CN1356554A - 肝病诊断蛋白质芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明肝病诊断蛋白质芯片涉及一种蛋白质芯片、制备方法及检测方法,将病毒性肝炎的多项血液学检测指标相应的抗原、抗体,原发性肝癌的血液学检测指标相应的抗体以及阳性对照、阴性对照同时高密度点阵于固相载体上,蛋白质通过化学键连接于固相载体上而被固定。将所述的蛋白质样品按抗原、抗体分类,分别点阵于多样品微阵列生物芯片的不同腔室内。具有仅仅通过一次反应即可得到多种指标的抗体和抗原逐项反应结果,可以同时检测多个人份的肝病指标,灵敏度高,特异性高,检测结果稳定,可靠性高,工艺简单,操作安全,不仅效率高而且降低了成本,从而使诊断费用降低,实用性强。
Description
技术领域
本发明肝病诊断蛋白质芯片属于生命科学领域。蛋白质芯片是一种在固态基底上有序排布的蛋白质或多肽阵列,以实现对蛋白质进行并行检测、识别、鉴定和诊断的器件。可应用于生物学、医学及其相关领域。
背景技术
病毒性肝炎是法定乙类传染病,主要分甲型,乙型,丙型,丁型和戊型;具有传染性较强,传播途径复杂,流行面广泛,发病率高,治愈困难等特点。部分乙型、丙型和丁型肝炎患者可演变成慢性,并可发展成为原发性肝细胞癌。原发性肝细胞癌为我国常见恶性肿瘤之一,死亡率在恶性肿瘤中居第三位;值得注意的是它的发病率有上升趋势,且其中40%发生在中国。病毒性肝炎的发病机理较为复杂,迄今尚未完全阐明。临床上通过检测各种抗原和抗体来检测肝炎感染情况,为预防肝炎感染,控制治疗进程,了解愈后状况提供必要的资料。原发性肝癌的病因与发病原理迄今尚未确定。但动物实验及临床上均发现肝癌细胞能够合成一种特殊蛋白-甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)。AFP是原发性肝癌最灵敏最特异的肿瘤标志。临床上可凭借检测血清AFP的含量以诊断原发性肝癌,阳性率可达90%左右,且可发现无症状病例;为肝癌的早期诊断,早期治疗提供了可能,同时还可作为治疗效果的评价指标。本发明主要针对病毒性肝炎(Viral Hepatitis)和原发性肝细胞癌(PrimaryCarcinoma of the liver)的肝病联合诊断芯片。
目前临床上进行病毒性肝炎诊断的方法主要是用酶联免疫分析技术(Enzyme-Linked Immunoassay,EIA)检测血清中的抗体(IgG或IgM)和抗原。而临床上进行AFP检查的方法有三种:1.反向间接血球凝集法(血凝法)2.放射火箭电泳自显影法(火箭法)3.放射免疫测定法(放免法)。病毒性肝炎的EIA试剂盒是逐项进行检查,每次反应只能检测一个指标,速度慢,效率低,诊断费时费力;且灵敏度有局限,实验中所用底物也是剧毒化学品,对实验人员造成威胁。用血凝法和火箭法检测原发性肝癌灵敏度较高,但假阳性率也随之增高;放免法虽较精确,但操作烦琐,且放射物亦会对检测人员造成伤害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可多指标同时检测的肝病诊断蛋白质芯片,以及芯片的制备方法和检测方法。
本发明目的可通过下技术方案实现:是把病毒性肝炎和原发性肝癌的多项血液检测指标相应的抗原或抗体同时点阵于固相载体上,肝病诊断蛋白质芯片,特点是,将病毒性肝炎(Viral Hepatitis)的多项血液学检测指标相应的抗原、抗体,原发性肝癌(PrimaryCarcinoma of the liver)的血液学检测指标相应的抗体以及阳性对照、阴性对照同时高密度点阵于固相载体上,蛋白质通过化学键连接于固相载体上而被固定,所述固相载体可以是经戊二醛活化的玻璃。仅仅通过一次反应即可得到多种肝病指标的逐项反应结果,从而大大提高检测的速度和效率。
其中,抗原检测指标包括乙肝表面抗原(HBsAg),乙肝e抗原(HbeAg),甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP);抗体检测指标包括甲肝病毒抗体(anti-HAV IgG或IgM),乙肝表面抗体(HbsAb),乙肝e抗体(HbeAb),乙肝核心抗体(HBcAb),丙肝病毒抗体(anti-HCVIgG或IgM),丁肝病毒抗体(anti-HDV IgG或IgM),戊肝病毒抗体(anti-HEV IgG或IgM)。在固相载体上点阵的抗体或抗原为纯化的针对上述指标的特征性抗体或抗原。
在上述技术方案基础上,本发明的目的可通过下述技术方案实现:采用多样品微阵列生物芯片技术,可以同时检测多个人份的多种肝病,包括病毒性肝炎和原发性肝癌。肝病诊断蛋白质芯片,是将肝病抗体检测指标相应的抗原及阳性对照、阴性对照点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内;肝病抗原检测指标相应的抗体以及阳性对照、阴性对照点阵于多样品微阵列生物芯片的另一个腔室内,多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述指标的抗原或抗体。
在上述方案的基础上,本发明也可以采用抗原—抗体—荧光二抗方法检测病人血清中的病毒性肝炎抗体,即是将病人血清滴加于芯片表面,病人血清中的待测抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合,洗去未结合的其他物质后,加入荧光标记的二抗,洗去未结合的二抗,样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。如图1抗原—抗体—荧光二抗方法检测血清中抗体的原理图所示。
也可以采用双抗体夹心法检测病人血清中病毒性肝炎的抗原和AFP,即是将病人血清滴加于芯片表面,病人血清中的待测抗原分别与固定在芯片上的相对应的抗体结合,洗去未结合的其他物质后,加入荧光标记的另一种抗体,可以用多种荧光染料标记多种抗体,洗去未结合的抗体,样品点的荧光强度与血清中抗原浓度大小成正比。如图2双抗体夹心法检测血清中抗原的原理图所示。
本发明肝病诊断蛋白质芯片的制备方法如下:第一步,根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片,确定点阵的排列方式和点样位置;第二步,点样针从多孔板取出蛋白质样品(肝病检测多项指标的相应抗原或抗体以及阳性对照、阴性对照)后直接高密度点印于固相载体上;第三步,室温过夜或37℃温育1小时,以固定样品;第四步,利用制作蛋白质芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
本发明具有下述优越性:第一,多指标同时检测。本技术把肝病的多项指标的抗原和抗体同时点阵于一张玻璃片上,仅仅通过一次反应即可得到多种指标的抗体和抗原逐项反应结果,因而大大提高了检测的速度和效率。第二,该芯片的组合为综合诊断肝病提供了良好的依据。第三,由于采用了多样品微阵列生物芯片技术,可以同时检测多个人份的肝病指标。第四,灵敏度高于传统方法。第五,特异性高,检测结果稳定,可靠性高。第六,工艺简单,操作安全,不仅效率高而且降低了成本,从而使诊断费用降低,实用性强。
附图说明附图1,抗原—抗体—荧光二抗方法检测血清中抗体的原理图。附图2,双抗体夹心法检测血清中抗原的原理图。附图3,检测抗体的腔室中的点样阵列实施例,其中●——阳性对照○——生物探针——阴性对照A1:HAV-AgA2:HCV-AgA3:HDV-AgB1:HBsAgB2:HBeAgB3:HBcAgC1:HEV-AgC2、C3:阴性对照附图4,检测抗原的腔室中的点样阵列,其中●——阳性对照○——生物探针——阴性对照A1:HBsAbA2:HBeAb HCVB1:HDV-AbB2:AFP-Ab附图5,该病人抗-HAV-IgG阳性,表明感染甲肝。附图6,该病人抗-HCV-IgG阳性,表明感染丙肝。附图7,该病人抗HBsAg阳性,表明曾感染过乙肝,并已恢复。附图8,该病人抗HEV-Ag阳性,表明感染戊肝。附图9,该病人HbsAg,HbeAg,HBcAb均阳性,表明感染乙肝(大三阳)。
附图10,该病人AFP阳性,表明可能患有原发性肝癌。
附图11,该病人HbsAg,HbeAb,HBcAb均阳性,表明感染乙肝(小三阳)。
具体实施方式
本发明肝病诊断蛋白质芯片是将病毒性肝炎的多项血液学检测指标的抗原、抗体,原发性肝癌的血液学检测指标的抗体以及阳性对照、阴性对照同时高密度点阵于固相载体上,抗原检测指标和抗体检测指标分别位于微阵列生物芯片的不同腔室内。抗原检测指标包括HBsAg,HbeAg,AFP);抗体检测指标包括anti-HAV IgG或IgM,HbsAb,HbeAb,HBcAb,anti-HCV IgG或IgM,anti-HDV IgG或IgM,anti-HEV IgG或IgM。将病人血清滴加于芯片表面,病人血清中的待测抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合,洗去未结合的其他物质后,加入荧光标记的二抗,洗去未结合的二抗,样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。或者病人血清中的待测抗原分别与固定在芯片上的相对应的抗体结合,洗去未结合的其他物质后,加入荧光标记的另一种抗体,(可以用多种荧光染料标记多种抗体),洗去未结合的抗体,样品点的荧光强度与血清中抗原浓度大小成正比。本实施例点阵法采用如附图3检测抗体的腔室中的点样阵列实施例和附图4检测抗原的腔室中的点样阵列所示的点样阵列,检测病人血清,检测结果图5至图11所示,附图5至附图11使用上述肝病诊断芯片诊断病人血清举例,左图为肝病抗体检测指标结果,右图为肝病抗原检测指标结果,其中:
点样、制作技术:第一步,根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片,确定点阵的排列方式和点样位置;第二步,点样针从多孔板取出蛋白质样品(肝病检测多项指标的相应抗原或抗体以及阳性对照、阴性对照)后直接高密度点印于固相载体上;第三步,室温过夜或37℃温育1小时,以固定样品;第四步,利用制作蛋白质芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
杂交反应:第一步,在点好样的芯片上滴加病人血清样品,37℃温育1小时,使抗原抗体充分反应;第二步,用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品,室温晾干;第三步,加封阻液封阻并再次洗净晾干;第四步,滴加以封阻液稀释过的荧光标记二抗或荧光标记抗原;第五步,37℃避光温育30分钟,洗净并室温晾干。
结果的检测:反应结束后,利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。
结果如附图5,该病人抗-HAV-IgG阳性,表明感染甲肝。附图6,该病人抗-HCV-IgG阳性,表明感染丙肝。附图7,该病人抗HBsAg阳性,表明曾感染过乙肝,并已恢复。附图8,该病人抗HEV-Ag阳性,表明感染戊肝。附图9,该病人HbsAg,HbeAg,HBcAb均阳性,表明感染乙肝(大三阳)。附图10,该病人AFP阳性,表明可能患有原发性肝癌。附图11,该病人HbsAg,HbeAb,HBcAb均阳性,表明感染乙肝(小三阳)。
Claims (7)
1,肝病诊断蛋白质芯片,其特征在于,将病毒性肝炎(Viral Hepatitis)的多项血液学检测指标相应的抗原、抗体,原发性肝癌(PrimaryCarcinoma of the liver)的血液学检测指标相应的抗体以及阳性对照、阴性对照同时高密度点阵于固相载体上,蛋白质通过化学键连接于固相载体上而被固定,所述固相载体经戊二醛活化的玻璃。
2,根据权利要求1所述的肝病诊断蛋白质芯片,其特征在于,肝病检测指标分为抗原检测和抗体检测两部分:抗原检测指标包括乙肝表面抗原(HBsAg),乙肝e抗原(HbeAg),甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP);抗体检测指标包括甲肝病毒抗体(anti-HAV IgG或IgM),乙肝表面抗体(HbsAb),乙肝e抗体(HbeAb),乙肝核心抗体(HBcAb),丙肝病毒抗体(anti-HCV IgG或IgM),丁肝病毒抗体(anti-HDV IgG或IgM),戊肝病毒抗体(anti-HEV IgG或IgM),所述在固相载体上点阵的抗体或抗原为纯化的针对上述指标的特征性抗体或抗原,阴性对照采用牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin,BSA)或者人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA),抗体检测区阳性对照采用人类免疫球蛋白G或M(IgG或IgM),抗原检测区阳性对照采用相应的抗原。
3,根据权利要求1、2所述的肝病诊断蛋白质芯片,其特征在于,采用多样品微阵列生物芯片技术。即是将肝病抗体检测指标相应的抗原及阳性对照、阴性对照点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内;肝病抗原检测指标相应的抗体以及阳性对照、阴性对照点阵于多样品微阵列生物芯片的另一个腔室内,多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述指标的抗原或抗体。
4,根据权利要求1、2所述的肝病诊断蛋白质芯片,其特征在于,采用抗原—抗体—荧光二抗方法检测病人血清中的病毒性肝炎抗体,即是将病人血清滴加于芯片表面,病人血清中的待测抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合,洗去未结合的其他物质后,加入荧光标记的二抗,洗去未结合的二抗,样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。
5,根据权利要求1、2所述的肝病诊断蛋白质芯片,其特征在于,采用双抗体夹心法检测病人血清中病毒性肝炎的抗原和AFP,即是将病人血清滴加于芯片表面,病人血清中的待测抗原分别与固定在芯片上的相对应的抗体结合,洗去未结合的其他物质后,加入荧光标记的另一种抗体,其中,用多种荧光染料标记多种抗体,洗去未结合的抗体,样品点的荧光强度与血清中抗原浓度大小成正比。
6,肝病诊断蛋白质芯片的制备方法,其特征在于,第一步,根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片,确定点阵的排列方式和点样位置;第二步,点样针从多孔板取出蛋白质样品(肝病检测多项指标的相应抗原或抗体以及阳性对照、阴性对照)后直接高密度点印于固相载体上;第三步,室温过夜或37℃温育1小时,以固定样品;第四步,利用制作蛋白质芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
7,肝病诊断蛋白质芯片的检测方法,其特征在于,进行杂交反应:第一步,在点好样的芯片上滴加病人血清样品,37℃温育1小时,使抗原抗体充分反应;第二步,用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品,室温晾干;第三步,加封阻液封阻并再次洗净晾干;第四步,滴加以封阻液稀释过的荧光标记二抗或荧光标记抗原;第五步,37℃避光温育30分钟,洗净并室温晾干;第六步,反应结束后,利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。
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