CN110687082A - 用于检测抗体的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗原芯片(5)，其具有平坦的基质表面(9)；并且具有抗原斑点(11a，…，11e)，所述抗原斑点以预先确定的图案施加在基质表面上并且包含第一荧光染料。此外本发明涉及用于检测样品中的抗体的装置和方法。此外本发明还涉及一种使用在用于检测样品中的抗体的方法中的成套系统。
Description
技术领域
本申请涉及用于检测抗体的抗原芯片或抗原基质和用于检测具有抗原芯片的样品中的抗体的装置。此外，本申请涉及用于制造抗原芯片/基质的方法以及用于检测样品中的抗体的方法。此外，本申请还涉及一种使用在用于检测样品中的抗体的方法中的成套系统。
背景技术
按常规，使用间接的免疫荧光技术来辨识液体样品中的抗体。为此可以例如使用细胞、组织切片或经净化的在生化方面特征化的物质作为抗原基质。在第一孵化步骤中，在样品中包含的要证明的(初级的)抗体结合到固相结合的抗原上。在第二孵化步骤中，(次级的)荧光标记的抗人抗体结合到该从所述样品中结合的抗体上。然后，在荧光显微镜中可以基于荧光标记检测结合的二次抗体，所述荧光标记指示样品中存在特定于每个抗原的一次抗体。
WO 2012/094427 A1公开了用于通过荧光检测来检测抗体的荧光的方法。US2005/0124017公开了用于检测样品中的蛋白质、抗体、毒品或其他配合基的荧光成像，其中扫描图像。US 2004/0253640公开了包括在其上压印的蛋白质的微阵列，以便通过免疫荧光检测目标蛋白。WO 2017/025954 A1公开了用于免疫荧光检测的抗原芯片，其中为了检测而扫描抗原芯片。WO 2012/052994 A2公开了一种微阵列，以用于使免疫反应的高流量特征化。WO 2012/037369 A公开了通过荧光检测来检测抗体。WO 2004/027379 A公开了滚球技术，以用于检测在抗原微阵列上结合的一次抗体。WO 2000/063701 A2公开了多肽微阵列，以例如用于检测抗体，其中使用荧光检测并且扫描微阵列。
US 2017/0016052 A1公开了包括内部对照的阵列系统。
WO 2011/101487 A1公开了用于通过同时检测结合到合成基质和蜂窝式基质上的抗体来诊断疾病的方法，其中通过间接的免疫荧光检测抗体。合成基质是微粒或被经净化的原始抗原或重组抗原涂层的球，荧光显微镜装备有相机和扫描系统。
EP 2 362 222公开了用于诊断疾病方法，其中同时检测结合到蜂窝式基质或织物基质上或结合到合成基质上的抗体，所述合成基质例如是微粒或被特定抗原涂层的球。在此利用多色荧光显微镜来检测结合的抗体，其中基质和结合的抗体具有不同的荧光色。
要注意，常规的用于检测抗体的系统和方法不能在所有情况下并且在可接受的测量时间中实现对多种抗体的可靠检测。常规的方法也要求相对大量的抗原或样品。此外，常规的方法仅有限地适用于在例行医学诊断中的高流量应用。
发明内容
因此本发明的任务是提供辅助可靠检测在液体样品中的多种抗体的系统和方法，其尤其是适合用于例行医学诊断并且此外尤其是提供至少半定量的结果。
所述任务通过独立权利要求的涉及抗原芯片、用于检测样品中的抗体的装置、用于制造抗原芯片的方法和用于检测样品中的抗体的方法的主题解决。此外所述任务通过一种使用在用于检测样品中的抗体的方法中的成套系统解决。从属权利要求限定本发明的特别实施形式。
按照本发明的一种实施形式，提供一种抗原芯片，其具有平坦的基质表面和抗原斑点，所述抗原斑点以预先确定的图案施加在基质表面上并且包含发光体、生色基质或第一染料、尤其是第一荧光染料。
所述芯片可以理解为固体基质、例如玻璃板或例如硅板。所述芯片也可以由塑料亦或由金属制造。所述芯片可以透光或不透光，以便辅助透射光或反射光照明或检测。抗原芯片可以在扫描器或相机系统、尤其是荧光显微镜中用于研究样品并且可以然后被照明光或激励光照射。通过照明光或激励光，可以在抗原斑点中激励第一染料、尤其是荧光染料，以便发出光、也就是说第一辐射(例如由第一染料反射的照明光)、尤其是第一荧光。如果此外来自样品的抗体结合到确定的抗原斑点上并且所述抗原斑点或整个抗原芯片此外被二次的荧光标记的抗体温育，则优选也激励第二荧光染料(其结合到二次抗体上)以便发出光、也就是说第二荧光。
第一荧光可以包括在第一波长范围中的光的发出并且第二荧光可以包括在第二波长范围中的光的发出，其中，第一波长范围和第二波长范围只具有小的重叠范围或基本上没有重叠范围，如例如少于第一荧光的发射在波长上的积分的10％、尤其是少于5％的重叠范围或重叠。关于第二荧光可以给出类似的定义。第一和第二荧光的激励可以通过相同或不同的波长或波长范围进行。
抗原斑点可以压印或点涂到平坦的基质表面上。为此可以使用如在现有技术中已经使用的压电印刷技术。所述预先确定的图案可以例如定义抗原斑点的布置结构、尺寸和/或形状。所述预先确定的图案可以在实施用于检测样品中的抗体的方法期间用于定位斑点和/或用于辨识在抗原斑点中相应包含的抗原。例如包含相同抗原的抗原斑点可以多次在抗原芯片上出现并且沿一条线以特定的斑点间距设置和/或具有确定的形状和/或确定的尺寸。包含不同抗原的抗原斑点可以同样设置在一条线上，然而可以具有不同的(或相同的)斑点间距，可以具有不同的(或相同的)形状并且可以具有不同的(或相同的)尺寸。
抗原芯片可以使用在按照本发明的一种实施形式的用于检测样品中的抗体的方法中。
发光体、生色基质或第一染料、尤其是荧光染料可以通过在以照明光照射、尤其是由激励光激励之后检测第一辐射、尤其是第一荧光的荧光检测而允许或便于对抗原斑点的定位。然后选择性地在抗原斑点的确定位置上可以检测第二化学发光或荧光，其通过在激励第二荧光染料之后发出光实现。可能在所有抗原斑点外结合到平坦的(单纯的)基质表面上的一次和/或二次抗体然后可以识别为测量基底。源于测量基底的荧光信号然后可以例如从源于抗原斑点的荧光信号中抽出，以便因此提高测量精度。
按照本发明一种实施形式，抗原芯片这样构成，使得包含不同抗原的抗原斑点包含不同量或浓度的发光体、生色基质或第一染料、尤其是荧光染料，使得由其反射的第一辐射、尤其是激励的第一荧光具有不同的强度或基本上相同的强度。例如一行(或多行)抗原斑点可以具有确定的抗原斑点间距，从而该行抗原斑点可以相对于其他行抗原斑点区分开并且因此产生一个或多个参考行。抗原线/对照线彼此的区别特征可以是第一荧光的不同强度。例如从不同线的抗原斑点反射的第一辐射、尤其是激励的第一荧光可以具有基本上不同的强度，以便可以区分和/或辨识所述线。
当包含不同抗原的抗原斑点在由激励光激励之后基本上发出相同的(或预先确定的不同的)强度的第一荧光时，则抗原斑点的定位可以按照统一的方法较可靠地实施。用于拍摄第一图像的曝光然后也可以更简单地调节并且可以尤其是放弃以不同的曝光时间对第一图像多次拍摄。借此可以加速并且较可靠地实施所述方法。
在不同抗原斑点中包含的抗原可以通过抗体的结合证明自身免疫性疾病、过敏和传染病。在当前的测试系统中，可以尤其是涉及来自胶原蛋白区域的抗核的和可提取的抗核的抗体。
在不同抗原斑点中包含的抗原可以选择并且构成用于，结合作为自身免疫性疾病、过敏和传染病的结果形成的抗体。在当前的测试系统中，这尤其是涉及来自胶原蛋白区域的抗核的和/或可提取的抗核的抗体。尤其是例如如下抗原(单独或以任意组合)可以包含在抗原斑点中：RNP/Sm、Sm、Scl-70、Rib.P0、Jo-1、SS-A、SS-B、dsDNA、抗核小体抗体/染色质(Nukleosomen/Chromatin)、Cenp-B、RNP A,C,68kDa、Ro-52、Ku、组蛋白(Histone)、DFS70。可诊断的胶原蛋白可以包含至少一种如下形式：SLE(系统性红斑狼疮，Systemiclupus erythematosus)、PM、DM(肌炎，Myositis)、SS(Sjoegren综合症)、CREST综合症(系统性硬化IcSSc的受限皮肤形式，limited cutaneous form of systemic sclerosisIcSSc)、PSS(进行性全身性硬化，progressive systemic sclerosis)、MCTD(混合性结缔组织病、尖锐综合征，mixed connective tissue disease,sharp syndrome)、AID(自身免疫诱发疾病，autoimmune induced disease)。借此可以诊断不同的病。
如在里使用的表达“化学发光”涉及化学反应，其中能量特定地引导至分子，这引起所述分子被电子激励并且随后释放光子，由此发射可见光。热能对于该反应不需要。化学发光因此包含从化学能至光能的直接转换。优选地，化学发光通过发光体与其他化合物的反应产生。该反应可以通过酶催化。在本发明的进一步优选的实施形式中，发光体从包括鲁米诺和其衍生物、吖啶和其衍生物以及荧光素的组中选择。这些化合物可以通过不同的酶的反应激励以便化学发光。对应的化合物和反应在现有技术中已知。在本发明的进一步优选的实施形式中，发光体是鲁米诺或其衍生物，其中通过由过氧化物酶、尤其是Meerettich过氧化物酶(Meerettichperoxidase)催化的反应来发射光(化学发光)。在本发明的备选的实施形式中，发光体是吖啶或其衍生物、尤其是吖啶酯(Acridiniumester)或酰基硫磺酰胺(Acridiniumsulfonamid)，其中通过由磷酸酶(Phosphatase)、尤其是碱性的磷酸酶(AP)催化的反应来发射光(化学发光)。在本发明的其他的备选的实施形式中，发光体是荧光素、尤其是D荧光素，其中通过由荧光素酶催化的反应来发射光(化学发光)。
“生色基质”在本发明的意义中是如下试剂，其可以用于测量酶活性。生色基质通过酶的活性这样改变，使得可以(光度计)量化酶的反应的直接或间接产物。生色基质例如由寡肽制成，偶氮染料、例如次硝基苯胺耦合到所述寡肽上。肽仿制要研究的酶分裂其生理性基质所在的界面。通过酶作用释放染料。彩色显影可以光度计量化并且通过校验曲线确定酶活性。生色基质当然也可以是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)和/或硝基氯化四唑嗪(NBT)。生色基质可以例如比色分析地证明。
按照本发明的一种实施形式，抗原芯片这样构成，使得相同抗原的抗原斑点分别设置在一条线中，尤其是以预先确定的斑点间距设置，其中配置给不同抗原的线尤其是具有预先确定的线间距，其中此外尤其是两条线的线间距大于在一条线内的斑点间距。但备选地，两条线之间的间距也可以小于一条线内的斑点间距。
用于检测样品中的抗体的装置的评价系统可以例如构成用于确定在抗原斑点的两条线之间的线间距和/或确定在一条线内的抗原斑点的斑点间距。斑点间距可以对于抗原斑点特定，所述抗原斑点包含确定的抗原。因此可以由确定的斑点间距推断出在要研究的线的抗原斑点中包含的抗原。抗原斑点的第一线与抗原斑点的第二线的线间距可以同样确定，以便确定一个或多个包含在与第一线相邻的第二线的抗原斑点中的抗原，对于所述第一线已经确定在抗原斑点中包含的抗原。确定的线间距和确定的斑点间距可以组合，以便确定抗原斑点的可靠定位和/或抗原斑点与确定的抗原的配置。
抗原斑点可以具有不同的形状，尤其是其可以基本上为圆形并且可以基本上具有不同的尺寸、尤其是基本上相同的或不同的直径。借此可以使用常规的点涂技术，以便将抗原斑点施加到基质表面上。
按照本发明的一种实施形式，抗原芯片这样构成，使得在基质表面上还施加至少一个、两个、尤其是至少三个斑点或抗原斑点的线(也称为校验点或内部校验器)，其包含以相同或不同的量或浓度的一次抗体(例如IgG)。在以荧光标记的二次抗体(其用第二荧光染料标记)孵化之后，也可以从包含一次抗体的校验点发出第二荧光，并且更确切地说是对应于一次抗体的不同量或浓度以不同的强度发出。由此可以通过评价第二荧光的强度由评价系统实施校验，以便允许结合到其他抗原斑点上的抗体的量化。例如不同的量或浓度可以预先确定或已知。从不同校验点检测的、第二荧光的强度可以配置给相应的量或浓度并且可以进行向中间浓度或比在校验点中包含的浓度大或小的浓度的外插或内插。借此抗原芯片可以辅助在样品中的抗体的定量的或至少半定量的分析。为了精确的量化，可以使用外部校验器(以校验器血清的形式)。
按照本发明的一种实施形式，抗原芯片这样构成，使得在基质上还施加至少一条线、尤其是抗原的线作为阳性对照，该至少一条线相比于抗原芯片的其他线的点距具有较小的点距。在一种实施形式中，该线可以呈现为连续的线。换句话说按照本发明的一种实施形式，抗原芯片这样构成，使得在基质上斑点以直至连续的线不同的间距呈现。
按照另一种实施形式，例如包含相同抗原的抗原斑点可以沿一条线设置，其中其斑点间距这样小，使得不同的斑点相互处于接触中并且被察觉为连续的线。亦即本发明的抗原芯片具有芯片，所述芯片仅由斑点、仅由线或由斑点和线的组合构成。
阳性对照(例如抗人(anti-human)IgG)可以用于确定究竟是否相关的抗原芯片已用样品温育。每个期待的样品可以例如在每种情况中包含一个或多个确定的抗体，即使没有病理学的条件存在亦是如此。阳性对照的位置或定位也可以通过评价系统确定并且可以尤其是考虑用于确定抗原芯片的取向。例如在线内的特殊的斑点间距和/或具有彼此不同的斑点间距的线的布置结构可以用于在芯片上的抗原的取向。借此可以较可靠地实施抗体的分析。
第一荧光染料可以例如在红色的波长范围中发荧光，例如在550nm和大约800nm之间的范围中，在650nm和700nm之间有最大值。为此可以例如使用第一荧光染料DY521XL。第一荧光染料的激励可以在例如450nm和650nm之间的频率范围中进行，例如在500nm和540nm之间有最大值。第二荧光染料的激励可以基本上以与第一荧光染料的激励相同的波长范围进行。借此在用于检测样品中的抗体的装置中，例如只需要唯一的照明光源以用于产生激励光，所述照明光源可以相对窄带地实施。借此可以有利地将激励光过滤掉，然后第一荧光通过第一相机并且第二荧光通过第二相机或两个荧光信号通过第一或第二相机(例如在滤光器更换之后)检测，而不会检测主要是干扰的激励光。
按照本发明的一种实施形式，基质表面被微结构化以用于对焦。微结构化可以通过表面处理(例如粗糙化)实施并且可以便于到基质表面上的对焦。用于微结构化的不同方法、例如注塑、热压花或压印方法在现有技术中已知。不同的微结构标记可以施加在表面上，所述微结构标记也可以用于辨识抗原芯片、用于辨识样品等。
抗原基质(芯片)尤其是包括具有在1mm x 1mm和2mm x 4mm之间的尺寸的面积。
按照一种实施形式，抗原斑点不具有在其中结合有抗原的凝胶或凝胶斑点或凝胶垫、尤其是(3D)聚合物凝胶和/或聚丙烯酰胺凝胶。按照一种实施形式，抗原斑点仅具有第一染料、生色基质或发光体、抗原和没有聚合物的(干燥的)缓冲器和/或具有在0.1μm和5μm之间的厚度。
要指出，按照本发明的实施形式，单独或以任何组合关联抗原芯片说明、解释或提供的特征同样可以单独或以任何组合应用到用于检测样品中的抗体的装置上，可以应用到用于制造抗原芯片的方法上，并且也可以应用到用于检测样品中的抗体的方法上，并且反之亦然。
按照本发明的一种实施形式，提供一种用于检测样品中的抗体的装置，具有：按照上述实施形式之一的抗原芯片；以及包括照明源(例如荧光显微镜)的扫描器或相机系统，所述照明源构成用于产生照明光、尤其是第一波长的激励光，并且所述照明源设置用于照明、尤其是照射抗原芯片；第一相机，其构成用于通过检测从样品出发的由照明光引起的第一辐射、尤其是由激励光激励的第一荧光拍摄第一图像，和/或构成用于通过检测从样品出发的化学发光或由照明光、尤其是激励光激励的第二荧光拍摄第二图像。
扫描器和/或相机系统、尤其是荧光显微镜(55)可以此外具有第二相机，所述第二相机构成用于尤其是当第一相机不可以执行第二荧光的检测时通过检测从样品出发的化学发光或由激励光激励的第二荧光拍摄第二图像。
用于获取化学发光或荧光的扫描器或相机系统、例如荧光显微镜可以具有对象保持装置，抗原芯片可以保持在所述对象保持装置上。荧光显微镜可以此外具有物镜，所述物镜可以具有一个或多个透镜，当照明源照明抗原芯片时，利用所述透镜可以产生抗原芯片的或抗原芯片的至少一部分的放大图像。荧光显微镜此外可以具有至少一个分束器(例如半透镜)，以便将从抗原芯片出发的(荧光)光的一部分指向到第一相机上并且将另一部分指向到第二相机上。所述装置可以构成用于相对于第二图像同时或时间延迟地拍摄第一图像。在拍摄第一图像和拍摄第二图像期间，照明源可以将激励光指向到抗原芯片上。激励光激励第一荧光染料，以用于发出第一荧光。在优选的实施形式中，其也激励第二荧光染料(所述第二荧光染料尤其是结合到二次抗体上)，以用于发出第二荧光。因此所述装置只需要具有单独的照明源，以便在使用以上说明的抗原芯片的情况下实施用于检测样品中的抗体的方法。所述照明源可以例如具有激光器、LED、尤其是cLED。其他光源也是可能的。
所述装置此外可以具有第一滤光器，所述第一滤光器在第一光路中设置在第一相机上游并且构成用于基本上除去激励光和/或第二荧光的光，并且所述装置尤其是此外具有第二滤光器，所述第二滤光器在第二光路中设置在第二相机上游并且构成用于基本上除去激励光和第一荧光的光。第一滤光器可以让在第一荧光的最大值周围的第一波长范围经过，然而可以基本上除去在第二荧光的最大值周围的第二波长范围。借此可以可靠地实施抗原斑点的定位。反之，第二滤光器可以基本上让在第二荧光的荧光的最大值周围的第二波长范围经过，而在第一荧光的最大值周围的第一波长范围的光基本上除去或减弱。借此可以可靠地确定结合到不同的抗原斑点上或结合到其中包含的抗原上的抗体的量。第一光路或第一荧光可以例如包含红色的光并且有时也称为红色通道。第二光路或第二荧光可以例如包含绿色的光并且有时也称为绿色通道。然而在其他的实施形式中，在第一光路或第二光路中或在第一荧光和第二荧光中具有其他波长的光，但只要对应的波长范围充分彼此分开或较少重叠的话。所述系统可以对于两种荧光染料利用一个(唯一的)激励波长(或激励波长范围)。按照另一种实施形式，两种荧光染料以不同的波长或波长范围(例如不同的光源)激励。
在所述装置的一种优选的实施形式，所述装置这样构成，使得可以激励和检测荧光，其中第一和第二荧光可通过相同的波长激励。在进一步优选的实施形式中，第一荧光通过DY-521-XL的激励并且第二荧光通过异硫氰酸荧光素(FITC)的激励产生。
此外所述装置可以按照本发明的一种实施形式具有评价系统，所述评价系统构成用于，基于第一图像确定抗原斑点的位置，将抗原斑点的位置借助预先确定的图案配置给相应的抗原，并且基于第二图像、尤其是至少半定量地识别结合到抗原斑点上的抗体。
第一图像也可以称为红色图像并且第二图像也可以称为绿色图像。第一相机并且还有(可选的)第二相机可以在此分别具有光敏性元件的、例如光电二极管的光敏性区(例如二维区)，或可以例如作为CMOS传感器区构成。第一相机并且还有第二相机可以在此例如具有合适的成像光学系统。
评价系统可以构成用于实施图像处理。评价系统可以例如通过软件控制并且可以具有处理器，所述处理器构成用于执行所述软件。由评价系统确定的抗原斑点的位置可以与预先确定的图案的位置相关联，以便例如确定在显微镜上的取向和放大并且使之彼此协调。例如评价系统可以构成用于将在第二图像中的强度在如下区域上积分(或求平均)，在所述区域上在第一图像中已确定抗原斑点。从这些积分的或平均的强度然后可以例如抽出背景荧光/背景强度，也就是说在第二图像的处于在第一图像中确定的抗原斑点外的区域上的强度。所述评价系统可以因此构成用于评价第二图像，以便确定由各个抗原斑点发出的第二荧光的强度，并且尤其是将包含相同抗原的多个抗原斑点的强度求平均。源于包含相同抗原的抗原斑点的强度的平均可以提高测量精度。
按照本发明的一种实施形式，所述评价系统此外构成用于在第二图像中确定从至少一个、两个或三个或更多个校验点或校验点行出发的第二荧光的强度，以便实施校验，其中所述校验点或校验点行以不同的量或浓度包含一次抗体(例如IgG)。在校验点中一次抗体的量或浓度可以在先已知或预先限定。由评价系统可以通过检测从校验点或校验点行出发的强度而导出浓度或量和获得的强度的相关性。例如来自不同样品的抗体的量可以在给定的病人的疾病过程中相对于彼此确定。反之则可以由从确定的抗原斑点出发的第二荧光的检测的强度推断出结合到该抗原斑点上的抗体的浓度或量，以便能够实现定量的或至少半定量的评价。
按照本发明的一种实施形式，评价系统此外构成用于在第一图像中识别至少一条线、尤其是具有相比于抗原芯片、抗原(作为阳性对照)的其他线的点距较小的点距的线，以便确定抗原芯片的取向。
按照本发明的一种实施形式，提供一种用于制造用于间接免疫荧光诊断的抗原芯片的方法，其具有：以对于每个抗原预先确定的图案将抗原斑点施加到基质的平坦的基质表面上，所述抗原斑点包含发光体、生色基质或第一染料、尤其是第一荧光染料；压碎基质(例如在任意位置和/或折断曲线上分成多个块，即位置不精确的压碎)，以便获得多个抗原芯片。因为在优选的实施形式中碎块大于阵列，所以在芯片/基质上存在用于阵列的至少一个完整的斑点组。将基质压碎成多个块以便获得多个抗原芯片，可以以在断错线或交截线的定位方的一定的不精确性进行。不需要抗原斑点相对于抗原芯片的边缘的绝对定位，以便实施用于检测抗体的方法，因为在检测方法期间确定抗原斑点的位置，而没有假定抗原斑点的预先确定的绝对定位。在包括至少两个参考抗原斑点或参考抗原斑点行的优选实施形式中可能的是，将抗原基质(例如在制造过程期间)以180°旋转并且基于具有例如可不同的斑点间距/图案的所述至少两个参考抗原斑点或参考抗原斑点行进行抗原斑点的明确配置。借此可以使用相对不准确的制造方法或压碎方法，这可以简化花费、费用和制造的复杂性。
抗原斑点的施加可以借助压电的微计量仪器实施，并且基质表面可以尤其是玻璃基质的表面或被膜片和/或薄膜涂层的玻璃基质的表面。借此所述制造可以常规的基本材料和制造机器实施。
按照本发明的一种实施形式，提供一种用于尤其是通过间接免疫荧光检测样品中的抗体的方法，其中，所述方法具有：提供抗原斑点，所述抗原斑点包含发光体、生色基质或第一染料、尤其是第一荧光染料并且以预先确定的图案设置在平坦的基质上；用样品温育抗原斑点；用二次抗体温育抗原斑点，所述二次抗体以第二发光体、第二生色基质、酶或第二荧光染料标记；用照明光、尤其是激励光照明抗原斑点，以便触发第一辐射(例如从斑点、尤其是第一染料反散射的照明光)，尤其是以便激励第一荧光染料的第一荧光(例如红光通道)，并且激励第二荧光染料的第二荧光(例如绿色通道)，通过用第一相机拍摄第一图像并且用第一或第二相机拍摄第二图像检测第一辐射、尤其是第一荧光，以便确定抗原斑点的位置；借助预先确定的图案将抗原斑点的位置配置给相应的抗原；并且检测在第二图像中的第二化学发光或荧光，以便(尤其是定量)识别结合到抗原斑点上的抗体。
在所述方法的一种优选实施形式中，第一和第二荧光可通过相同的波长激励。在进一步优选的实施形式中，第一荧光通过DY-521-XL的激励并且第二荧光通过异硫氰酸荧光素(FITC)的激励产生。
所述方法可以借助按照一种实施形式的用于检测抗体的装置实施。此外第二荧光染料可以这样选择，使得其可以以适合用于激励第一荧光染料的激励光激励，然而在第二波长范围中发荧光，所述第二波长范围基本上不同于第一荧光染料发荧光的第一波长范围。所述样品可以例如是血清、血浆或其他样品材料，例如人类来源。第一图像可以通过多个第一子图像(例如四个子图像)组成，其成像抗原芯片的不同子区域。同样第二图像可以通过多个子图像(例如四个子图像)组成，所述子图像依次由抗原芯片的不同子区域拍摄。在其他的实施形式中，分别只拍摄唯一的整个抗原芯片的第一图像并且只拍摄唯一的整个抗原芯片的第二图像。
在优选的实施形式中，用于检测抗体的方法可以具有所谓的“截止校验器”(Cut-off-Kalibrator)和其测量。截止校验器作为用于区别“正”信号与“负”信号的参考使用。截止校验器的类型可以与证明系统的给定参数适配并且例如根据抗原、抗体和染料、尤其是荧光染料的类型改变。在进一步优选的实施形式中，截止校验器可以是外部校验器。在这里可以涉及校验样品，其浓度例如大致处于要测量的样品的截止点的高度。该校验样品可以在单独的阵列(相同的阵列批次)上并行温育并且相对参考利用样品取得的强度。在备选的实施形式中，截止校验器可以是内部校验器，其中所述校验器在这里是在按照本发明的抗原芯片上的具有对应校验器材料的斑点、例如人-IgG-斑点。
按照本发明的一种实施形式，提供一种使用在用于尤其是通过间接免疫荧光检测样品中的抗体的方法中的成套系统。所述成套系统具有按照上述实施形式之一的抗原芯片和探针、尤其是二次抗体，所述探针以第二发光体、第二生色基质、酶或第二荧光染料标记。成套系统的第一和第二荧光染料可以(然而不是必须)通过基本上相同的波长范围激励。在优选的实施形式中，第一和第二染料分别是荧光染料并且第一和第二荧光可通过相同的波长激励，其中发射光谱、尤其是发射最大值不同。在优选的实施形式中，两种类似要激励的荧光染料的发射最大值以至少5nm、至少10nm、至少20nm、至少25nm、至少30nm、至少35nm、至少40nm、至少45nm、至少50nm、至少55nm或至少60nm彼此分开。在进一步优选的实施形式中，第一荧光通过DY-521-XL的激励并且第二荧光通过异硫氰酸荧光素(FITC)的激励产生。
本发明的实施形式能够实现通过第一(荧光)染料、生色基质或发光体定位一个阵列的斑点并且利用该定位以用于测量信号、例如第二荧光体。
载物片可以代替具有一个抗原芯片也具有多个抗原芯片(尤其是2、3、4、5、6、7个等抗原芯片)并且在这里对于单独的抗原芯片说明的抗原斑点特性以及抗原斑点的预先确定的图案可以转用到所述多个抗原芯片(对于每个单独或以其整体而言)上。例如可以在具有两个按照本发明的抗原芯片的载物片上，第一抗原芯片具有孵化对照并且第二抗原芯片具有校验点线。亦即在这里对于一个抗原芯片说明的斑点布置结构和特性可以通过所述多个抗原芯片在其整体上实施，而不是多个抗原芯片的每个单独的抗原芯片本身单独实施斑点布置结构和特性。
本发明的实施形式此外(单独或组合地)能够实现将抗原芯片的一个或多个抗原斑点行与其他的斑点行分界(例如通过各个斑点的间距)，以便可以明确确定芯片的取向并且因此还有抗原斑点行的类型(例如当芯片包含具有不同抗原的斑点行时)。
抗原芯片可以具有至少一个抗原斑点行或至少一个校验斑点行、优选至少两个抗原斑点行或校验斑点行，其与其他的斑点行可以通过至少一个如下标记可能性区分开：
-染料的类型(例如在反射的或激励的发射方面)；
-染料的强度(量或浓度)；
-所述抗原斑点行与其他抗原斑点行的间距(图2A中的间距L)；
-在行内的抗原斑点的间距(图2A中的间距d)；
-抗原斑点的形状(例如圆形、矩形、方形、椭圆形，作为连续的线的设计)；和/或
-抗原斑点的周长(或大小/直径)。
由此可以实现如下技术优点，即，抗原芯片的制造可以容忍抗原斑点的较不准确的定位或较不准确的压碎(例如玻璃的破裂)，因为在在扫描器或相机系统中使用抗原芯片时，抗原斑点的识别和定位通过评价第一图像进行，而不需要抗原斑点和/或抗原芯片的基质相对于相机系统的预先确定的定位。
附图说明
现在参考附图解释本发明的实施形式。本发明不限制于图解的或说明的实施形式。
图1在俯视图中图解按照本发明的一种实施形式的包括多个抗原芯片的载物片；
图2A在示意图中图解按照本发明的一种实施形式的具有以预先确定的图案的抗原斑点的抗原芯片；
图2B图解用于定位抗原斑点的第一图像，所述第一图像按照一种实施形式评价和拍摄；
图3示意性图解按照本发明的一种实施形式的用于检测样品中的抗体的装置；
图4和5图解如在按照本发明的实施形式中拍摄和评价的第一图像或第二图像；
图6图解按照本发明的一种实施形式的装置的照明源的发射光谱；
图7图解在本发明的实施形式中使用的染料的激励光谱和发射光谱；并且
图8图解如可在本发明的实施形式中可以使用的两种荧光染料的发射光谱。
具体实施方式
在图1中在俯视图中图解的载物片1具有十个载物片区3，所述载物片区设置成两行且每行有五个区3并且以1至10编号。每个区3在图1中具有六个抗原芯片5(在其他的优选实施形式中可以是1、2、3、4或5个抗原芯片5)，所述抗原芯片按照本发明的实施形式提供。抗原芯片5例如示意性地在图2A中示出。抗原芯片5具有基质7，所述基质具有平坦的基质表面9。抗原斑点11a、11b、11c、11d、11e以确定的图案施加在基质表面9上，并且抗原斑点11a、11b、11c、11d、11e分别包含第一荧光染料，其中，线11a按照双重的实施形式施加在抗原芯片上。在其他的实施形式中，线11a的单重的实施形式也是可能的。在基质表面9上还施加点距比线11a、11b、11c、11d、11e宽的线13，该线允许确定是否用样品温育抗原芯片5。此外在抗原芯片5上施加通过多个校验点17形成的一条线15，所述校验点包含以相同或不同的量或浓度的一次抗体。
抗原斑点11a沿一条线设置并且分别包含相同的抗原。同样抗原斑点11b、11c、11d和11e分别设置在一条线中并且对于每条线包含相同的抗原。在抗原芯片5中，在各线中设置的用于抗原的斑点可以具有比所示更多或更少的斑点，例如对于每个抗原在两个和二十个斑点之间，尤其是对于每个抗原在四个和十个斑点之间。在抗原斑点线中的抗原可以以相同或不同的浓度或量包含在相应的抗原斑点中。抗原斑点线可以通过斑点间距d以及通过斑点尺寸和/或斑点形状特征化。斑点间距d对于分别包含不同抗原的线可以不同或基本上相同。在各线中设置的抗原斑点11a、11b、11c、11d、11e彼此以确定的间距L间隔开。在不同的抗原的不同的线之间的间距可以变化。斑点11a、11b、11c、11d、11e的抗原斑点的形状基本上是圆形的。不同的抗原斑点11a、11b、11c、11d、11e施加、尤其是点涂在基质表面9上的图案通过斑点间距d(其在每条线中可以不同或可以相同)和线间距L(其同样在不同的线对之间可以不同或相同)以及也通过所有抗原斑点的形状和/或尺寸给出或定义。
评价系统(如例如在图3中示出)可以识别抗原斑点施加在基质表面上的图案的几何结构并且也可以识别各个斑点被抗原占用。然后在拍摄的图像中识别该图案可以允许将抗原斑点向配置于确定的抗原并且因此允许到将结合的抗体配置于确定的抗原。
图2B示意性地图解例如在图2A中图解的抗原芯片5的由一个装置拍摄的(由例如4个子图像组成的)图像19。为了拍摄图像19(例如第一图像)，获取第一荧光，所述第一荧光通过从第一荧光染料发出光而产生。如以上所述，第一荧光染料包含在所有抗原斑点11a、11b、11c、11d和11e中以及也包含在阳性对照线13和校验点17中。在图像19中拍摄的第一荧光的强度作为灰色调示出，其中光亮的灰色调表明较高的检测的强度。光亮的斑点或区域21、23或25在下文中称为第一荧光光斑。如由图2A和2B可看出，第一荧光光斑21、23和25正好出现在抗原/抗体斑点11a、11b、11c、11d、11e或线13和15施加在基质表面9上的位置上。评价系统通过与在先已知的图案的对比识别：例如第一荧光光斑21的列35起源于从抗原斑点11e出发的第一荧光。此外评价系统确定，列27、29、31、33、35起源于从抗原斑点11a、11b、11c、11d或11e出发的荧光。借此评价系统能够对于图像19的每个区域进行与确定的抗原或阳性对照或校验的配置。
图3在示意图中图解按照本发明的一种实施形式的用于检测样品中的抗体的装置50。所述装置50在此具有抗原芯片5，例如在图2A中图解的抗原芯片5。此外所述装置具有荧光显微镜55，所述荧光显微镜具有照明源57，所述照明源构成用于产生激励光59，并且所述照明源设置用于以激励光59照射抗原芯片5。详细而言，照明源57具有LED 58和成像光学系统60，以便完全或至少部分地照明抗原芯片5。此外荧光显微镜55具有第一相机61，所述第一相机构成用于通过检测从样品出发的由激励光59激励的第一荧光63拍摄第一图像(例如图2B中的图像19)。此外荧光显微镜55具有第二相机65，所述第二相机构成用于通过检测从样品出发的由激励光59激励的第二荧光67拍摄第二图像(参见例如图5)。荧光显微镜此外具有物镜69(包括一个或多个透镜)，其构成用于产生抗原芯片5的放大图像。
在已用潜在地包含结合到一个或多个抗原斑点上的抗体的样品温育抗原芯片5之后，用第二荧光染料标记的抗体温育所述样品。通过激励光59不仅激励第一荧光染料(其包含在抗原斑点中)而且激励第二荧光染料(其例如结合到二次抗体上)，以用于激励第一或第二荧光，所述第一或第二荧光的光同时穿过物镜69。在物镜下游设置激励光滤光器70，以便将激励光59的大部分过滤掉，但使第一荧光63的光并且还有第二荧光67的光基本上经过。然后第一荧光和第二荧光的光入射到半透镜72上，所述半透镜反射一部分上，以便入射到第一滤光器62上并且穿过所述第一滤光器。第一滤光器62在第一光路中设置在第一相机61上游并且构成用于基本上除去激励光59和第二荧光67的光。因此基本上只第一荧光的光63入射到第一相机61上。荧光的一部分由半透镜72放行并且穿过第二滤光器66，所述第二滤光器在第二光路中设置在第二相机65上游并且构成用于基本上除去激励光59以及第一荧光63的光。因此基本上只第二荧光的光67入射到第二相机65上。
所述装置50此外具有评价系统75，所述评价系统接收由第一相机61和第二相机65拍摄的第一图像或第二图像并且构成用于评价所述图像。为此基于第一图像(例如图2B中的图像19)确定抗原斑点的位置并且抗原斑点的位置分别借助预先确定的图案配置给抗原。从在第一图像中定位的第一荧光光斑21、23和25出发，然后可以将在第二图像(例如图4或5)中识别的强度配置给确定的抗原，以便因此定性检测或至少半定量识别结合的抗体。
图4和5图解由评价系统75获得和处理的第一图像19或第二图像77的示例。由评价系统75在第一图像19中识别的第一荧光光斑21、23和25在其位置和尺寸方面被确定。然后在第一图像19中确定的、第一荧光光斑的位置和尺寸被传输到第二图像77上，以便定义最初在抗原芯片上存在包括已知抗原的抗原斑点的区域。然后这些区域包含第二荧光光斑79、81、82，所述第二荧光光斑的强度(也就是说第二荧光的光的强度)由评价系统75配置给确定的抗原。为了可以进行量化，评价系统可以此外构成用于在第二图像强度中确定至少两个、尤其是至少三个从校验点出发的第二荧光，以便实施校验。在图2A中的抗原芯片5的校验点17可以例如以相同或不同的量或浓度包含一次抗体(例如IgG)。在用以第二荧光染料标记的二次抗体孵化之后，所述二次抗体也结合到一次抗体上，从而第二荧光也从这些区域出发，所述第二荧光取决于一次抗体的最初的浓度。
尤其是可以由评价系统实施在红光通道中的自动斑点辨识和不同抗原的配置。自动地定性或定量地评价抗原反应性可以在绿色通道中进行。半定量的评价可以借助标准化的对照血清和荧光强度值的说明对于每个抗原实施。也可以借助人的IgG点构建用于绿色荧光的校验曲线。
本发明的实施形式也提供抗原芯片的制造方法，其中，包含荧光染料的抗原斑点以对于每个抗原预先确定的图案施加到基质的平坦的基质表面上并且然后(不需要准确定位分离线地)压碎所述基质，以便获得多个抗原芯片。抗原可以利用压电的微计量仪器例如在玻璃或玻璃涂层的膜/膜片上进行。病人样品(例如血清或血浆)可以温育。
抗原芯片可以例如具有1.4mm x 2mm的尺寸。按常规，在基质表面上位置精确地施加抗原斑点是有问题的。该必要性可以通过本发明的实施形式除去，因为抗原斑点的位置在所述方法本身内确定。
图6示例性地图解按照本发明的一种实施形式的照明源58的发射光谱83，其中，在横坐标85上记录波长并且在纵坐标87上记录相对发射。光谱83示出在440nm和520nm之间的发射，在大约470nm处有最大值。这样的发射光谱可以用于产生激励光59，以用于激励第一荧光和第二荧光使用。
图7图解如可以使用在本发明的实施形式中的第一荧光染料的激励光光谱89或发射或荧光光谱91，其中，在横坐标85上记录波长并且在纵坐标93上记录吸收或发射强度。激励从大约450nm直至大约605nm进行，在大约520nm处有最大值。发射从大约555nm直至大约800nm进行，在大约670nm处有最大值。在这里在图7中图解的示例中，涉及染料DY521XL(例如第一荧光染料)的吸收或发射。
图8示例性地图解第一荧光染料或第二荧光染料的发射或荧光光谱95和97，其中，再次在横坐标85上记录波长并且在纵坐标93上记录发射强度。如由图8可看出，第一荧光95和第二荧光97的发射只在小的区域中重叠，亦即特别用于一方面检测斑点位置并且另一方面检测结合的二次抗体。荧光发射97可以例如通过FITC实现，荧光95可以例如通过PI(碘化丙啶)实现。
本发明的实施形式可以在没有用于拍摄第一图像和第二图像的扫描过程的情况下实现。通过物镜69提供的放大可以例如处于5、8、10、15、20或40倍之间。按照本发明的实施形式，对于每抗原斑点，大约300pl的、浓度为大约0.2mg/ml的抗原液是足够的。每个区(也就是说六个抗原芯片)大约0.3至3μl的病人样品可以稀释地温育。
Claims (16)
1.抗原芯片(5)，具有：
平坦的基质表面(9)；
抗原斑点(11a，…，11e)，所述抗原斑点以预先确定的图案施加在所述基质表面上并且包含第一染料、生色基质或发光体、尤其是第一荧光染料。
2.按照上一个权利要求所述的抗原芯片，其中，包含不同抗原的抗原斑点(11a，…，11e)包含不同量的或不同浓度的第一发光体、生色基质或染料、尤其是荧光染料，使得由其反射的第一辐射、尤其是激励的第一荧光具有基本上相同的强度，或使得从不同线的抗原斑点反射的第一辐射、尤其是激励的第一荧光具有基本上不同的强度以便可以区分所述线。
3.按照上述权利要求之一所述的抗原芯片，其中，
(a)相同抗原的抗原斑点(11a，…，11e)分别设置在一条线中，尤其是以预先确定的斑点间距(d)设置，其中，配置给不同抗原的线尤其是具有预先确定的线间距(L)和/或布置结构，并且此外尤其是两条线的线间距大于一条线内的斑点间距，和/或
(b)相同抗原的抗原斑点(11a，…，11e)分别设置在一条线中，其中，至少两行线具有可不同的预先确定的斑点间距(d)。
4.按照上述权利要求之一所述的抗原芯片，其中，在基质表面(9)上还施加至少两个、尤其是至少三个校验点(17)，所述校验点以分别不同的量或浓度包含一次抗体。
5.按照上述权利要求之一所述的抗原芯片，其中，在基质上还施加至少一条抗原线(13)作为阳性对照，该至少一条抗原线尤其是相比于抗原芯片的其他线具有较大或较小点距的线。
6.按照上述权利要求之一所述的抗原芯片，其中，
(a)基质表面(9)为了调焦而被微结构化并且尤其是基质表面(9)具有在1mm x 1mm和2mm x 4mm之间的尺寸，和/或
(b)抗原芯片具有截止校验器。
7.用于检测样品中的抗体的装置(50)，具有：
按照上述权利要求之一所述的抗原芯片(5)；以及
扫描器和/或相机系统、尤其是荧光显微镜(55)，所述扫描器和/或相机系统、尤其是荧光显微镜包括：
－照明源(57)，其构成用于产生照明光、尤其是激励光(59)，并且设置用于照明、尤其是照射抗原芯片(5)；
－第一相机(61)，其构成用于通过检测从抗原斑点出发的由照明光引起的第一辐射、尤其是由激励光激励的第一荧光来拍摄第一图像(19)，和/或构成用于通过检测从样品激励的化学发光或由照明光、尤其是激励光激励的第二荧光来拍摄第二图像(77)，
其中，所述扫描器和/或相机系统、尤其是荧光显微镜(55)还优选包括：
－第二相机(65)，其构成用于尤其是在第一相机并不构成用于检测第二荧光时通过检测从样品激励的化学发光或由照明光、尤其是激励光激励的第二荧光来拍摄第二图像(77)。
8.按照上一个权利要求所述的装置，该装置还具有：
第一滤光器(62)，其在第一光路中设置在第一相机(61)上游并且构成用于基本上除去激励光和/或第二荧光的光；
尤其是该装置还具有：
第二滤光器(66)，其在第二光路中设置在第二相机(65)上游并且构成用于基本上除去激励光和/或第一荧光的光。
9.按照权利要求7或8之一所述的装置，该装置还具有：
评价系统(75)，该评价系统构成用于：
基于第一图像确定抗原斑点的位置；
借助预先确定的图案将抗原斑点的位置配置给相应的抗原；和/或
基于第二图像、尤其是至少半定量地识别结合到抗原斑点上的抗体。
10.按照权利要求7至9之一所述的装置，其中，评价系统还构成用于：
评价第二图像，以便确定从各个抗原斑点发出的第二荧光的强度，并且
尤其是对包含相同抗原的多个抗原斑点的强度求平均。
11.按照权利要求7至10之一所述的装置，其中，评价系统还构成用于：
在第二图像中确定从至少一个、优选至少两个、尤其是至少三个校验点(17)出发的第二荧光的强度，以便实施校验，其中，校验点以不同的量或浓度包含一次抗体。
12.按照权利要求7至11之一所述的装置，其中，评价系统还构成用于：
在第一或第二图像中识别至少一行抗原斑点(11a，…，11e)和/或一条线(13、15)、优选相比于其他行和/或其他线具有较大和较小点距的至少一行和/或至少一条线、特别优选两条线和/或具有较大和较小点距，以便确定抗原芯片的取向并且进行所述行和抗原彼此的配置，其中，线和/或行构成为连续的线。
13.制造用于间接免疫荧光诊断的抗原芯片(5)的方法，具有：
以对于每个抗原预先确定的图案将抗原斑点(11a，…，11e)施加到基质(7)的平坦的基质表面(9)上，所述抗原斑点包含第一染料、生色基质或发光体、尤其是第一荧光染料，
尤其是在任意位置上压碎基质(7)，以便获得多个抗原芯片(5)。
14.按照上一个权利要求所述的方法，其中，抗原斑点的施加借助压电的微计量仪器实施，并且基质表面(9)尤其是玻璃基质的或被膜片和/或薄膜涂层的玻璃基质的表面。
15.用于尤其是通过间接免疫荧光检测样品中的抗体方法，其中，所述方法具有：
提供抗原斑点(11a，…，11e)，其包含第一染料、生色基质或发光体、尤其是第一荧光染料并且以预先确定的图案设置在平坦的基质(7)上；
用样品温育抗原斑点；
用二次抗体温育抗原斑点，所述二次抗体用第二发光体、第二生色基质、酶或第二荧光染料标记；
用照明光、尤其是激励光(59)照明抗原斑点(11a，…，11e)，以便触发第一辐射，尤其是以便激励第一荧光染料的第一荧光(63)，并且尤其是激励第二荧光染料的第二荧光(67)；
通过用第一相机(61)拍摄第一图像(19)检测第一辐射、尤其是第一荧光，以便确定抗原斑点的位置；
借助预先确定的图案将抗原斑点的位置配置给相应的抗原；并且
通过用第一或第二相机(65)拍摄第二图像(77)检测第二发光体、第二生色基质或由酶激励的化学发光或第二荧光的信号，以便识别结合到抗原斑点上的抗体，
其中，尤其是容忍抗原斑点在基质(7)上的定位的不精确性和/或基质相对于第一和/或第二相机的定位的不精确性。
16.使用在尤其是通过间接免疫荧光检测样品中的抗体的方法中的成套系统，具有：
按照权利要求1至6之一所述的抗原芯片；以及
探针、尤其是二次抗体，其用第二荧光染料、发光体、生色基质或酶标记，
优选第一和第二染料分别是荧光染料并且第一和第二荧光能够通过相同的波长激励。
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