CN104569417B - 一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒 - Google Patents

一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒。所述试剂盒包括：抗体芯片，包括标准组织玻片和在玻片表面上固定的20种急性肾损伤标志物的特异性抗体、三种阳性对照；急性肾损伤标志物标准品混合物，是将20种标准急性肾损伤标志物标准品按照一定的量混合在一起的冻干混合物；生物素标记的急性肾损伤标志物检测抗体混合物；和荧光素Cy3标记的链霉亲和素。本发明所述的试剂盒能够检测20个临床常用的急性肾损伤标志物，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。

Description

一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒。
背景技术
急性肾脏损伤（AcuteKidneyInjury,AKI），以前称为急性肾衰竭（acuterenalfailure，ARF）简称急肾衰，属临床危重症。该病是一种由多种病因引起的急性肾损害，可在数小时至数天内使肾单位调节功能急剧减退，以致不能维持体液电解质平衡和排泄代谢产物，而导致高血钾、代谢性酸中毒及急性尿毒症综合征，此综合征临床称为急性肾功能衰竭。它的主要病理改变是肾小管坏死；而急性肾小管坏死的具体发病过程尚未完全阐明。
虽然近几十年来，关于ARF病理生理及发病机制的研究取得了长足的进步，但ARF的死亡率仍居高下，几乎高达60%。迄今ARF的防治形势依然十分严峻。多数学者认为目前对于ARF的早期诊断、干预及重视不够。近年来，大量临床研究显示肾功能轻度损伤即可导致发病率及病死率的增加。故目前国际肾脏病和急救医学界趋向将急性肾衰竭改称为急性肾损伤（acutekidneyinjury,AKI）。期望尽量在ARF的早期，在肾小球的滤过率(GFR)开始下降、甚至肾脏有损伤（组织学、生物标志物改变）而GFR尚正常的阶段将之识别，以便及早干预。
缺乏早期诊断指标致使诊断及治疗延迟是急性肾损害至今死亡率仍高的一个重要原因。早期诊断指标应力求敏感、特异、简便，目前仍在努力寻找中。ADQI关于AKI诊断的建议指出,血肌酐和尿量是目前唯一可靠的检测指标，这两个指标也是目前AKI分期的依据。但是，血肌酐并非一个敏感的指标，而且从血肌酐代谢与分布的生理学来看，血肌酐不仅反映GFR，还受到其分布及排泄等综合作用的影响。已有的研究证实血肌酐的升高明显落后于肾脏本身的损伤。尿量更容易受到容量状态、药物等非肾脏因素影响。所以,寻找一种新的诊断AKI的蛋白质标记物以来代替传统的血肌酐和尿量的检测是降低AKI病人死亡率的关键；以求快速、早期诊断AKI,避免AKI转向晚期不可逆转的损伤阶段。
目前，包括NGAL，KIM-1，CystatinC，L-FABP，MCP-1等20种蛋白在血和/或尿中的表达的增加或含量的增高被认为与AKI的早期损伤有关。如NGAL在ICU的AKI病人的血和尿中显著的升高，其诊断的特异性和敏感性均超过90%。在肾缺血后2～6小时NGAL血浓度及尿排泄量即增加，是敏感、特异的急性肾损害早期诊断指标。肾脏损伤分子-1(KLM-1)：它能在上皮细胞黏附，生长及分化上起重要作用，急性肾损害致肾小管上皮细胞损伤后12小时内尿中KLM-1既增加，早于血肌酐的增加。
由于急性肾功能损伤的复杂性和多样性，单独检测一种生物标志物对其早期诊断和预测不太理想。因此，急需研制一种能够通过多指标检测进行准确的急性肾功能损伤早期诊断的方法和产品。
定量抗体芯片是基于夹心法ELISA技术，能让研究者准确、及时确定多种生物标志物的浓度，兼具ELISA方法的高灵敏度、特异性和芯片的高通量检测的优点。该技术是利用一对能与标志物特异性结合的抗体来进行检测，捕获抗体（一抗）先固定在玻片上，加入临床样本后进行孵育，目标标志物被捕获。加入生物素标记的二抗，它可以区分出目标标志物的不同类型。加入链霉亲和素标记的Cy3等效染料后，利用激光扫描可视化，可以检测标志物-抗体-生物素复合物。与传统的ELISA不同，采用的定量抗体芯片试剂通过在玻璃表面排列各种特异性标志物捕获抗体，可以在一个实验中检测多种生物标志物。该高通量高密度的抗体芯片技术，能用极其微量的标本，同时检测出成千上万个蛋白质。这种技术优越于其它能同时检测多个蛋白质的技术，具有灵敏度高，高效高速，需求标本量极低，成本低且能在普通实验室使用的优点。
发明内容
针对现有的需求，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的用于早期诊断急性肾损伤的抗体试剂盒。本发明所述的试剂盒能够检测20种特异的急性肾损伤早期诊断指标，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。本发明在临床诊断上的应用有助于确定在AKI早期诊断中最具有临床应用价值的蛋白或组合，并建立基于中国人群的域值，有利于更快更准确的诊断急性肾损伤。因此，寻求一种比单纯以血中肌酐的升高来判断肾功能损伤更为早期和合理临床诊断方法，有助于肾功能损伤的早期发现并采取预防措施，阻止肾脏进入不可逆的损伤阶段。同时，该发明可应用于肾脏药物毒性、心脏毒性的监测，临床药物的开发和肾脏移值排斥反应的监测。由此可见，本发明必将产生重大的临床和社会价值。
为了解决上述技术问题，本发明提供的一种用于用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒，包括：抗体芯片，包括标准组织玻片和在标准组织玻片表面上固定的20种急性肾损伤标志物的特异性抗体、三种阳性对照；急性肾损伤标志物标准品混合物，是将20种急性肾损伤标志物标准品按照一定的量混合在一起的冻干混合物；生物素标记的急性肾损伤标志物检测抗体混合物；荧光素Cy3标记的链霉亲和素。
在实际操作中，将冻干的急性肾损伤标志物标准品混合物复溶后经梯度稀释制备成系列不同急性肾损伤标志物浓度的混合液，用来制作多重夹心ELISA方法急性肾损伤标志物的标准曲线。
根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述抗体芯片的基片是由活性环氧基团包被的标准组织玻片，用2×8孔可拆卸型框架把玻片分割成16个互不干扰的点样小区；所述20种急性肾损伤标志物的特异性抗体是采用非接触性点样方式固定在每个点样小区内，每种特异性抗体、阳性对照均重复点样四次，以致在每个点样小区内形成8×9矩阵的微阵列。
根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述的抗体芯片是将100－1000pl的含0.02-20ng特异性抗体的PBS缓冲液（含有0.01-10g/100ml牛白蛋白）点样于所述玻片上，控制点样温度为70-75F，湿度为40-45%，将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，第二天真空抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装然后于2℃到8℃保存备用。
将100-1000pl的含0.02-2ng的特异性的抗体的PBS缓冲液（含有0.01-10g/100ml牛白蛋白）用全自动点样仪点样于玻片上。生物素标记的牛IgG作为阳性对照。每种抗体和三种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有四次的重复。每张玻片上有16个相同的芯片点阵。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装后于2℃到8℃保存备用。
根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，以三种不同浓度的生物素标记的小牛IgG作为阳性对照和作为不同微阵列间的标准化参照系。
根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述特异性抗体为选自针对如下20种急性肾损伤标志物的抗体：肾损伤分子1、白蛋白、骨桥蛋白、三叶因子3、β2-微球蛋白、丛生蛋白、趋化因子配体16、非转移性黑色素瘤糖蛋白B、肝脂肪酸结合蛋白、单核细胞趋化蛋白-1、可溶性肿瘤坏死因子受体1、钙结合蛋白-1、γ干扰素诱导蛋白10、胱抑素C、肝细胞生长因子、巨噬细胞移动抑制因子、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、基质金属酶组织抑制剂-1、血管细胞粘附蛋白1、血管内皮生在因子。
本发明所述的抗体芯片试剂盒通过类似于夹心法ELISA的检测方法，用含Cy3通道的激光扫描仪对反应结束的玻片进行扫描成像，选用合适的激光扫描参数使芯片上最高信号接近饱和，所得图像存储为tiff文件。然后用芯片读数软件将每个点的荧光信号转化为数码信号。通过梯度稀释的急性肾损伤标志物的标准样品的数码信号绘制每个急性肾损伤标志物的信号与浓度标准曲线，然后通过相应的标准曲线计算出每个急性肾损伤标志物在未知样品中的浓度。
本发明所述的用于用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒，具有以下特点和优点：
（1）在芯片的组成上，本发明采用活性环氧基团包被的标准组织玻片，实验表明，活性环氧基团包被的玻片可以更有效地吸附包被抗体在芯片的表面，并且使抗体的稳定性增加。
（2）在芯片的点样前采用特定的框架结构，优化了芯片点阵，使得样本可批量检测，操作简便，样本用量小，互不交叉污染。
（3）在芯片的制备工艺上，控制温度为70-75F，湿度为40-45%，这样的芯片可以改善点样的形态，使抗体在玻片上的分布更加均匀。同时，室温的过夜静置有利于抗体更有效地固定在玻片上。除此以外，真空抽气干燥2小时并用抗水蒸气的塑料小袋抽气密封并于4℃保存。实验表明，用这种方法所保存的芯片使得抗体更有效地固定在芯片表面，并有效地增加芯片保存的稳定性。
（4）在芯片微阵列的点阵上，本发明采用不同浓度的三种阳性对照，并考虑同时使用三者的不同强度信号来标准化不同的微阵列。实验表明，本发明可以明显地改善芯片的敏感度和重复性。
采用本发明的多急性肾损伤标志物联合检测抗体芯片试剂盒，能够同时检测出20种常用临床诊断急性肾损伤标志物，实现了多样本多指标的联合检测，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。这些检测指标可用于人群普查，有利于建立基线资料。监测这些指标的变化有利于准确诊断，及时治疗，将大大提高治愈率，减低医疗费用。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：抗体芯片点样条件的确定。
1、捕获抗体的点样浓度：将捕获抗体在不同的缓冲液中（无菌水，PBS缓冲液，含不同浓度牛白蛋白的PBS，含不同浓度甘油的PBS缓冲液等）以2x的浓度稀释，用非接触性点样仪点在芯片表面，然后用夹心ELISA方法比较它的活性和稳定性。实验表明，用含有0.01-10g/100ml牛白蛋白PBS缓冲液稀释捕获抗体具有最好的线性率和稳定性。
2、点样的条件控制：在室温下把捕获抗体直接点在玻片表面时，捕获抗体的点容易产生空心点，而且不同抗体点活性差异较大，并且在最后生成的图像往往发现会有拖尾现象。本发明控制点样温度为70-75F，湿度为40-45%时所点的抗体点具有最好的形状，并且发现将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，第二天真空抽气干燥2小时，然后把整张芯片用不透气的小袋封装，用这种方法制备的玻片捕获抗体具有最佳的活性并且可以在4℃至少稳定六个月以上。
实施例2：本发明所述的用于用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒的制备。
为了检测样品中是否存在相应的急性肾损伤标志物，制备固定有针对于如下急性肾损伤标志物的特异性抗体的玻片：肾损伤分子1、白蛋白、骨桥蛋白、三叶因子3、β2-微球蛋白、丛生蛋白、趋化因子配体16、非转移性黑色素瘤糖蛋白B、肝脂肪酸结合蛋白、单核细胞趋化蛋白-1、可溶性肿瘤坏死因子受体1、钙结合蛋白-1、γ干扰素诱导蛋白10、胱抑素C、肝细胞生长因子、巨噬细胞移动抑制因子、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、基质金属酶组织抑制剂-1、血管细胞粘附蛋白1、血管内皮生在因子。
1、抗体的来源：
采用针对表1中所列蛋白质的特异性抗体，抗体的用途、来源、浓度均在表1详细说明。所有的检测抗体均用Pierce长臂生物素标记试剂盒（Cat#131093）标记。具体方法如下：将待标记的检测抗体在大量的1xPBS缓冲液（1毫升抗体在1升的PBS）中透析三次，每次至少6小时。测定抗体浓度后按每毫克抗体加入80微克生物素DMSO溶液,混匀,在室温下反应4小时。用PBS溶液对生物素标记的抗体进行透析,去除游离的生物素并标定生物素标记的检测抗体浓度。
表1蛋白质所对应的特异性抗体的用途、来源、浓度信息
2、抗体芯片的制备与保存
将100-1000pl的含0.02-2ng的特异性的抗体的PBS缓冲液（含有0.01-10g/100ml牛白蛋白）用全自动点样仪点样于玻片上。生物素标记的牛IgG作为阳性对照。每种抗体和三种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有四次的重复。每张玻片上有16个相同的芯片点阵。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装后于2℃到8℃保存备用。
其中，本实施例中，全自动点样仪为美国铂金艾尔默公司生产的产品；玻片为美国康宁公司产品。当然，在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。
3、蛋白标准品的来源：
采用针对表2中所列重组蛋白质的名称及来源均在表2详细说明：
表2蛋白标准品中重组蛋白的名称，来源
重组蛋白名称 厂商 批号
KIM-1 R&D 1750-TM
ALB Raybiotech 228-10779
OPN R&D 1433-OP/CF
TFF3 Raybiotech 230-00230-
B2M Raybiotech 228-10086
Clusterin Raybiotech 230-00021
CXCL16 Raybiotech 228-11862-
GPNMB R&D 2550-AC
L-FABP Raybiotech 230-00216
MCP-1 Raybiotech 228-11078-
sTNF RI R&D 636-R1/CF
Calbindin-1 Abcam Ab82631
IP-10 Raybiotech 228-10970
Cystatin C Raybiotech 228-10300
HGF Raybiotech 228-10702
MIF Raybiotech 230-00007
NGAL R&D 1757-LC-050
TIMP-1 R&D 970-TM-010
VCAM-1 R&D ADP5-200
VEGF Raybiotech 228-11612
将以上各个重组蛋白质用含0.1％小牛白蛋白的磷酸缓冲液稀释后按照一定的量混合在一起，分装后用冷冻干燥法干燥并于－80℃保存。在本实施例中，用于做标准曲线用的每种重组蛋白的最终使用浓度如表3所示。但事实上，在其他实施例中，用于做标准曲线的重组蛋白浓度可以选用不同的区间，并不局限于表3的实例。
实施例3：用本发明的试剂盒定量检测急性肾损伤标志物的实验。
1、玻片芯片的完全干燥
将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
2、急性肾损伤标志物标准品的梯度稀释
2.1添加500μl的样品稀释液到急性肾损伤标志物标准品混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速地离心，轻轻地上下抽打溶解粉末，标记这个小管为Std1。
2.2分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。
2.3抽取100μl的Std1加入到Std2中轻轻混合，然后从Std2中抽取100μl加入到Std3中，如此梯度稀释至Std7。
2.4抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CNTRL，作为阴性对照。
注：因为每种急性肾损伤标志物的起始浓度是不同的，所以Std1到Std7的梯度稀释后，每个急性肾损伤标志物的系列浓度是不同的。本实例中，梯度重组蛋白稀释液的浓度如表3所示。
表3经梯度稀释后用于做标准曲线的重组蛋白标准品的浓度如下所示
原料 对照 Std7 Std6 Std5 Std4 Std3 Std2 Std1 单位
KIM-1 0 14 41 123 370 1111 3333 10000 pg/ml
ALB 0 46 137 411 1233 3700 11100 33300 pg/ml
OPN 0 137 412 1235 3704 11111 33333 100000 pg/ml
TFF3 0 46 137 411 1233 3700 11100 33300 pg/ml
B2M 0 14 41 123 370 1111 3333 10000 pg/ml
Clusterin 0 46 137 411 1233 3700 11100 33300 pg/ml
CXCL16 0 14 41 123 370 1111 3333 10000 pg/ml
GPNMB 0 41 123 370 1111 3333 10000 30000 pg/ml
L-FABP 0 1372 4115 12346 37037 111111 333333 1000000 pg/ml
MCP-1 0 0 1 4 11 33 100 300 pg/ml
sTNFRI 0 41 123 370 1111 3333 10000 30000 pg/ml
Calbindin-1 0 1372 4115 12346 37037 111111 333333 1000000 pg/ml
IP-10 0 4 12 37 111 333 1000 3000 pg/ml
Cystatin C 0 137 412 1235 3704 11111 33333 100000 pg/ml
HGF 0 4 12 37 111 333 1000 3000 pg/ml
MIF 0 46 137 411 1233 3700 11100 33300 pg/ml
NGAL 0 41 123 370 1111 3333 10000 30000 pg/ml
TIMP-1 0 41 123 370 1111 3333 10000 30000 pg/ml
VCAM-1 0 137 412 1235 3704 11111 33333 100000 pg/ml
VEGF 0 137 412 1235 3704 11111 33333 100000 pg/ml
3、芯片操作流程
3.1每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。
3.2抽去每个孔中的样品稀释液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。样本为静脉采血后自然析出的血清，使用前用样品用稀释液1:1稀释。
3.3清洗
抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液I。
抽去每个孔中的1×洗液I，加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液II。
3.4检测抗体混合液的孵育
离心检测抗体混合液小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。
3.5清洗
抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液。
3.6Cy3-链霉亲和素的孵育
离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。
3.7清洗
抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液。
3.8荧光检测
1）将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。
2）将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液I，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液I，添加约30ml的1×洗液II，在室温摇床上震荡5min。
3）去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。
4）采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道（激发频率=532nm）。
3.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。
1）用GenePix软件来读取生物芯片的荧光值。芯片的微阵列参数用8（行）x24（列），点的直径用120um。
2）读数后选用的数值为除掉地方背景的中间值读数（F532Median－LocalBackground）。用特定的定量芯片计算软件来做每个重组蛋白的标准曲线。
在计算不同样品急性肾损伤标志物的浓度前使用每个芯片上相同的三个阳性对照点做参照系进行数据的标准化处理。阳性对照间的信号值大约相差4倍。在进行标准化之前先计算出每个芯片的阳性对照值POS=（POS1+4*POS2+16*POS3）/3。然后再用该值对所有的数据进行标准化处理：校正值=原先值*（样品平均POS）/POS。
实施例4：用本发明的试剂盒定量检测急性肾损伤标志物的实验数据处理。
在一次临床血清样品实验中，八个标准样品的荧光读数分别如表4所示。
表4：三倍梯度稀释的标准品荧光读数（F532Median–LocalBackground）
以KIM-1为例，根据表3和表4的信息得知KIM-1的蛋白浓度和荧光信号间的关系如下表所示。
表5：KIM-1的蛋白浓度和荧光信号间的关系
由表5绘制标准曲线，计算得r2＝0.9996。根据回归方程计算被测样品1号，信号强度为578，KIM-1含量为639.22pg/ml；被测样品2号，信号强度为1050，KIM-1含量为969.27pg/ml。
实施例5：本发明的试剂盒的交叉反应的测试。
抗体对间的交叉反应测试是根据以下方法进行的。在不同芯片的孔里首先加入相同的标准品1。孵育，洗片后再与每种抗原单独的检测抗体孵育。最后经Cy3-链霉亲和素孵育，芯片扫描后读数。以每种抗原的捕获抗体为横轴，以加入的检测抗体为纵轴可以得到表6的实验结果。
表6抗体对间的交叉反应测试结果
KIM-1 ALB OPN TFF3 B2M Clusterin CXCL16 GPNMB L-FABP MCP-1
KIM-1 12088 102 189 148 250 230 189 204 220 234
ALB 98 40523 178 156 245 231 174 224 245 21410 -->
OPN 142 147 5742 241 189 145 203 210 207 111
TFF3 78 98 102 8685 95 75 65 45 78 97
B2M 98 102 132 97 16052 86 76 120 114 132
Clusterin 97 111 86 105 120 16524 97 76 112 96
CXCL16 56 78 86 92 75 102 10056 201 98 94
GPNMB 45 76 50 47 65 82 95 10523 74 67
L-FABP 103 127 115 98 78 104 97 87 9504 96
MCP-1 112 142 103 99 102 114 86 93 90 14256
sTNFRI 78 96 85 101 112 83 97 89 78 104
Calbindin-1 56 78 63 89 75 107 78 96 112 99
IP-10 89 112 104 78 113 105 97 95 85 104
Cystatin C 56 87 89 92 82 87 73 85 97 57
HGF 23 45 53 45 43 60 64 73 42 50
MIF 75 85 46 63 75 66 78 56 63 60
NGAL 152 145 203 212 198 145 201 214 198 187
TIMP-1 45 56 34 42 67 64 54 76 70 69
VCAM-1 70 58 89 67 53 45 60 75 38 48
VEGF 66 76 54 36 54 42 73 46 75 63
sTNFRI Calbindin-1 IP-10 Cystatin C HGF MIF NGAL TIMP-1 VCAM-1 VEGF
KIM-1 147 168 221 145 214 189 178 198 220 223
ALB 104 114 145 205 213 245 178 198 230 206
OPN 114 125 123 135 189 208 178 168 240 203
TFF3 102 123 95 111 86 99 103 145 126 75
B2M 97 82 92 104 134 93 112 125 98 102
Clusterin 94 112 92 113 104 99 86 104 113 124
CXCL16 103 121 76 85 97 104 67 87 115 76
GPNMB 86 95 102 87 86 67 82 78 97 73
L-FABP 107 121 97 145 107 86 93 113 117 95
MCP-1 121 107 95 103 114 85 120 147 94 123
sTNFRI 9587 115 103 94 93 85 102 107 96 87
Calbindin-1 112 8520 97 78 85 98 115 87 76 89
IP-10 85 115 12848 96 83 78 93 107 86 94
Cystatin C 104 74 63 6578 76 104 89 72 87 84
HGF 64 78 62 54 7584 88 75 92 78 63
MIF 76 86 75 67 85 8541 63 89 72 77
NGAL 223 242 230 183 225 242 25423 197 215 256
实验结果表明每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原而与其他的抗原没有交叉反应。
实施例6：本发明的试剂盒的检测准确度。
为了检验试剂盒检测的准确度，采用本发明的试剂盒检测了不同的临床样品，并与临床用其他试剂盒检测的结果相比较。在对20个病例NGAL的检测中，本发明的产品不仅可以全部检出20例NGAL阳性样品，而且这20例检测的结果具有很高的相关性。其相关系数高达0.99。
表7本发明的试剂盒检测临床样品的结果
实施例7：本发明的试剂盒的检测灵敏度。
在一组用免疫比浊法检测CystatinC单个指标阳性病人的血清中，本发明的试剂盒不仅可以全部检出相应的阳性指标，而且可以发现在这些病人中另外一些指标也呈阳性，如表8。用多因子的联检可以提高检出急性肾损伤的检出率。
表8本发明的试剂盒检测CystatinC单个指标阳性样本的结果
综上所述，本发明公开了一种用多种急性肾损伤诊断的抗体芯片试剂盒。该试剂盒使用标准组织玻片作为表面载体，可以在玻片表面完成多重夹心ELISA的反应。。该试剂盒检测急性肾损伤标志物的灵敏度和特异性可以达到单因子ELISA的水平。另外，通过对数十例单项急性肾损伤标志物阳性样本的多急性肾损伤标志物的联合检测显示，本发明的试剂盒不仅可以准确地检测出全部阳性样本的单因子，而且也可以检出其他潜在的阳性指标。这种创新的技术和产品将极大推动急性肾损伤研究，它不仅有助于早期发现肾脏损伤，也有助于观察药物之间的相互作用对肾脏的毒性，加速新药的研发进程。
应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种用于早期诊断急性肾损伤的抗体芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
抗体芯片，包括标准组织玻片和在标准组织玻片表面上固定的20种急性肾损伤标志物的特异性抗体、三种阳性对照；
急性肾损伤标志物标准品混合物，是将20种急性肾损伤标志物标准品按照一定的量混合在一起的冻干混合物；
生物素标记的急性肾损伤标志物检测抗体混合物；和
荧光素Cy3标记的链霉亲和素；
所述的抗体芯片是将100－1000pl的含0.02-20ng特异性抗体的PBS缓冲液点样于所述玻片上，该PBS缓冲液含有0.01-10g/100ml牛白蛋白；控制点样温度为70-75F，湿度为40-45%，将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，第二天真空抽气干燥2小时；干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。
2.根据权利要求1所述的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述抗体芯片的基片是由活性环氧基团包被的标准组织玻片，用2×8孔可拆卸型框架把玻片分割成16个互不干扰的点样小区；所述20种急性肾损伤标志物的特异性抗体是采用非接触性点样方式固定在每个点样小区内，每种特异性抗体、阳性对照均重复点样四次，以致在每个点样小区内形成8×24矩阵的微阵列。
3.根据权利要求1所述的抗体芯片试剂盒，其特征在于：三种阳性对照是采用不同浓度的生物素标记的小牛IgG，并作为不同微阵列间的标准化参照系。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性抗体为选自针对如下20种急性肾损伤标志物的抗体：肾损伤分子1、白蛋白、骨桥蛋白、三叶因子3、β2-微球蛋白、丛生蛋白、趋化因子配体16、非转移性黑色素瘤糖蛋白B、肝脂肪酸结合蛋白、单核细胞趋化蛋白-1、可溶性肿瘤坏死因子受体1、钙结合蛋白-1、γ干扰素诱导蛋白10、胱抑素C、肝细胞生长因子、巨噬细胞移动抑制因子、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、基质金属酶组织抑制剂-1、血管细胞粘附蛋白1、血管内皮生在因子。
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