JP2002098697A

JP2002098697A - 反応プローブチップ及びその作製方法

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Publication number: JP2002098697A
Application number: JP2000294463A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nagasawa; 浩長澤; Masayoshi Hirose; 政義廣瀬; Akira Fukunaga; 明福永
Original assignee: Ebara Corp
Current assignee: Ebara Corp
Priority date: 2000-09-27
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2002-04-05

Abstract

(57)【要約】【課題】フォトリソグラフィー技術を使用しない、よ
り容易かつ安価に作製できるＤＮＡチップ等の、反応性
プローブをその表面に集積した反応プローブチップ及び
その作製方法を提供する。【解決手段】反応性プローブを担持させたタイル状の
担体を、基材の上の区分に整列固定させたことを特徴と
する反応プローブチップ。タイル状の担体が反応性表面
を持つ材料であり、基材が薄板状の無機基板か薄膜状の
有機基板であることが好ましく、なかでもタイル状の担
体がガラス又は多孔質ガラスであり、無機基板がスライ
ドガラス又はシリコンウエハであり、有機基板がポリエ
ステルフィルム又はポリエチレンフイルムであることが
特に好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ診断及び治
療等に使用される反応プローブチップ及びその作製方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子の変異、特に一塩基配列の変異に
よる多型の検出は、突然変異等に起因する疾患、例え
ば、ガンの診断等に有効なだけでなく、薬剤応答性や副
作用の指針に必要であり、病因遺伝子の解析や予測医療
にも貢献する。この検出にいわゆるＤＮＡチップの使用
が有効であることが知られている。ＤＮＡチップは、通
常約１ｃｍ角のシリコンもしくはガラス基板上にフォト
リソグラフィー技術を用いて１万以上のＤＮＡ断片（Ｄ
ＮＡプローブ）を作り込んだものである。このＤＮＡチ
ップ上に、たとえば蛍光標識した、調べたいＤＮＡ試料
を流すと、上記ＤＮＡチップ上のプローブと相補的な配
列を有するＤＮＡ断片はプローブと結合し、その部分だ
けが蛍光により識別でき、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の
配列を解明することができる。この方法により、既に、
ガン遺伝子の突然変異の検出が可能であることが示され
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記ＤＮＡチップの作
製は、半導体産業で使用されているフォトリソグラフィ
ーの技術が必要である。しかしながらこの場合、予めＤ
ＮＡチップ上に固定するＤＮＡプローブの種類が決まっ
ており、また必要な設備のある所でこのようなＤＮＡチ
ップを作製し供給することは容易であるが、一塩基ずつ
合成していくためにはそれぞれ異なったフォトマスクを
用意し、反応工程も長く、柔軟に異なった目的に応じた
ＤＮＡプローブを固定したＤＮＡチップを作ることは困
難であるばかりか、大変なコストもかかるという問題点
もあった。また、必要とされるＤＮＡプローブの数が少
ない場合、チップ上へのＤＮＡプローブの集積度は、そ
れ程高い必要はない。むしろ、より簡便に所望のＤＮＡ
プローブを固定したチップが欲しい場合がある。また、
各個人のＤＮＡの多型を検出し医療に役立てるために
は、低コストでかつ安定性の高いＤＮＡチップを提供す
る必要がある。

【０００４】そこで本発明の目的は、フォトリソグラフ
ィー設備を必要としない、より容易かつ安価に作製でき
るＤＮＡチップ等の、反応性プローブをその表面に集積
した反応プローブチップを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記の課
題により、反応工程が長く複雑であり、柔軟に異なった
目的に対応することが困難で、大変なコストもかかるフ
ォトリソグラフィー技術を使用することなく、それでい
て前記フォトリソグラフィー設備を使用した場合と同等
の高い集積度を表面に有する反応プローブチップの材質
や形態について種々研究した。そして、担体上に任意の
塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドを合成した後、タ
イル状担体ごと、それぞれ基板に固定させると上記の問
題点を解消できることに着目して、本発明に到達した。

【０００６】すなわち、本発明は、下記の手段により前
記の課題を解決した。（１）反応性プローブを担持させたタイル状の担体を、
基材の上の区分に整列固定させたことを特徴とする反応
プローブチップ。（２）前記反応性プローブを担持させるタイル状の担体
が反応性表面を持つ材料であり、これを固定する基材が
薄板状の無機基板又は有機基板であることを特徴とする
前記（１）記載の反応プローブチップ。

【０００７】（３）タイル状の担体上に酵素、抗原、Ｄ
ＮＡ断片、抗体、エピトープ又はタンパク質を固定し、
該担持した担体ごと、それぞれ基材の上の区分に整列・
固定させることを特徴とする反応プローブチップの作製
方法。（４）タイル状の担体上に任意の塩基配列を持ったオリ
ゴヌクレオチドを合成した後、担体ごと、それぞれ基材
の上の区分に整列・固定させることを特徴とする前記
（３）記載の反応プローブチップの作製方法。（５）タイル状の担体は大きさが一辺５０ミクロン〜５
ミリメートルの正方形、６角形、円形などの形をした板
状であり、基板へ機械的に張り付け、固定させることを
特徴とする前記（３）又は（４）記載の反応プローブチ
ップの作製方法。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、反応性プローブを担持
させたタイル状担体を多数、基板の表面の区分にそれぞ
れ固定させることを特徴とする反応プローブチップに関
するものであって、同時に多数の反応を行わせることが
できるものであるから、前記反応性プローブは多種類か
らなるものである。前記タイル状担体を配置するための
区分は、多数の反応性プローブを担持させたタイル状担
体に対して、機械的に、特に自動的に行うことができる
ようにする関係で、整然と配列させることが好ましい。
区分は枡目状になっていることが好ましい。また、担体
上に任意の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドを合成
した後、タイル状担体ごと、それぞれ基板に固定させる
ことを特徴とする反応プローブチップの作製方法に関す
る。この場合、オリゴヌクレオチドを担持した小さなタ
イル状担体をその表面に接触することがないように、か
つ素早く順次基板上の区分に搬送することができる手段
を用いる必要がある。

【０００９】本発明のチップは、ガラス板、多孔質ガラ
スなどの反応性表面を持つ小さなタイル状の担体の表面
に、ＤＮＡ断片、酵素、抗原、抗体、エピトープまたは
タンパク質などの反応性プローブを担持させ、この反応
性プローブを担体ごと基板表面上の区分に固定化するこ
とにより、安定でかつ柔軟な生産に対応できる。基材
は、検出システムに対して変化しない安定な素材であれ
ば良いが、担体を固定するのに適した表面特性を持つこ
とが必要であり、石英ガラス、ホウケイ酸ガラスなどの
ガラス基板、シリコンウエハなどの無機基板が好まし
い。材質がガラスの場合、多孔質ガラスであると表面の
反応性が高いので好ましいが、加工の面で難しくなる。
材質としては、セラミックスも使用できるが、小さなタ
イル状の担体を製造することが容易であるものであるこ
とがよい。また、担体との結合方法を工夫することによ
り、ポリエステルフィルム、ポリエチレンフィルムなど
の有機基板を用いることもできる。これらの場合、一般
に表面の反応性が低いので、基板表面には、担体結合材
との親和性等を調整する目的で、適当な表面処理を施す
こともできる。

【００１０】また担体は、ＤＮＡ断片、酵素、抗原、抗
体、エピトープまたはタンパク質などの反応性プローブ
を担持するものであるから、これらの物質に影響を与え
ることのない材料から構成されることが必要であり、か
つ、その形状は板状、ないしはフィルム状でよいが、機
械的強度のあるものが好ましい点から板状であるのがよ
く、ガラス板、多孔質ガラス板のような無機材料が好ま
しい。しかし、一定の強度が保たれるのであれば、板状
に成形されたイオン交換樹脂なども使用できる。担体表
面は、反応性プローブの密度が適切に保たれるように、
例えばガラス板の場合は、機械的若しくは科学的に表面
を粗面にすることが好ましい。また、反応性プローブと
の親和性等を調整する目的で、適当な表面処理を施すこ
とが好ましい。

【００１１】担体への反応性プローブの担持方法は、特
に規定はないが、たとえば担体表面にアミノ基を固定し
た後、グルタルアルデヒドを用いて酵素を固定する方法
などが用いられる。また、特定の大きさの反応性プロー
ブを固定・担持するのではなく、オリゴヌクレオチド合
成のように担体上で反応物質を合成し、そのまま用いて
もよい。

【００１２】担体の大きさ、形態は任意に選べるが、基
板上に多数の異なる種類の反応性プローブを担持した担
体を固定することを考えると、タイル状の担体の大きさ
が一辺５０ミクロン〜５ミリメートルの正方形、６角
形、円形などの形をした板状が好ましく、特に１００ミ
クロン〜１ミリメートルの方形が好ましい。また、その
厚さとしては、その大きさとも関係するが、１００〜２
００ミクロンの範囲のものが好ましい。タイル状担体の
基板への固定は、反応に影響しない何らかの接着剤を用
い、基板上へ機械的に張り付け配列・固定する。タイル
状担体の基板への固定のために用いる接着剤としては、
例えばアクリル樹脂などが挙げられる。また、基板上へ
のタイル状担体の固定のためには、半導体装置の製造に
際して用いられる微小部材の加工、搬送等において用い
られている装置を用いることができる。

【００１３】基材の形状には特に制限はなく、例えば、
薄板、フィルムまたはシートのような平板状のものであ
ることができ、それ以外に立方体、棒状、紐状、球状の
ものであっても良い。板状の場合、基板の厚みや大きさ
にも特に制限はなく、基板の厚みは、基板に必要とされ
る形状安定性を考慮して適宜決定され、さらに基板の大
きさは、基板表面上に設けられる微小区分の数等を考慮
して適宜決定される。なお、本発明において、基板表面
上の微小区分とは、仮想の区分であって、各区分が物質
的に分割されて存在する訳ではなく、仮想的に設けた区
画である。また、基板に固定する際、大型の基板に同時
に多数の区画に組み合わせて固定し分割することによ
り、生産効率を上げることも期待できる。

【００１４】本発明における「反応性プローブ」におけ
る「反応性」とは、化学反応によりイオン結合や共有結
合による化学構造等が変化する場合のみではなく、ファ
ンデルワールス力、水素結合、配位結合、化学吸着、物
理吸着等のその他の様式により、他の物質と結合した状
況を得る性質を意味する。そのような反応性プローブと
して例えば、酵素、抗原、ＤＮＡ断片、抗体、エピトー
ブ、タンパク質等を挙げることができるが、当然のこと
ながらこれらに限定されるものではない。

【００１５】例えば、反応性プローブとして、担体上に
合成したＤＮＡ断片であるオリゴヌクレオチドの場合、
検出対象ＤＮＡサンプルとハイブリタイズにより、特定
配列のＤＮＡを検出することが出来る。本発明の反応プ
ローブチップにおいて、微小区分、即ち反応性プローブ
の区分の集積度には特に制限はない。反応プローブチッ
プの用途に応じて必要とされ、かつ便利な集積度も用途
によって異なるので、用途に応じて、適宜集積度は変化
させることができる。例示的には、反応プローブチップ
表面１ｃｍ²当たりの微小区分は、１００個以上とする
ことができ、基板の材質や反応性プローブを調整するこ
とにより、表面１ｃｍ²当たり１００００個程度の微小
区分を設けることができる。

【００１６】本発明の反応プローブチップは、反応性プ
ローブが担体に固定化されているため、基板上で滲み
や、遊離することが少なく、かつ、担体が板状であり、
かつ各担体上の反応性プローブ密度は、別途厳密に管理
できるので、チップ全体での反応性の均一性がはかれ
る。担体に固定する反応性プローブは、反応プローブチ
ップの用途に応じて、同種または異種の物質であること
ができる。また、作業効率の観点からは、複数の反応性
プローブを一度に担持させることが好ましく、より好ま
しくは、全ての反応性プローブを一度に担持させる。

【００１７】反応性プローブ担持担体は、それぞれ別途
合成し保存することができ、必要に応じて、必要な組み
合わせで、基板上に固定化することができる。特に、オ
リゴヌクレオチドを合成した担体の場合、通常の合成プ
ロセスが利用できるので、極めて実用性が高い。

【００１８】本発明の反応チップの製造方法を図面によ
り説明する。図１は、その製造工程を図解したものであ
り、工程（ａ）では、反応チップの基板となるスライド
ガラス１上の反応性プローブを設置する領域に接着剤２
を塗布する。次いで、工程（ｂ）では、予め製造してお
いた同じ反応性プローブ担持タイル３を多数載置してい
る基板を置いてある領域Ａに、下端に吸引チャック４を
有する配列機４を持っていき、吸引チャック５で反応性
プローブ担持タイル３を吸引し、工程（ｃ）で、その配
列機４をスライドガラス１上に移動させ、所定位置にお
いて吸引を解除して放出させ、運んできた反応性プロー
ブ担持タイル３をその所定位置に固定する。続いて、工
程（ｄ）で、別の反応性プローブ担持タイル３を多数載
置している基板を置いてある領域Ｂから配列機４によっ
て前記タイル３を搬送し、続いた所定位置に固定し、こ
の作業を順次繰り返すことにより、異なった種類の反応
性プローブ担持タイル３を配列していく。これにより、
工程（ｅ）で、所定位置に異なった種類の反応性プロー
ブ担持タイル３が配列された反応チップ６を得ることが
できる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、本発明はこれらの実施例のみに限定される
ものではない。

【００２０】実施例１表面アミノ化した１ｍｍ角、厚さ１０ミクロンの「カバ
ーガラス」にある種の特異反応を持つ酵素をグルタルア
ルデヒドを用い固定した。同じように各種の酵素を固定
した「カバーガラス」を用意し、これを半導体ワイヤー
ボンダーを改造して作成した配列装置を用い、縦７５ｍ
ｍ、横２５ｍｍ、厚さ１．５ｍｍのアクリル系接着剤が
塗布されたスライドガラス上に配列していった。１ｍｍ
画のそれぞれの区画に担持させた。１００種類の抗原酵
素反応を行える反応検出チップが作製された。

【００２１】実施例２表面アミノ化した０．５ｍｍ角、厚さ１０ミクロンの多
孔質ガラスに定法により各種のオリゴヌクレオチドを合
成した。このオリゴヌクレオチド固定多孔質ガラスを縦
７５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ１．５ｍｍのアクリル系接
着剤が塗布されたスライドガラス上に配列していった。
１０００種類の相補型ＤＮＡ検出チップが作製された。実施例３表面アミノ化した０．５ｍｍ角、厚さ１０ミクロンの多
孔質ガラスに定法により各種のオリゴヌクレオチドを合
成した。このオリゴヌクレオチド固定多孔質ガラスをエ
ポキシ接着剤コーティングポリエステルフィルム（約３
ｃｍ×２０ｃｍ、厚さ０．３ｍｍ）の表面に、０．５ｍ
ｍピッチで配列し、本発明の反応チップを得た。

【００２２】

【発明の効果】本発明によれば、フォトリソグラフィー
設備等の特別な設備を要することなく、ＤＮＡ断片等の
反応性プローブをその表面に集積した反応プローブチッ
プを、容易かつ安価に提供することができる。また、基
板の材質の選定や反応性プローブの担持方法を工夫する
ことで、既存のＤＮＡチップより、高い集積度を有する
チップを提供することも可能である。各種反応性プロー
ブを担持した担体を準備しておけば、必要なときに、必
要な組み合わせのＤＮＡプローブを固定したチップから
簡便に供給できるばかりか、異なった種類の反応性プロ
ーブを固定化した反応性検出チップが構成でき、各個人
のＤＮＡの多型を検出し医療に役立てる、低コストでか
つ安定性の高いＤＮＡチップを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の反応プローブチップの製造工程を図解
した説明図を示す。

【符号の説明】

１スライドガラス２接着剤３反応プローブ担持タイル４配列機５吸引チャック６反応チップＡ，Ｂ，Ｃ領域

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 31/22 １２１Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 37/00 １０２ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者福永明東京都大田区羽田旭町11番１号株式会社荏原製作所内Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 4B024 AA20 CA09 HA11 4B029 AA07 AA23 BB16 BB20 CC03 FA13 4B033 NA22 NA45 NB22 NB63 NC02 ND05 NF02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】反応性プローブを担持させたタイル状の
担体を、基材の上の区分に整列固定させたことを特徴と
する反応プローブチップ。
【請求項２】前記反応性プローブを担持させるタイル
状の担体が反応性表面を持つ材料であり、これを固定す
る基材が薄板状の無機基板又は有機基板であることを特
徴とする請求項１記載の反応プローブチップ。
【請求項３】タイル状の担体上に酵素、抗原、ＤＮＡ
断片、抗体、エピトープ又はタンパク質を固定し、該担
持した担体ごと、それぞれ基材の上の区分に整列・固定
させることを特徴とする反応プローブチップの作製方
法。
【請求項４】タイル状の担体上に任意の塩基配列を持
ったオリゴヌクレオチドを合成した後、担体ごと、それ
ぞれ基材の上の区分に整列・固定させることを特徴とす
る請求項３記載の反応プローブチップの作製方法。
【請求項５】タイル状の担体は大きさが一辺５０ミク
ロン〜５ミリメートルの正方形、６角形、円形などの形
をした板状であり、基板へ機械的に張り付け、固定させ
ることを特徴とする請求項３又は請求項４記載の反応プ
ローブチップの作製方法。