JP4821219B2 - 定性反応用試験片 - Google Patents
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核酸マイクロアレイは複数の遺伝子を同時に解析できる技術であり、塩基配列決定法のみではなく、遺伝子の発現量や多型などを効率よく調べる方法として開発され、テーラーメイド医療、菌類などの生物学的分類の特定および疾病の診断などへの応用が展開されている。
例えば、特許文献1にはHCV(C型肝炎ウイルス)単離物の同定方法に用いる核酸マイクロアレイとして、ラインプローブアッセイ(LiPA:Line Probe Assay、イノジェネティクス社商標)法が開示されている。このアッセイは、ポリアミド膜片上に平行線として核酸プローブが固定されたものであり、迅速なDNAの検出を可能とする。
しかしながら、テーラーメイド医療または一部の診断に用いられうる核酸マイクロアレイは、試験片のような使い捨て用であることが要求されるため、リソグラフィー技術は製造コストの点で問題がある。さらに、プローブの数と凸部の数が同数となるように基材を設計および製造する必要があり、より高価な製品となってしまう。
しかしながら、スポットに周囲にマーカーを設けたとしても、核酸プローブの数が多くなればなるほど視覚的な錯覚をおこしやすくなり、多数のスポットから未反応のスポットを探すことは容易ではない。
[1] 基材と、該基材に設けた検出領域
および該検出領域内に配設された少なくとも2種類以上の生理活性物質がそれぞれ固定された生理活性物質固定領域を含む試験片であって、
少なくとも異なる2種類の生理活性物質固定領域同士が隣接、
および/または該生理活性物質固定領域と、検出物質が固定された検出物質固定領域が隣接
した試験片、
[2] 生理活性物質が、核酸、抗原、抗体、リガンドまたはレセプターである[1]に記載の試験片、
[3] 生理活性物質が、核酸である[1]に記載の試験片、
[4] 検出物質が、RI標識物質、蛍光標識物質、発色または発光基質の触媒となる酵素、もしくはこれらの物質と結合可能なリンカー物質である[1]に記載の試験片、
[5] 検出物質が、発色基質の触媒となる酵素または該発色基質の触媒となる酵素と結合可能なリンカー物質である[1]に記載の試験片、
[6] さらに、基材に検出領域を表示する表示手段を備えた[1]に記載の試験片、
[7] 試験片が、定性反応用である[1]に記載の試験片、
[8] 基材と、該基材に設けた検出領域
および該検出領域内に配設された少なくとも2種類以上の生理活性物質がそれぞれ固定された生理活性物質固定領域を含む試験片であって、該検出領域が、
少なくとも2種類以上の生理活性物質固定領域のみ
もしくは少なくとも2種類以上の生理活性物質固定領域および検出物質が固定された検出物質固定領域のみ
からなる試験片、
[9] 少なくとも2種類以上の生理活性物質固定領域
もしくは少なくとも2種類以上の生理活性物質固定領域および検出物質が固定された検出物質固定領域が、
検出領域内で縦縞に配設されてなる[8]に記載の試験片、
[10] 基材と、該基材に設けた検出領域
および該検出領域内に配設された少なくとも2種類以上の生理活性物質がそれぞれ固定された生理活性物質固定領域を含む試験片であって、該検出領域内は、
少なくとも異なる2種類の生理活性物質固定領域同士が隣接、
および/または生理活性物質固定領域と、検出物質が固定された検出物質固定領域が隣接
することを特徴とする試験片の製造方法、
[11] 基材と、該基材に設けた検出領域
および該検出領域内に配設された少なくとも2種類以上の生理活性物質がそれぞれ固定された生理活性物質固定領域を含む試験片であって、該検出領域が、
少なくとも2種類以上の生理活性物質固定領域のみ
もしくは少なくとも2種類以上の生理活性物質固定領域および検出物質が固定された検出物質固定領域のみ
からなることを特徴とする試験片の製造方法、
および、[12] 少なくとも2種類以上の生理活性物質固定領域、
もしくは、少なくとも2種類以上の生理活性物質固定領域および検出物質が固定された検出物質固定領域を、
検出領域内で縦縞に配設することを特徴とする[11]に記載の試験片の製造方法
に関する。
(A) ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を基材表面に被覆する方法
(B) 基材がガラスなどの無機材料である場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤などで処理する方法
(C) 基材が金などの金属材料である場合は、2−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理する方法
などが挙げられる。
(a) 基材が、ガラスおよびシリコンなどの無機材料の場合、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、シランカップリング反応により固定化する方法
(b) 基材が、ガラス、シリコンなどの無機材料の場合、上記無機材料基材上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、基材の表面をシランケップリング結合によりアミノ化する。一方で、核酸プローブの末端にカルボン酸を修飾する。そして、基材のアミノ基と核酸プローブのカルボン酸のアミノカップリング反応によりアミド結合を形成させて固定化する方法
などが挙げられる。
また、基材が金、銀などの金属材料の場合であっても、当業者は、前記シランカップリング結合を、金属−チオールまたは金属−ジスルフィド結合に置きかえることによって固定化することができる。
DNAプローブ
DNAプローブとしては、配列番号1および2に示されるDNAプローブを合成して用いた。配列番号1および2のDNAプローブは、結核菌のpncA野生型遺伝子にそれぞれ異なる位置でハイブリダイズすることができる配列を有する。これらのDNAプローブに5’末端をターミナルトランスフェラーゼ(New England Biolab社製)を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ(20unit/μl)を4μl、デオキシチミジン三リン酸(10pmol/μl)を10μl、配列番号1および2のDNAプローブ(50mM)を4μl、製品添付のNEBuffer4を5μl、および製品添付のカコジル酸緩衝液を5μl含んだ精製水50μlを調製した後、37℃で4時間反応させ、製品添付の20×SSC緩衝液50μlを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ(平均約400bp長)2pmol/μlをそれぞれ得た。
配列番号2:gtcgttctgc acgtcgac
リンカー物質として配列番号3に示した塩基配列を有し、かつ5’末端にビオチンを
修飾したDNAを用いた。基材に塗布するための溶液を、濃度0.1pmol/μlとなるように調製した。尚、このDNAは後述するリバースプライマーとしても用いる。
上記DNAプローブを固定化する基材として、ポリアミド膜を選択した。このポリアミド膜上(10mm×300mm)に、上記2種類のDNAプローブおよびリンカー物質の溶液を、24ゲージの針を有するディスペンサ(武蔵工業社製)を用いて、図5の手法に沿って300mmの辺と平行方向に連続的に塗布した。具体的には、
(i)リンカー物質
(ii)配列番号1のDNAプローブ
(iii)リンカー物質
(ii)配列番号2のDNAプローブ
(iii)リンカー物質
の順に連続的に塗布した。
また、塗布条件は、吐出速度約0.7μl/sec、塗布速度約2.5mm/secとした。約25℃で乾燥後、312nmの紫外線を2分間照射することにより、DNAプローブをポリアミド膜上に固定化した。固定化後、10×SSC溶液で洗浄することで、未吸着のDNAプローブを除去した。次に検出領域の両端に疎水性のインクで印をつけることにより表示手段を設け、5mm毎に切断することにより本発明の試験片を得た。得られた試験片におけるDNAプローブが固定された領域の幅は約2mmであった。その模式図を図7に示す。
検体のゲノムDNAの抽出
表1に示す試料1〜3の結核菌のゲノムDNAを、フェノール抽出法により抽出した。表1は、pncA遺伝子における変異の位置を示すものである。ここで、上記配列番号1のプローブDNAは、試料2に、上記配列番号2のプローブDNAは試料3にそれぞれ対応する。
配列番号4に示す塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号3に示す塩基配列を有し、かつ5’末端にビオチンを結合させたリバースプライマーおよびTaq DNAポリメラーゼ(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)を用いたPCR法により、pncA遺伝子を含む塩基配列の増幅を行った。増幅反応は、変性過程を95℃、1分、アニール過程を55℃、1分、鎖伸長過程を72℃、1分の1サイクルを30サイクル行った。
配列番号3:caacagttca tcccggttc
増幅したDNA溶液10μLに、水酸化ナトリウム(20%)(10μL)を加えてよく攪拌した。5分間放置して、増幅したDNAを1本鎖に変性させた。変性DNAを含む溶液に、10% ラウリル硫酸ナトリウム水溶液(1mL)を加え、実施例1の試験片を浸漬させ、反応温度62℃で30分間振とうしてハイブリダイゼーションを行った。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにp−ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸 p−トルイジン塩(BCIP)を加えて、各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼによる発色反応を行った。
2 検出領域
3 生理活性物質固定領域
31 配列番号1の塩基配列を有するDNAプローブ
32 配列番号2の塩基配列を有するDNAプローブ
4 検出物質固定領域
41 リンカー物質
5 表示手段
Claims (2)
- 基材と、該基材に設けた1つの検出領域
および該検出領域内に配設された、少なくとも2種類以上の核酸プローブがそれぞれ固定された少なくとも2種類以上の領域を含む、ある2種類以上の公知の変異が存在する野生型の核酸を検出するための試験片であって、
さらに、基材に検出領域を表示する表示手段を備え、
該検出領域が、少なくとも2種類以上の核酸プローブがそれぞれ固定された少なくとも2種類以上の領域のみで占められ、
該核酸プローブは、野生型の特定の塩基配列とハイブリダイズし、公知の変異を有する塩基配列とはハイブリダイズしない塩基配列を有し、
末端に発色反応を可能とする酵素を修飾したプライマーまたは該発色反応を可能とする酵素と結合可能なリンカーを修飾したプライマーを用いて上記核酸を増幅し、該増幅した核酸を酵素発色法により検出した場合であって、
該増幅した核酸が野生型である場合、該検出領域の全てが発色し、
該増幅した核酸が公知の変異を有する塩基配列を有する場合、該検出領域における核酸プローブがそれぞれ固定された少なくとも2種類以上の領域のうち少なくとも1つの領域は発色しない
ことを特徴とする試験片。 - 基材と、該基材に設けた1つの検出領域、
該検出領域内に配設された、少なくとも2種類以上の核酸プローブがそれぞれ固定された少なくとも2種類以上の領域、および、発色基質の触媒となる酵素もしくは該発色基質の触媒となる酵素と結合可能なリンカー物質を固定した領域を含む、ある2種類以上の公知の変異が存在する野生型の核酸を検出するための試験片であって、
さらに、基材に検出領域を表示する表示手段を備え、
該検出領域が、少なくとも2種類以上の核酸プローブがそれぞれ固定された少なくとも2種類以上の領域、および、発色基質の触媒となる酵素もしくは該発色基質の触媒となる酵素と結合可能なリンカー物質を固定した領域のみで占められ、
該核酸プローブは、野生型の特定の塩基配列とハイブリダイズし、公知の変異を有する塩基配列とはハイブリダイズしない塩基配列を有し、
末端に発色反応を可能とする酵素を修飾したプライマーまたは該発色反応を可能とする酵素と結合可能なリンカーを修飾したプライマーを用いて上記核酸を増幅し、該増幅した核酸を酵素発色法により検出する場合であって、
該増幅した核酸が野生型である場合、該検出領域の全てが発色し、
該増幅した核酸が公知の変異を有する塩基配列を有する場合、該検出領域における核酸プローブがそれぞれ固定された少なくとも2種類以上の領域のうち少なくとも1つの領域は発色しない
ことを特徴とする試験片。
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