のアナライトを検出するための装置であって、前記基板は複数の離散したテスト部位が規定されたテスト表面を有し、各前記テスト部位はテスト分子を固定され、
前記仕切りは装着表面に設けられる予め定められた位置に複数の穴を有し、前記装着表面は前記テスト表面と相補的であって前記テスト表面への装着に対して適合され、前記仕切りは、各前記穴が前記テスト表面の一部と接合して複数の漏れが防止されたチャンバを作るように前記固体基板にリバーシブルに装着可能であり、前記チャンバ内の前記テスト表面はその中に露出する複数のテスト部位を有し、前記チャンバはさらに、前記チャンバに導入される流体がテストのために前記露出するテスト部位と接触するように外部からアクセス可能である開口部を有する、装置。 - 前記テスト分子は抗原または抗体である、請求項１に記載の装置。
- カバーが設けられ、前記カバーは、こぼれまたは異なったチャンバの溶液間の汚染を防止するために前記チャンバの前記開口部を閉鎖するよう適合されるカバー表面を有する、請求項１に記載の装置。
- 前記カバーはポリエステルシートである、請求項３に記載の装置。
- 多数のアナライトを検出するための装置であって、
（ａ） 平坦な表面を備えたチップを含み，前記平坦な表面には複数の反応領域が規定され、各前記反応領域はさらに、少なくとも１つのアレイの離散したテスト部位を含み、各前記テスト部位はテスト分子を固定され、さらに
（ｂ） フレーム内に規定される複数の穴を有する仕切りシートを含み、各前記穴は反応領域に対応し、前記フレームは、複数の漏れが防止されたウェルが前記平坦な表面との間に作られ、各反応領域が対応のウェルの底を形成し、かつ前記シートのフレームが近接するウェルとの間に仕切り壁を形成するように、前記平坦な表面とのリバーシブルな結合に対して適合される、装置。 - 前記テスト分子は抗原または抗体である、請求項５に記載の装置。
- サンプル中の多数のアナライトを分析するための方法であって、
（ａ） 複数の離散しかつ空間的に離れたテスト部位を、テスト表面の少なくとも１つのテスト領域に規定するステップと、
（ｂ） テスト分子を、複数のテスト分子が固定されるように、各前記テスト部位に固定するステップと、
（ｃ） 各前記テスト領域の周りに流体に耐性のあるバリアを設けるステップと、
（ｄ） 各前記テスト領域を分析のために適切なテスト試薬およびサンプルで接触するステップと、
（ｅ） 反応しないサンプルおよび試薬を除去するステップと、
（ｆ） 前記バリアを除去するステップと、
（ｇ） 前記サンプル内のアナライトと前記テスト分子との間の反応について前記テスト表面を分析するステップとを含む、方法。 - 請求項７に記載の同じサンプルからの多数のアナライトを分析する方法であって、前記テスト表面はチップの一方側であり、前記テスト分子は抗体またはリガンドであり、前記ステップ（ｄ）および（ｅ）はさらに、
前記サンプルを各テスト領域内に固定したテスト分子とインキュベートして前記アナライトをそこへ結合させるステップを含み、前記アナライトは交差反応リガンドまたは抗体であり、さらに
結合しない材料を除去するステップと、
前記反応領域に適切な二次分子の混合物を加えてそこでインキュベートするステップとを含み、各前記二次分子は信号分子を結合され、前記二次分子はさらに、適切なアナライトに特異的に結合するよう適合され、さらに
結合しない二次分子を除去するステップと、
各前記テスト部位の前記信号分子の存在を検出するステップとを含む、方法。 - 前記テスト分子はホルモン、薬剤、受容体、酵素、核酸、抗生物質またはリガンドである、請求項７に記載の方法。
- 前記二次分子は前記適切なアナライトと交差反応する二次抗体であり、前記信号分子は励起光子の励起の際に放出光子を放出可能である蛍光分子であり、前記信号分子の存在を検出するステップはさらに、前記信号分子を前記励起光で励起するステップと、蛍光検出器を用いた放出光子の放出を検出するために検出器を用いるステップとを含む、請求項７に記載の方法。
- 前記信号分子は酵素であり、前記信号分子の存在を検出するステップはさらに、前記酵素に適切な基板を与えてインキュベートするステップを含み、前記酵素は前記基板を、前記テスト部位に堆積される着色物に変換するよう適合される、請求項８に記載の方法。
- 前記二次分子は前記適切なアナライトと交差反応する二次抗体であり、前記信号分子はビオチンであり、前記信号分子の存在を検出するステップはさらに、前記信号分子をストレプトアビジンまたはアビジンで接触してそこへ結合させるステップと；結合しないストレプトアビジンまたはアビジンを除去するステップと；前記結合したストレプトアビジンまたはアビジンを二次ビオチンを含む溶液で接触するステップとを含み、前記二次ビオチンは蛍光分子と結合し、前記蛍光分子は放出光子を放出することが可能であり、さらに；前記チップに励起光子を照射するステップと、前記蛍光分子からの放出光子の放出を検出するために検出器を用いるステップとを含む、請求項８に記載の方法。
- 前記テスト分子は、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、Ｄ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎「ｅ」抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、Ｅ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体、Ｂ型肝炎「ｅ」抗原に対する抗体、α−フェトプロテイン抗原に対する抗体、およびＤ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
- 前記テスト分子は、トキソプラズマ、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルスおよびＩＩ型単純ヘルペスウイルスからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
- 前記テスト分子は、抗α−フェトプロテイン、抗γ−グルタミルトランスフェラーゼアイソザイムＩ抗体、抗γ−グルタミルトランスフェラーゼアイソザイムＩ’抗体、抗γ−グルタミルトランスフェラーゼアイソザイムＩＩ抗体、抗γ−グルタミルトランスフェラーゼアイソザイムＩＩ’抗体、抗des-γカルボキシプロトロンビン抗体、抗α−Ｌ−フコシダーゼ抗体、抗５’ヌクレオチドホスホジエステラーゼアイソザイムＶ抗体、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ胎盤型抗体、抗α−１−抗トリプシン抗体、抗フェリチン抗体、抗酸性イソフェリチン抗体、および抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
- 前記テスト分子は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＳＭＩＴＨ抗原、アセチルコリン受容体、チログロブリン、マイクロゾーム抗原、異常ヒトＩｇＧおよび赤血球タンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
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