CN1500140A

CN1500140A - 用于测试多种待分析物的装置及方法

Info

Publication number: CN1500140A
Application number: CNA028075285A
Authority: CN
Inventors: 涛张; 张涛; 李宾; 彭永济; 任一萍; 葛海鹏; 邓富桥; 丁力; 李红梅; 蔡其锋; 陈莹
Original assignee: SHANGHAI JINGTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI JINGTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2004-05-26
Also published as: WO2002077152A1; US20040091939A1; JP2004532404A; EP1373467A1; EP1373467A4

Abstract

本发明提供了用于测试至少一个样品中的多种待分析物的装置。该装置包括有一个测试表面的固相基质。在该测试表面上限定了至少一个反应区域，所述反应区域包括至少一个分离的测试位点的阵列。每一个这样的测试位点上都固定有一种测试分子，而不同的测试位点上则可能固定有不同的测试分子。本发明提供了一种用于附着于该固相基质的分隔物。所述分隔物包括在附着表面上的多个孔。这个附着表面与固相装置的测试表面相吻合并适合与之可逆性地附着，以使得当该两部分附着在一起时，每一个孔都与测试表面的一部分相贴合，从而构成了多个防漏的小室。小室内部的测试表面包括多个暴露在小室内部的测试位点。每一个小室优选地具有一个自外界可进入的开口，这样液体可被引入小室中从而可与暴露的测试位点接触以进行测试。本发明的另一方面在于提供了在同一样品中分析多种待分析物的方法。

Description

用于测试多种待分析物的装置及方法

技术领域

本发明涉及对一样品中多于一种的待分析物进行测试和/或定量的装置和方法。

背景技术

检测各种疾病及人体状态的诊断性测试装置及方法在很多文献及专利文件中已见有述。随着医学治疗及诊断的发展，为了对疾病进行早期诊断，对人们健康状态进行监测就变得越来越重要。在同一样品中对多种不同待分析物同时进行测试的能力一直是许多人多年来所探求的目标。使用单一测试装置分析单一样品的方法可以为多种待分析物提供诊断信息，以便节约所需的试剂及人力资源。

授予Woudenberg等人的美国专利No.6126899涉及的就是在同一样品中同时测试一种或多种待分析物的方法及仪器。其仪器具体如下：限定样品的基质，即一个样品分布网络，其具有一系列的小室，每一个小室具有一种能有效地与一种待分析物反应的特定的试剂。虽然上述系统可能用于对多种待分析物同时进行分析，但该装置包括很多小室及凹槽，需要专门为此制造特定的固相基质。

Fitzgerald等人的欧洲专利申请No.EP0874242描述了这样一种用于进行多待分析物分析的固相装置，其中基质通过配体与多种分离的反应位点以共价的形式结合。该专利发明了一种包括有各种通道及小室的装置可用于容纳待测样品。该发明还提供了一整体分析系统，可用于同时测试多待分析物形式的不同待分析物。

虽然上述各系统都可以用于分析多待分析物样品，我们仍然需要提供一种改良系统，以降低装置制造的成本和样品测试的成本。另外，另一种需求即是减低样品及试剂的量。本发明的一个目的是提供这样一个改良的多待分析物诊断系统。

发明内容

本发明一方面提供可用于检测至少一个样品中的多种待分析物的装置。该装置包括一具有测试表面的固相基质。在该测试表面上限定了至少一个反应区域，其具有至少一个分离的测试位点的阵列。每一个此类测试位点都有一种测试分子固定于其上，因此，不同测试位点上就有着不同的测试分子固定于其上。提供了可用于附着于固相基质上的分隔物。该一种分隔物在一附着表面上具有很多孔。该附着表面与固相装置的测试表面相吻合，并适合于与之可逆性结合，这样当这两部分组合后，每一个孔则与测试表面的一部分相贴合，以构成多个防漏小室。小室内部的测试表面具有多个暴露的测试位点。每一个小室还具有一个自外界可进入的开口，这样液体可被引入小室中从而可与该暴露的测试位点接触以进行测试。

在一个优选实施方案中，小室是一个池，其由固相基质的测试表面做底部，部分分隔物作为周边的壁，以使得多个测试位点暴露在小室内的池的底部。

本发明的另一方面，测试分子包括至少一种配体以及至少一种抗体。配体被固定于一个测试位点上，而抗体则被固定于同一小室内的不同测试位点上，以使得同一样品中相应的那些有交叉反应的待分析物结合反应可以在同一个反应区域中同时发生。

在本装置的优选实施方案中，固相基质即是一个芯片，有着一个平滑的上表面，其上有多个限定的反应区域。每一个测试区域包括至少一个分离的测试位点的阵列，其上固定有测试分子。分隔物是具有多个孔的薄片，这些孔由一边框所限定，每一个孔对应于一个反应区域。薄片的边框适合与芯片的平表面可拆开地连接，以使得在这两者之间构成一防漏的池。结合可以通过任何一种常用的方式进行，包括机械的，例如但不限于回形针、螺丝钉，以及化学的如胶水或者粘着剂等等。每一个池内，芯片上表面的一个反应区域形成了池的底部，相应的薄片的边框的一部分就构成了分隔这些池的分隔壁。这个薄片是可以拆除的，因此在样品反应后可以移除该薄片，而芯片可以插入一个标准的芯片读取设备中，用于读取并分析结果。该优选实施方案的优点之一在于，许多标准芯片读取设备都可以用来分析测试结果。与芯片连接后，这个可移除的分隔薄片就成为了一个装配好的装置，其具有一个池的系统，其中可以进行不同样品的反应。池的数量可由使用者依据需要决定，进而决定分隔薄片的数量。本发明提供了一个标准芯片格式的真正的多样化的生物芯片以及测试多种分析物及样品的方法。

另一方面，本发明还提供一种用于分析同一样品中的多种待分析物的方法。该方法包括以下步骤，在测试表面上定义多个分离的并在空间上独立的测试位点，在每一个测试位点上固定一种测试分子，这样便将多种测试分子固定于其上。每一个测试区域周围都设有防水屏障，然后将待测试的样品与适当的测试试剂一起加入到各个测试区域。

附图说明

图1A是本发明一个实施方案的固相基质的俯视图。

图1B是与图1A中的基质相吻合的分隔物的俯视图，二者同属一个实施方案。

图1C是本发明的一个装置的俯视图，其显示图1B中的顶端分隔薄片附着于图1A中的基质上。

图1D是图1C装置经线A-A的侧向剖视图。

图1E是与图1C相同的实施方案中用于遮盖图1C的装置的遮盖物。

图2A是本发明第二个实施方案中的基质的俯视图，测试位点的位置已圈出。

图2B是与图2A中的基质相吻合的分隔薄片的俯视图，二者同属一个实施方案。

图2C是本发明的第二个实施方案中的装置的俯视图，其上有分隔薄片及基质，测试位点的位置已圈出。

图2D是图2C装置经线B-B的剖视图。

图3A是本发明第三个实施方案中的测试区域。

图3B是本发明第四个实施方案中的测试区域。

图4A是一个优选实施方案中的肝炎生物芯片的俯视图。

图4B是同一实施方案中用于测试不同肝炎抗体的肝炎生物芯片中的测试区域。60：人类IgG阳性对照；62：人类血清白蛋白(HSA)阴性对照；64：HAV抗原；66：HCV抗原；68：HDV抗原70：HBs抗原；72：HBe抗原；74：HBc抗原；76：HEV抗原。

图4C是同一实施方案中用于测试不同肝炎抗体的肝炎生物芯片中的测试区域。60a：HBsAg阳性对照；60b：HbeAg阳性对照；60c：AFP阳性对照；60d：HDVAg阳性对照；62：阴性对照；78：HBs Ab；80：HBe抗体；82：AFP抗体；84：HDV抗体。

图4D的例子是使用图4A-图4C中所示芯片对一个血清抗HAV-IgG阳性的HAV感染患者进行诊断的预期结果。这里显示了芯片的两个测试区域。

图4E所示的一个例子，是使用图4A-图4C中所示芯片对一个血清HBsAg，HbeAg及HBcAb阳性的HBV感染患者进行诊断的预期结果。这里显示了芯片的两个测试区域。

图5A是本发明另一个优选实施方案中ToRCH蛋白芯片的一个测试区域。86：弓形体；88：风疹病毒；90：巨细胞病毒；92：人类单纯疱疹I；94：人类单纯疱疹2；96：阳性对照；98：阴性对照。

图5B所示的例子是图5A的使用ToRCH蛋白芯片对一位风疹病毒感染患者进行诊断的预期结果。(为使图示简化，这里仅显示了一个测试区域或池；使用含有RV IgG的患者血清进行测试)。

图5C的例子是图5B的对CMV感染患者进行诊断的预期结果。(为使图示简化，这里仅显示了一个测试区域或池；使用含有CMVIgM的患者血清进行测试)。

图6A是本发明另一个实施方案中癌症蛋白芯片的测试区域。

图6B的例子是图6A的使用肝癌患者血清对该患者进行诊断时的预期结果。

图7A是自身免疫病蛋白芯片的测试区域。

图7B的例子是图7A的使用自身免疫病蛋白芯片对系统性红斑狼疮患者进行诊断时的预期结果。(为使插图简化，这里仅显示了一个测试区域)。

图7C的例子是图7A的使用自身免疫病蛋白芯片对类风湿关节炎患者进行诊断时的预期结果。(为使插图简化，这里仅显示了一个测试区域)

具体实施方式

如上所述，样品可以是包含有任何待分析物的任何溶液、混合物或者生物学液体等。样品包含有阳性对照和阴性对照的血清及生物学液体。防漏小室是指小室能够盛放液体，并只要液体的量不超过小室的尺寸范围，小室在至少一个方向上就不会渗漏或溢出。防漏可以是封闭的或者是具有开口的。配体是指任何能与抗体发生抗原抗体反应的抗原或分子，酶-底物结合反应中的底物、或者可被受体识别并与受体结合的分子，包括但不限于：核酸、染色体片段、蛋白、肽、糖蛋白、脂质、多肽、抗生素、皮质激素以及其他任何有机分子。

在本发明的一个实施方案中，如图1A-图1D中所示，为由玻璃载片20组成的生物芯片提供一个分离的顶端分隔薄片22。分隔薄片22如图1B中所示，可以由任何惰性材料制成，最好用一些柔软的材料如塑料、膜、乳胶、陶瓷、橡胶、树脂、PVC或硅胶。在分隔薄片上冲压形成孔22a，以便在每一个孔周边形成边框22b。于是边框22b就可以作为侧壁，而载片的顶面就作为底部，这样就形成了一个池或说小室24，如图1D所示。顶端分隔薄片的尺寸最好与载片的相同或略小，并在底面应包含有粘合剂，这样才能直接与玻璃载片20粘合。在一个优选实施方案中，粘合剂很有力，使得顶层的分隔薄片与玻璃载片粘合在一起，在两者之间形成池24。池应是防漏的，这样当在每一个池中加入适量的液体时，液体不会流进邻近的池中。粘合剂应该是惰性的，还应该是这样一种材料制成的，它也允许分隔薄片能从载片上分离下来，以方便使用者。每一个阵列中的行与列的数目可以依据使用者的意愿进行调整。分隔薄片的厚度由每一个池所需的反应体积来决定，也可以由一名本领域技术人员来决定，无需过多的实验。一般说来，薄片为1-3mm厚。孔和边框可以是任何尺寸或形状，依使用者的需要而定。例如，孔的内尺寸可以是0.3cm×0.3cm至0.4cm×0.6cm甚至1.2cm×1.2cm均可。分隔壁的宽度一般是22b或34a在0.15cm到0.6cm之间。孔的数目可以相对变化，比如说1×2，2×3，3×10，3×5，2×5，3×8或4×8阵列形式。

在最简单的实施方案中，单一的测试分子可以固定于一个玻璃载片的测试区域20a中，即与特定的池相对应。例如，在图1B中，孔HI的位点最好与图1A中所示的测试区域TA1的位点相对应。一个测试分子固定于测试表面TA1上，这样一旦分隔薄片的顶面与载片20接触并粘合，就形成了池WI，池的底面则相应于图1C所示的测试区域TA1。在这个具体的例子中，只有一个测试分子，因此在每一个测试区域中只有一个测试位点。图1E中所示的遮盖薄片是可任选的，像个盖子一样，可以放在分隔物的外表面，以便在结合反应进行温育时遮盖溶液防止蒸发、溢出或污染。遮盖薄片也可以根据操作者需要去除掉。遮盖薄片可以由任何惰性材料制成，如用于做分隔物的那些材料，例如聚乙烯薄膜。

在另一个实施方案中，每一个测试区域都有多个测试位点，这样在每一个小室或池中就能发现多个测试分子。如图2A所示，本发明中的另一个玻璃载片29上显示了两个限定于其上的测试区域30。每一个测试区域都以虚线方边框勾出。每一个测试区域内都有限定于3×3阵列内的测试位点32，图中显示为圈。图2B显示的是吻合的分隔薄片34，上有两个冲压而成的大一些的孔。剩下的薄片构成边框34a。图2C和2D显示了本发明该实施方案的组装好的装置，在分隔物34与玻璃载片29之间是两个大孔40。从图示上看，可以清楚的知道，在这个具体例子中最多同时可以有9个不同的测试分子被固定于同一个测试区域中，用这种方法可以测试多种待分析物。

图3A是本发明的另一个实施方案的图示，其中一个测试区域41(即一个小室的底部)包括有9个4×4的测试位点阵列。为插图简便起见，其他测试区域及固相装置并没有显示。很明显，可以按照使用者的需要安排不同的小室或者同类的测试区域。另外，同一个测试表面上的不同测试区域可以安排不同的测试位点阵列。在这个例子中，空心圆圈42通过测试分子固定于其上来定义测试位点，而实心圆圈44则由于有阳性对照分子固定于其上来定义阳性对照位点。虚线圈46定义的测试位点有阴性对照固定于其上。阳性对照分子应能与样品中已知的待分析物反应，阴性对照测试分子则不应与样品中的任何待分析物发生反应。测试分子是指与样品中未知浓度的待分析物(为使解释简便，是指那些测试待分析物)有交叉反应的分子。这个测试待分析物就是诊断测试的对象。本例中，仅有的一个测试区域(即一个池)包含有三行4×4的测试位点阵列(行A至C)，和三列4×4的测试位点阵列(列1至3)。阵列A1，A2，A3，B1，B2，B3及C1是完全一样的。阳性对照及测试分子被安排在插入的位点。阴性对照则被固定于阵列C2和C3的测试位点上。整个池41可用于进行一个样品的测试，这样所有测试位点的反应可以在同一个反应区域同时进行。因此，在这个例子中，就有三个不同的测试分子被固定于用于分析的同一个测试区域中。而且，每一个测试分子的测试位点上可以进行多次重复，使得测试的准确率明显增高。

虽然上述的实施例中阵列A1，A2，A3，B1，B2，B3及C3内有相同的三种测试分子，并以相同的方式阵列，但很明显我们也可以在同一个反应区域中的每一个这样的阵列中固定于不同的测试分子。例如，一个测试分子(例如阳性对照分子)可以固定于阵列A1的8反应位点中，第二个及不同的测试分子(如阴性测试分子)可以固定于阵列B3的8反应位点中。而且，很明显我们可以在这七个阵列上固定无数不同的测试分子，其数目根据所需的浓度精度而定。

图3B显示的是本发明的另一个实施方案，其中测试区域48对应于一个孔或小室，包括一个9×9的阵列，即一个中心行和一个中心列，由周围的四个四分之一围绕。阴性对照54被固定于“交叉”形或十字形的行、列上，阳性对照50以及测试分子52则被安排在四个四分之一中的插入的位点。使用这个方式，在一个成功的实验中，就可以看到阴性对照不产生信号或产生的信号很低，这四个四分之一就能很清楚地显示。这就是这种方式的一个优点：结果一目了然。

接下来的实施例展示的是本发明的各种特定的实施方案，旨在教授一个普通的本领域人员来使用和操作本发明。这些实施例只是为了说明，并不限制本发明权利要求的范围。在这些实施例中，测试分子还可以是探针或标记物。有时测试区域是些格子，而测试位点是些更次级格子。

实施例1

在测试位点固定配体的方法

蛋白芯片由微阵列仪在显微镜固相基质上，按照格子和次级格子的方式通过点样和固定探针的办法制备。探针可以是抗原或抗体，可以是蛋白、多肽或肽，并可以结合测试样品中的靶蛋白。显微镜固相基质可以衍生自显微镜载玻片、硝化纤维素膜或二氧化硅。玻璃基质上每1cm×1cm面积可点2390个蛋白点。用于此反应的样本可以是血浆、血清、全血或其它体液。整个的反应过程必须在固相基质上原位进行。

生物芯片的制作：

1.将适当稀释的探针加到微量滴定板(即源板)上的各个孔内，

2.将源板置于自动化微阵列仪(Prosys4510，from CartesianTechnology，CA，USA)的一个适当的槽内。

3.软件控制的微阵列针从源板中提取标本。

4.充满标本的针在载玻片表面上停留，使标本点在经衍生的显微镜载玻片上。

5.点好的生物芯片在37℃下孵育1小时，使蛋白探针固定到基质表面上。

6.用牛血清白蛋白(BSA)和吐温20在TBS缓冲液[0.02MTris-HCl，0.137M NaCl，pH7.6]中37℃下孵育1小时将基质的剩余表面封闭。

7.蒸馏水两次洗涤，室温下干燥。

8.在0.3％的氢硼化钠(NaBH4)中37℃孵育生物芯片5～10分钟，以减少玻璃表面的醛基。

9.蒸馏水两次洗涤，室温下干燥。

10.制好的生物芯片在暗处4℃密封。

组装方法

1.制作多个小室塑料装置的塑料物质(分隔薄片)的外径要适合固相基质的大小。

2.每一个装置的小室的数量可从1×2到4×10。

3.每两个相邻小室的中心距离为4.5mm的倍数，此数值适应了384和96微量滴定板的几何学、微阵列针头的针间距以及多道移液管。

4.塑料的厚度决定了每一个小室的深度，应至少1mm，可1mm～3mm。

5.这个多室塑料装置的一侧要有粘性，能牢牢地粘住固相基质，为反应形成一个防漏的池。这种装置要求防水、防漏并且坚硬，在水溶液里是惰性的，能承受水压。

6.把蛋白探针微点阵到每一个小室内，来制备用于多标记、多样品的生物芯片。

7.大小适合多室塑料装置外径、单面涂有粘性物质的聚酯薄膜是用于覆盖多室生物芯片的理想物质，为反应形成一个完全绝缘且内封的室。

8.多室生物芯片的整个安装能经受反应温度在-40～95℃、UV治疗，且防水。

9.聚酯薄膜与多孔装置的结合程度要小于装置和固相基质的结合力。每一反应步骤中移走这个薄膜都不会改变多室生物芯片的结构。

10.反应快要完成时，塑料装置要与固相基质分开，作常规微阵列扫描仪的分析(Scanarray4000，Packard Bioscience(now known asPerkinElmer Life Sciences，CT，USA)。

固定蛋白到固相基质还可通过物理反应获得，如通过电荷(即带负电荷的蛋白与带阳性电荷的薄膜或金属表面结合)，通过疏水反应(疏水蛋白与疏水薄膜结合)，通过滞留(将一定大小的蛋白隔离在多孔的基质里，如薄膜或基质的凝胶型)，还可以通过化学反应(如与环氧载玻片、硅烷化载玻片及甲硅烷化载玻片结合)

实施例2

用交叉反应抗原固定在生物芯片上检测人血清抗体的方法

反应和检测：

1.从包装中移出生物芯片。

2.检验样本(患者血清，阳性或阴性血清对照)分别加入生物芯片上的各个小室内，在37℃温度下反应1小时。

3.没有结合的试剂用钠盐如PBS或TBS(PBS：0.137M NaCl，0.027M KCl，0.0043M Na2HPO4o7H2O，0.0014M KH2PO4，pH7.3)[TBS：0.02M Tris-Cl，0.137M NaCl，pH7.6]的洗涤缓冲液洗涤。

4.除去过量的缓冲液，室温下干燥5分钟。

5.生物芯片中加入封闭溶液(含有1％牛血清白蛋白的TBS或PBS)。

6.洗涤、干燥生物芯片。

7.荧光标记的混合物(二抗或抗原)用封闭液稀释，加到生物芯片中，37℃温度下孵育0.5小时。

8.洗涤，从生物芯片中移去分隔薄片并离心干燥。

9.微阵列扫描仪扫描成像。记录每一个点的荧光强度，用于资料的分析和诊断。

在其它方法中以上的第7到第9步可换成下面的7a到13a：

7a.生物素结合的二抗用封闭溶液稀释，然后加到生物芯片中，37℃温度下孵育0.5小时。

8a.洗涤、干燥生物芯片。

9a.加入含有链霉抗生物素分子的封闭溶液，37℃温度下孵育0.5小时。

10a.洗涤、干燥。

11a.荧光混合物(生物素或抗链霉抗生物素抗体)用封闭液稀释，加到封闭液中，37℃温度下孵育0.5小时。

12a.洗涤，从生物芯片中移去分隔薄片并离心干燥。

13a.微阵列扫描仪扫描成像。记录每一个点的荧光强度，用于资料的分析和诊断。

实施例3

用交叉反应的抗体固定后的芯片测试抗原的方法

反应和测试

1.从包装中移出生物芯片。

2.检验样本(患者血清，阳性或阴性血清对照)分别加入生物芯片，在37℃温度下反应1小时。

4.除去过量的缓冲液，室温下晾干5分钟。

6.洗涤、晾干生物芯片。

7.第二初级抗体用封闭溶液稀释，添加到生物芯片中，37℃温度下孵育0.5小时。

8.洗涤，离心干燥并再次洗涤。

9.碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的人IgG抗体(二抗)用封闭缓冲液稀释，37℃温度下孵育0.5小时。

10.加入适当的化学发光底物(ICN生物医学公司的用于HRP的鲁米诺(CA，USA)，或Pierce化学公司(IL，USA)用于AP的1，2-dioxetane-based基质)，室温下孵育1分钟(按照厂家的说明书)。

11.微阵列扫描仪扫描成像。记录每一个点的荧光强度，用于资料的分析和诊断。

实施例4A

用人血清诊断肝炎

具体包括蛋白芯片的制备，以及其在急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和肝炎病毒感染所致肝癌的诊断。

甲型肝炎诊断标志物是甲型肝炎抗体(抗-HAV IgG或IgMAb)；乙型肝炎标志物包括乙型肝炎表面抗原(HbsAg)，乙型肝炎表面抗体(HbsAb)，e抗体(HbeAb)以及核心抗体(HbcAb)；丙型肝炎标志物是丙型肝炎抗体(抗-HCV IgG或IgM)；丁型肝炎的标志物是丁型肝炎抗体(抗-HDV IgG或IgM)；戊型肝炎标志物是戊型肝炎抗体(抗-HEV IgG或IgM)。α-FP(甲胎蛋白)是生物芯片中用于肝癌诊断的标志物。在制备生物芯片时，将能与那些标志物特异性反应的探针或检验分子点在固相基质上。

图4A，4B，4C，4D，4E显示了测试区域的例子。这个例子说明了在一个芯片上56和58两个测试区域使用多次重复的方法进行资料分析。在芯片上要放置一个分隔物，使两侧的孔一致，用于加标本，这两个测试区域要在孔的底部。这种阵列方式对于下面数据的解释非常有利。每次检测分子的重复数高就会增加数据分析的可靠性，减少数据采集时出现的区域性和与机器有关的误差，从而提高每一个生物芯片实验的准确性。此外，下面提到的不同的带型有助于在高密度阵列上识别点。

在这个例子中，生物芯片上确定了两个测试区域或格子56和58。格子或测试区域56包含7个次级格子或检测位点阵列56a。在每一个次级格子56a内，把一个阳性对照和一个测试分子经多次重复固定在一个阵列构型里。点线56b代表确定的阴性对照的多次检测位点。

图4B更详细地显示了测试区域或格子56。点圈62代表阴性对照，通过多次重复交叉行和列勾勒出每一个次级格子的边缘。每一个次级格子都固定有一个阳性对照60和一个检测分子(一种肝炎抗原)。固定到每一个次级格子的检测分子是不同的肝炎病毒抗原。

例如，阵列A1有16个检测位点阵列成4×4，人IgG作为阳性对照60，检测分子甲型肝炎抗原(HAVAg)64间插阵列固定。其它6个阵列(A2-A7)只是固定在上面的检测分子不同(HAV抗原64，HCV抗原66，HDV抗原68，HBs抗原70，HBeAg 72，HBc抗原74和HEV抗原76分别固定在次级格子AI到A7上)。

图4所示的测试区域58的检测位点的阵列不同于测试区域56。在测试区域58，阴性对照固定于多检测位点，这些检测位点经过图4A上沿线58的测试区域中心成十字构型阵列。阴性对照位点的十字构型阵列将测试区域分为4个部分。周围是其它阵列或次级格子(B1～B4)。图4C显示阵列B1，阳性对照乙型肝炎表面抗原60a和检测分子乙型肝炎表面抗体(HbsAb)78用内插关系的方式固定在16个独立的检测位点。其它的3个部分(B2～B4)分别包括阳性对照结合了抗乙型肝炎e抗体80的肝炎BeAg 60b，阳性对照AFP 60c，抗-AFP抗体82以及阳性对照丁型肝炎病毒抗原60D，抗丁型肝炎病毒抗体84。

结合反应的方法

表1显示生物芯片上每一个检测分子点样的情况

柱形2显示用于点样的蛋白溶液的浓度，柱形3显示每一个点的估计大小。假设每一个反应位点是半球点，那么真正固定到每一个检测位点的蛋白量能被估计出来。整个点都可以干燥，多数蛋白可固定到检测位点表面。

表1

点样点样浓度点样大小结合反应时间

HBsAG 0.4mg/ml 160μm 60-90分钟

HBsAb 2mg/ml 160μm 60-90分钟

HBeAg 0.8mg/ml 160μm 60-90分钟

HBeAb 2mg/ml 160μm 60-90分钟

HBcAb 0.15mg/ml 160μm 60-90分钟

HAV IgG 0.8mg/ml 160μm 60-90分钟

HCV IgG 0.1mg/ml 180μm 60-90分钟

HDV IgG 0.125mg/ml 160μm 60-90分钟

HEV IgG 0.8mg/ml 150μm 60-90分钟

在结合反应时，将患者的血清加到56，58孔内，方法分别与实施例2、3方法类似。在这个实施例中，生物芯片上仅显示两个检测位点，一个用于检测血清肝炎抗体，一个用于检测肝炎抗原，因此上面只能检测一个检测血清。其它检测血清如阳性和阴性对照血清要用两个独立的且相同的生物芯片，以获得阴性和阳性结果。反应完成后，扫描芯片并记录每一个点的荧光信号强度。

实施例4B

应用多池装置测试人类血清中的肝炎病毒

本实施例说明，实施例4A中描述的系统可以用于具有多个小池的生物芯片，从而提高在同一个生物芯片上可以检验出的血样数目。在这个实施例中，如图1所示，三行八列阵列的小池芯片可以用于检验病人血清中的肝炎病毒。为了方便描述，我们将这三行自上而下分别称之为行A，B和C，而将这八列分别称之为列1到8。在这个实施例中，生物芯片1到4列的12个测试区域的测试位点与图4B中的56测试区域是相同的。而5到8列的测试区域的测试位点的阵列与图4A中的58测试区域相同。采用这种阵列，可以清晰的看到，检验病人血清中肝炎抗原的测试区域(即小池)共有12个。在这个实施例中，从感染肝炎病人的血清获得的样本作为阳性对照放置在A1测试区域，从未感染肝炎的健康病人获得的血清样本作为阴性对照放置在B1测试区域，以获得诊断反应。余下的10个测试区域(A2到A4，B2到B4，以及C1到C4)被用作检验未知病人血清中是否存在肝炎抗原。同样的，对照用的阳性血清放置在A5区，作为肝炎抗体的阳性对照，抗体的阴性对照放置在B5区。余下的测试区域(A6到A8，B6到B8，以及C5到C8)被用作检验病人未知血清中的肝炎抗体。所用的结合反应和检验系统与实施例4A中描述的相同。

分析结果的方法

R值，是在相同的次级格子中，落在被阳性对照探针分割的高斯分布曲线95％范围内的试验探针的平均密度值。

试验样本的R值称之为Rs。

阳性对照血清的R值称之为Rp。

阴性对照血清的R值称之为Rn。

Rco＝1/2(Rn+Rp)。

共有三种途径可以解释数据。

方法1：Rs大于0.05的样本被定义为对试验探针呈阳性反应；Rs在0.02到0.05之间被认为是边界线，需要重复该实验；Rs小于0.02是阴性。方法2：试验样本的Rs/Rn值大于2.1被认为是阳性，Rs/Rn值在1.5和2.1之间被认为是边界线，小于1.5是阴性。方法3：如果试验样本的Rs大于Rco被认为是阳性，Rs小于Rco被认为是阴性。

这项发明实现了组内的比较，也便于同一芯片内组间的比较。那些可能影响信号强度的地理上的差异也被系统采用的微型阵列和数据处理方法最小化了。

在上述方法中，肝炎的血清标准是中国国家药品管理局(SDA)制定的，并根据现有的出版物进行了方法和仪器设备准确性和敏感性的检查。

为确保诊断试剂盒在中国的准确性和精确性，国家药品管理局制定了准确性和敏感性的标准。敏感性试验确定了诊断试剂的最弱反应范围。我们描述的这种方法以100％的准确率通过了目前的敏感性试验。表2的第2列列出了由中国国家药品管理局提供，所有在中国注册并应用于临床使用的诊断试剂盒验证其敏感性的样本标准。对于HbsAg和HbsAb，参考标准分别是1ng/ml和10mIU/ml。

表2：使用SDA敏感性标准进行敏感性试验

肝炎标志物 SDA敏感性参考生物芯片诊断结果

(荧光强度)

方法1 方法2 方法3

HbsAg² ≤1ng/ml 0.09 2.2 +

HbsAb³ ≤10mIU/ml 0.12 2.4 +

HbeAg⁴ 1#≥1∶64 0.10 2.4 +

2#≥1∶128 0.07 2.2 +

3#≥1∶32 0.10 2.3 +

HbeAb⁵ 55#≥1∶32 0.08 2.2 +

57#≥1∶32 0.07 2.1 +

61#≥1∶32 0.07 2.2 +

HbcAb⁶ 2#≥1∶32 0.08 2.2 +

3#≥1∶8 0.11 2.4 +

4#≥1∶16 0.09 2.2 +

+为检验阳性，-为检验阴性

1.国家药品管理局标准序号9909

2.HbsAg，乙肝表面抗原

3.HbsAb，乙肝表面抗体

4.HbeAg，乙肝e抗原

5.HbeAb，乙肝e抗体

6.HbcAb，乙肝核心抗体

表3：使用SDA标准进行特异性试验

标记物 SDA特异性参考生物芯片诊断结果

(本方法得到的阴性方法1 方法2 方法3

的样本数目与总体的

阴性标准进行比较)

HbsAg² 20/20 0-0.018 0-1.38 -

HbsAb³ 20/20 0-0.019 0-1.49 -

HbeAg⁴ 15/15 0-0.016 0-1.46 -

HbeAb⁵ 15/15 0-0.016 0-1.46 -

HbcAb⁶ 15/15 0-0.016 0-1.48 -

角注：+为检验阳性，-为检验阴性

1.国家药品管理局标准序号9909

2.HbsAg，乙肝表面抗原

3.HbsAb，乙肝表面抗体

4.HbeAg，乙肝e抗原

5.HbeAb，乙肝e抗体

6.HbcAb，乙肝核心抗体

使用上述三种方法进行检验的结果见下三列。

对于HbeAg，HbeAb以及HbcAb，SDA提供了三种未知样本，而且不同浓度的稀释液可以用来稀释血清，见列2，(样本1，2和3是HbeAg；样本55，57和61是HbeAb；样本2，3 and 4是HbcAb)。结合反应的荧光强度可以在下一列相应的位点上观察到。

表3是SDA关于特异性试验结果的要求。在这些试验中，SDA提供阴性样本分别检验那些第1列中列出的抗原和抗体。第2列中，分数的分母代表对SDA提供的样本进行试验后结果呈阴性的样本数量，分子代表测试样本试验后结果呈阴性的样本数量。根据SDA的要求，不允许假阳性结果的存在。所以，使用目前的这种方法，特异性是非常高的，而且在病人血清中，对于不同的非特异性抗原或抗体都只有很低的交叉反应性。

图4A是甲肝患者的预期结果。阳性信号只能在检验区域56的64位点，以及两个阳性对照区域56和58中被记录到。这样的结果说明，试验血清的抗体是针对HAV抗原的，而不是其他的测试分子，所以试验的特异性是好的。

图4E是乙型肝炎感染患者的预期试验结果。阳性结果可以在56测试区域的74位点，58测试区域的78和80位点以及56和58区域的所有阳性对照样本上观察到。

实施例5

对怀孕病人进行婴儿出生前的检查

这里讨论一下通过检测孕妇血清从而完成婴儿出生前检查的生物芯片。在孕妇中要常规检测弓形虫、风疹病毒、细胞巨化病毒以及单纯疱疹病毒I和II，统称为ToRCH，因为这些疾病在孕妇的发生率比较高。这些疾病会在怀孕期间或分娩的时候传染给胎儿，对新生儿造成严重的损伤。由于有这些严重的并发症，所以对孕妇以及孕龄妇女进行免疫状态评价是非常重要的。前面提及过，五种ToRCH敏感的特异性抗原探针，以及相应的阳性和阴性对照都放置在同一个多室芯片上。这种生物芯片可以在相邻的小室内同时检测IgG和IgM，只要在相应的小室内加入荧光标记的抗人类IgG和IgM抗体即可。在ToRCH试验中，IgM的检测有助于疾病的早期诊断，因为IgM通常在感染早期即可产生，IgG则要经过较长一段时间的延迟才产生。然而IgG存在的时间比较长，即使感染已经治愈仍可以在病人血清中检测到。所以如果病人血清同时出现高水平的IgM和低水平的IgG，则说明病人现在处于急性感染期。

方法：

1.针对不同抗原的探针位于不同的测试区域。如图5A所示，在这个3×3阵列的芯片上，弓形虫位于86，风疹病毒在88，细胞巨化病毒在90，单纯疱疹病毒I在92，单纯疱疹病毒II在94，人类IgG的阳性对照在96，人类血清白蛋白作为阴性对照在98。只要在一个小池内采用适合的分割物，就可以在同一测试区域内定义这些100个不同的小室。首选的生物芯片(见图SA)包括有8个测试区域，也就是这个实施例所描述的芯片。各有两个测试区域用于阳性对照和阴性对照血清的孵化；两个区域可以对病人血清进行检测，最后两个区域对病人血清进行重复试验。

2.如实施例2对血清进行固定、烘干、模块化、反应以及洗涤。

3.为了检测病人血清中的ToRCH IgG，荧光标记的抗人类IgG抗体被加入到上述已经孵化过的其中一个小池内。

4.为了检测病人血清中的ToRCH IgM，荧光标记的抗人类IgM抗体被加入到上述血清孵化过的两个小池内。

5.图5B是感染风疹病毒病人血清的试验结果。阳性信号出现在测试分子区域88和阳性对照区域96。

6.图5C是感染细胞巨化病毒病人血清的试验结果。阳性信号出现在测试分子区域90和阳性对照区域96。

实施例6

将链霉抗生物素和生物素应用于通用的扩大方法

这是将荧光/酶标记的链霉抗生物素和生物素(FLSAB/ELSAB)方法用于蛋白芯片分析，作为一种加强的检测系统。在目前的蛋白芯片技术中，用荧光或酶标记抗体是常用的一种检测系统。这里介绍目前检测系统的信号扩大步骤。使用信号扩大系统可以将蛋白芯片的敏感度提高十倍。所以在制作芯片过程中就可以使用较少数量的探针。而且，背景减少了，信/噪比就会提高，假阳性结果的几率也会最小化，同时也简化了对酸性蛋白进行荧光染色这一冗长而艰难的步骤。制作蛋白芯片

1.在固相底物上阵列探针，如乙醛片、硝化纤维或尼龙膜。

2.玻片上的蛋白要在室温时放置过夜，或在温度为37℃时烘干1小时以进行固定。

3.底物表面要在37℃时使用含有牛血清白蛋白的封闭缓冲液封闭1小时。

4.使用双蒸水冲洗，室温下干燥保存。

方法：

1.将样本加入到蛋白芯片的每一个小室内，在37℃下孵化1小时。

2.多余的样本用冲洗缓冲液进行冲洗，烘干。

3.用封闭缓冲液进行封闭，冲洗缓冲液进行冲洗。

4.洗涤并烘干。

5.生物素缀合的生物分子与靶标记特异性的结合，用封闭缓冲液稀释，加入到小室内，在37℃时孵化30分钟。

6.洗涤并烘干。

7.使用封闭缓冲液稀释链霉抗生物素，加在芯片上，在37℃时孵化30分钟。

8.洗涤并烘干。

9.使用封闭缓冲液稀释的碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或荧光缀合的生物素，加在芯片上，在37℃时孵化30分钟。

10.如果(9)使用了酶缀合的生物素，就要采用恰当的化学发光底物并在室温下孵化1分钟。针对HRP的底物有鲁米诺，Pierce化学公司(美国)，或1，2-dioxetane底物，ICN生物医学公司(美国)(根据制造商的手册)。完成之后，洗涤芯片，去除分割物薄片，烘干芯片，使用微阵列扫描仪进行扫描。

实施例7

诊断癌症的方法和设备

这里要讲述的是一种高效率和高敏感的癌症诊断方法和生物芯片。这种芯片不仅可以在癌症早期检测到癌症，还可以确定癌症的类型和亚型。探针是相应组织特异性肿瘤标记的抗体；阳性对照是相应的肿瘤标记物，阴性对照是人类血清白蛋白。

癌症芯片是根据器官/组织类型进行分类。每种类型的癌症芯片都包括一组对组织特异性肿瘤标记物反应的抗体。每一个抗体面板表达的信息允许对癌症进行进一步的分型。例如，γ-GT I′、II、II′只存在于肝癌患者中；对伴刀豆球蛋白A反应的α-FP(R Con AAFP)主要存在于原发性肝癌病人的血清样本中，而在肝转移癌、性腺和非性腺生殖细胞瘤中R Con A AFP的含量显著降低，而非反应型α-FP增加。所以，肿瘤标记物面板在生物芯片中的应用促进了癌症的诊断、分型和亚型分型。

图6A是癌症芯片的一个测试区域，共有16个检测阵列组合(A1到D4)。每一个阵列组合都包括9个使用相同检测分子固定的分散的检测位点。区域A1内是抗α甲胎球蛋白抗体的检测分子，A2是抗γ-GT同功酶I抗体；A3是抗γ-GT同功酶I′抗体；A4是抗γ-GT同功酶II抗体；B1是抗γ-GT同功酶II`抗体；B2是抗DPC抗体；B3是抗α-岩藻糖苷酶抗体；B4是抗5`核苷磷酸二酯酶同功酶V抗体；C1是抗谷胱甘肽S转移酶胎盘形式抗体；C2是抗α-1-胰岛素抗体；C3是抗铁蛋白抗体；C4是抗异铁蛋白抗体(AIF)；D1是抗乙肝表面抗原抗体；D2和D3是13种肿瘤标记物的阳性对照以及人类IgG；D4是阴性对照。

图6B是一个肝癌病人的诊断结果，在检验区域A1、A3、A4、A5、D1，以及阳性对照区域D2和D3中出现了阳性信号。

实施例9

自体免疫疾病的诊断

自体免疫疾病是以病人体液循环中存在高水平的IgM和IgG为特征的。有两种类型的自体免疫疾病：单器官或细胞性和全身性。前一种类型的疾病包括自体免疫性溶血性贫血(AIHA)，机体的IgG自身抗体和IgM抗体水平升高，攻击自身的红细胞；重症肌无力患者肌肉无力，体内含有高水平的乙酰胆碱受体自身抗体；桥本氏甲状腺炎患者体内抗甲状腺素抗体和抗微体抗体水平增加。全身性疾病有系统性红斑狼疮(SLE)，可以检测到病人的抗核核蛋白抗体抗-dsDNA和抗-SM；风湿性关节炎病人中可以检测到类风湿因子。

方法：

1.自体免疫蛋白芯片可以检测出病人血清内的自体抗体。制作过程中，与自体免疫疾病标记物相对应的探针被安装在多室芯片上。标记物为抗核核蛋白抗体、类风湿因子、抗乙酰胆碱受体抗体、抗红细胞抗体、抗甲状腺球蛋白抗体以及抗微体抗体。

自体免疫疾病的诊断蛋白芯片设计见图7A。在同一测试区域(组装设备中代表一个小池或小室)，定义了9个独立的分区(A1到C3)。每一个分区固定用的分子都与其他分区不同。在同一个分区内，16个(4×4)测试位点内的测试分子是相同的。A1内是双链DNA分子；A2是SMITH抗原；A3是乙酰胆碱受体；B1是甲状腺球蛋白；B2是微体抗原；B3是不正常的IgG；C1是人类IgG的阳性对照；C2是阴性对照；C3是红细胞。SMITH是一种RNA和非组蛋白核蛋白的混合物，可以保持DNA的正常结构；SMITH在细胞消散时随DNA释放到血流中，是SLE的一种标记物。

2.自体免疫蛋白芯片是一种非直接的免疫化验。病人血清被加入到独立的小室内。可以像例8中所示，每份血清都被加入到两个小室，以检测IgG和IgM。血清中的自体抗体与静止时相的探针发生反应。洗涤完成之后，荧光标记的抗人类IgG抗体被加到小室内以检测发生交叉反应的IgG。

3.自体免疫蛋白芯片中，为了检测交叉反应中的二价或多价IgM，可以采用双抗原三明治方法，即在与血清发生反应之后，将荧光标记的抗原加入到反应室做进一步的检测。

4.反应结束之后，使用微阵列扫描仪对生物芯片进行扫描。

图7B是系统性红斑狼疮病人的诊断结果。阳性信号出现在测试区域A1和A2以及阳性对照位点C1。

图7C是风湿性关节炎病人的诊断结果。阳性信号出现在试验位点B3以及阳性对照位点C1。

上述详尽的描述是为了更好地说明，而不是有意将本发明限制于彩瓷公开的内容和形式，在本发明的教导基础上，可以做出许多改良和变化。例如，图4A和4C中的阵列只用于图例，在同一芯片上，可以区分出更小的测试区域。作为一种变动，同一芯片上测试区域56和58的三个相同的小区可以检验出试验血清、阳性对照和阴性对照。同时，还可以定义出更多的测试区域，只要使用合适的分隔物，并将每一个孔用数字标记好，这样在同一个生物芯片上就可以对多个病人同时进行检测。

另外，这种使用抗人类IgM和抗人类IgG抗体，如例5，对病人的抗体谱进行分析，诊断急性感染性疾病的方法，可以应用于其他多种疾病的诊断。

Claims

1、用于测试多种待分析物的装置，其包括一固相基质及一分隔物，所述基质有一个测试表面，该测试表面上有多个被限定于其上的分离的测试位点，每一个所述测试位点具有一种固定于其上的测试分子；所述分隔物在一附着表面上的预定位置上有多个孔，所述的附着表面与所述的测试表面相吻合并适合与之相附着，所述的分隔物能够可拆开地附着于所述的固相基质，以使得每一个所述的孔与所述的测试表面的一部分相贴合，从而构成多个防漏的小室，所述小室内部的所述测试表面具有多个暴露的测试位点，所述小室还具有一个自外界可进入的开口，这样液体可被引入所述小室中从而可与所述暴露的测试位点接触以进行测试。

2、权利要求1的装置，其中所述的测试分子是抗原或抗体。

3、权利要求1的装置，其中提供了一个遮盖物，所述遮盖物具有一个遮盖面，所述遮盖面适合用于关闭所述小室的开口以防止不同小室的溶液之间的溢出或污染。

4、权利要求3的装置，其中所述遮盖物是聚酯薄片。

5、用于测试多种待分析物的装置，其包括：

(a)具有一平表面的芯片，所述平表面上有多个被限定于其上的反应区域，每一个所述的反应区域还包含至少一个分离的测试位点的阵列，每一个所述的测试位点具有一种固定于其上的测试分子，和

(b)具有多个被限定于一个边框中的孔的分隔薄片，每一个所述的孔对应于一个反应区域，所述边框适合与所述平表面可拆开地连接，以使得在两者之间产生多个防漏的池，每一个反应区域形成相应的池的底部，而所述薄片的边框形成相邻的池之间的分隔壁。

6、权利要求5的装置，其中所述的测试分子是抗原或抗体。

7、分析一样品中的多种待分析物的方法，其包含以下步骤：

(a)在测试表面上的至少一个测试区域中限定多个分离的且在空间上独立的测试位点；

(b)在每一个所述的测试位点上固定一种测试分子，以使得多种测试分子固定于其上；

(c)在每一个所述测试区域周围提供一个防水屏障；

(d)将每一个所述测试区域与适当的测试试剂及待分析样品相接触；

(e)将未反应的样品及试剂移除；

(f)移除所述屏障；并

(g)分析所述测试表面上的所述样品中的待分析物和所述测试分子间的反应情况。

8、权利要求7的分析同一样品中的多种待分析物的方法，其中所述的测试表面是芯片的一面，所述的测试分子是抗体或者配体，而所述的步骤(d)及(e)还包括如下步骤：

将所述样品与每一个测试区域中的固定的测试分子共同温育以使得所述待分析物结合于其上，所述的待分析物是交叉反应配体或抗体；

移除未结合的物质；

将适当的第二分子的混合物加入到所述的反应区域并进行温育，每一种所述的第二分子具有一种偶联于其上的信号分子，所述第二分子还适合与所述的适当的待分析物特异性结合；

移除未结合的第二分子；并

在每一个所述测试位点上测试所述信号分子的存在。

9、权利要求7的方法，其中所述测试分子是一种激素、药物、受体、酶、核酸、抗生素或配体。

10、权利要求7的方法，其中所述第二分子是与所述适当的分析物发生交叉反应的第二抗体；所述信号分子是一种荧光分子，该荧光分子经激发光子激发后能够发射出发射光子，测试所述信号分子存在与否的所述步骤还包括用所述激发光激发所述信号分子以及用荧光探测器来测试发射光子的发射情况的步骤。

11、权利要求8的方法，其中所述的信号分子是一种酶，且所述的测试所述信号分子的存在与否的步骤还包括：为所述的酶提供适当的底物并与之一同温育，所述的酶适合将所述底物转化为一种沉淀在所述测试位点上的有色产物。

12、权利要求8的方法，其中所述第二分子是与所述的适当的待分析物发生交叉反应的第二抗体；所述信号分子是生物素，且所述的测试所述信号分子的存在与否的步骤还包括：将信号分子与链霉抗生物素或抗生物素蛋白接触以便两者结合；移除未结合的链霉抗生物素或抗生物素蛋白；将已结合的链霉抗生物素或抗生物素蛋白与含有第二生物素的溶液接触，所述第二生物素缀合了一种荧光分子，所述荧光分子能够发射出发射光子；在所述芯片上投射激发光子，并用探测器测试来自所述荧光分子的发射光子的发射情况。

13、权利要求6的方法，其中所述测试分子选自包含如下分子的一组：HAV抗原、HCV抗原、HDV抗原、乙肝表面抗原、乙肝“e”抗原、乙肝核心抗原、HEV抗原、抗乙肝表面抗原抗体、抗乙肝“e”抗原抗体，抗αFP抗原抗体和抗HDV抗原抗体。

14、权利要求6的方法，其中所述的测试分子选自包含如下分子的一组：弓形体、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型。

15、权利要求6的方法，其中所述的测试分子选自包含如下分子的一组：抗αFP、抗GGT同功酶I抗体、抗GGT同功酶I’抗体、抗GGT同功酶II抗体、抗GGT同功酶II’抗体、抗γ碳基凝血酶原抗体、抗α-L-岩藻糖苷酶抗体、抗5’核苷酸磷酸二酯酶同功酶V抗antitrypsin体、抗谷胱甘肽-S转移酶胎盘类型抗体、抗α-1-抗胰蛋白酶抗体、抗转铁蛋白抗体、抗酸性异铁蛋白抗体及抗乙肝表面抗原抗体。

16、权利要求6的方法，其中所述的测试分子选自包含如下分子的一组：单链核酸、双链核酸、SMITH抗原、乙酰胆碱受体、甲状腺球蛋白、微体抗原、异常人类免疫球蛋白IgG以及红细胞蛋白。