JP2005509138A

JP2005509138A - アフィニティー反応プローブ検出分析チップ、及びそれを用いる検出システムと装置

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Publication number: JP2005509138A
Application number: JP2002587098A
Authority: JP
Inventors: 浩長澤
Original assignee: Ebara Corp
Current assignee: Ebara Corp
Priority date: 2001-05-09
Filing date: 2002-05-09
Publication date: 2005-04-07
Also published as: AU2002255333A1; US20040197787A1; WO2002089973A2; WO2002089973A3

Abstract

個別識別信号を付した保持リングに開けられた貫通穴中に、プローブ分子が固定化された担体が充填保持されたアフィニティー反応プローブ検出分析チップが開示されている。このプローブ分子が固定化された担体は、多孔性の膜若しくは不織布であり、それは穴を塞ぐように張った構造であるのが好ましい。個別識別信号は、バーコードシステム、又は電子認識システムとすることができる。
チップ化したアフィニティー反応プローブ法において、より簡便な検出システムを確立し、ＤＮＡ多型の検出や各種の生理機能診断に利用出来る反応検出分析チップ、及びそれを用いる検出システムを提供する。

Description

［技術分野］
本発明は、例えば遺伝子診断及び生理機能診断等に使用される多数の機能性分子の認識を可能にするアフィニティー検出分析チップ、当該チップの作製方法、ならびに当該チップを使用する検出システムと検出装置に関する。
［背景技術］
特定の分子と選択的に結合する物質を用い、それに対応する物質を選択的に検出するアフィニティー検出は、大変鋭敏な検出法であり、例えば特定の酵素を用いて特定のタンパクを検出するアフィニティーカラムとして液体クロマトグラフにおいて用いられてきた。しかしながら、この液体クロマトグラフ法におけるアフィニティー法は特定の分子についての情報のみを与えるにすぎず、多数の分子についてその存在情報を同時に与える分析手段にはなっていない。

現在、例えば遺伝子の変異、特に一塩基（配列）の変異による多型の検出は、突然変異等に起因する疾患（例えば、ガン）の診断等に有効なだけでなく、薬剤応答性や副作用を評価するための指針に必要であり、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や予測医療にも貢献する。この検出に、アフィニティー法の一種である、いわゆるＤＮＡチップの使用が有効であることが知られている。

従来利用されてきた、短いＤＮＡ鎖を固定化したＤＮＡチップ（Affymetrix社から「ジーンチップ（GeneChip）」の名で市販されている）は、通常約１cm角のシリコンもしくはガラス基板上にフォトリソグラフィー技術を用いて１万以上のオリゴＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）を作り込んだものである。このＤＮＡチップ上に、たとえば蛍光標識した、調べたいＤＮＡ試料を流すと、上記ＤＮＡチップ上のプローブと相補的な配列を有するＤＮＡ断片はプローブと結合し、その部分だけが蛍光により識別でき、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の特定配列を認識・定量することができる。この方法により、既に、ガン遺伝子の突然変異の検出や、遺伝子多型の検出が可能であることが示されている。

また、ｃＤＮＡをスライドガラス上に配列したマイクロアレーも用いられる。
［発明の開示］
これらのチップ化したアフィニティー反応プローブ法は、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段として大変有効であるが、幾つかの問題点があった。例えば、フォトリソグラフィーを用いたＤＮＡチップは、一段の合成に最低４枚のフォトマスクを必要とし、かつ４回の光リソグラフィー、カップリング、洗浄を繰り返さなければならない。これを、必要な鎖長分だけ繰り返すため、高コストになることと、パターンを変えるためにはそれぞれフォトマスクを変える必要があり、必要に応じて各種デザインのＤＮＡチップをフレキシブルに作製することができなかった。それに加え、一枚一段ずつ合成されるため、各スポットの品位は保証されず、チップ間の再現性に不安が残る問題は解決されない。

また、これに変わる方法として提案されている、合成したオリゴヌクレオチド溶液を高密度にスポットしたマイクロアレイ（microarray）型ＤＮＡチップの場合、フォトリソグラフィーを用いた方法よりはパターンを変え易いが、プローブ分子を一点ずつ固定用ガラス等にスッポティングする操作を経なければならず、フォトリソグラフィーを用いたＤＮＡチップと同様に高コストとなる。

また、これらの反応チップによる検出においては、ハイブリタイズが局在化してしまい、定量性が失われる問題や、ハイブリタイズに専用の装置を用いて且つ長時間反応させる必要があるという問題がある。そのため、骨髄移植をはじめとする各種遺伝情報の検出には多数の手間と時間がかかるばかりではなく、多額の費用もかかっていた。

そこで本発明の目的は、より簡便な検出システムを確立し、ＤＮＡ多型などを含め、各種の生理機能診断に利用出来る反応検出システムを提供することにある。
本発明者は、前記の課題により、反応工程が長く複雑であり、種々の目的に柔軟に対応することが困難で、大変なコストがかかるフォトリソグラフィー法を使用することなく、またハイブリダイズに専用の装置を用いることもなく、より簡便な検出システムを確立するため種々研究した。

そして、個別の単一反応を示す検出チップを多数積み重ね、それぞれのチップに個別識別信号をつけ、反応が起きたプローブ分子を認証する検出システムにより、上記の問題点を解消できることに着目して、本発明に到達した。
［発明の詳細な説明］
即ち、本発明は、上記の課題を以下の手段により解決した。

（１）個別識別信号がついた保持リングに開けられた貫通穴中に、プローブ分子が固定化された担体が充填保持された構造を持つアフィニティー反応プローブ検出分析チップ。
（２）個別識別信号がついた保持リングに開けられた貫通穴中に、担体が充填保持された構造を持つチップを積み重ねておく工程、あらかじめ合成した、あるいは天然物から抽出したプローブ分子を含む液を前記貫通穴中に通す工程、前記プローブ分子をリンカーを用いて前記担体の表面に固定する工程を含んでなる、アフィニティー反応プローブ検出分析チップの作製方法。

（３）個別識別信号がついた保持リングに開けられた貫通穴中に、担体が充填保持された構造を持つチップを積み重ねておく工程、前記担体の表面にプローブ分子であるオリゴヌクレオチドを合成する工程を含んでなる、アフィニティー反応プローブ検出分析チップの作製方法。

（４）それぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を内面に固定した前記（１）記載のアフィニティー反応プローブ検出分析チップを積み重ね、前記貫通穴を連結して分析対象を通過させることのできる通路を有する構造を持つアフィニティー反応プローブ検出分析チップ堆積体。

（５）個別識別信号がついた保持リングに開けられた貫通穴中に、担体が充填保持された構造を持つチップを積み重ね、前記貫通穴中に前記（２）及び（３）に示す様に順次試薬を流すことによりアフィニティー反応プローブ検出分析チップを作製する装置。
［発明の実施の態様］
以下に、本発明の実施の形態を、図面に基づいて詳細に説明する。

図１Ａは、貫通穴３（ここに、反応性プローブを固定した担体４が保持されている）を備えた保持リング２の平面図である。図１Ｂはその縦断面図を示す。貫通穴内の反応場の形は、図２Ａ〜図２Ｄに示されるように幾つかの形が考えられるが、分析対象物が十分通り抜けられる大きさの貫通穴があり、かつ反応可能なプローブ分子が保持されれば良い。

図３Ａは、個別識別記号５としてリング状バーコード９を表面に付した検出分析チップを示したものである。図３Ｂは、個別識別記号５として点マトリックスバーコード１０を表面に付した検出分析チップの平面図である。

図４は、ｃＤＮＡ等のプローブ分子１１を、リンカー１２を用いて担体４の表面に固定する方法を示している。
図５は、塩基１４からプローブ分子であるオリゴヌクレオチド１５を合成し、担体４の表面にリンカー１２を用いて、表面に固定する方法を示している。

図６は、担体が保持されたチップ１を反応ベッセル１６中に積み重ねて、合成試薬１７もしくはプローブ分子をこの積み重ねたチップに順次流すことにより、プローブ分子を固定して、同じチップを同時に多数個作製する方法を示している。

図７は、それぞれ異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を内面に固定したチップをホルダー１８中に積み重ねた反応プローブチップ堆積体２０にサンプル溶液１９を流して検出する手段を示している。

図８は、検出の方法を示したもので、ホルダー１８に固定された反応の終了したチップ（１ａ，１ｂ，１ｃ・・・）を蛍光検出器にかけるために一枚ずつ取り出す検出方法を示す。

図９は、堆積構造になったチップ内に試薬供給機２１で、順次反応試薬を流して、パイプ２２、切り替えバルブ２３、ポンプ２４を通してオリゴヌクレオチドを合成するか、もしくはｃＤＮＡなどを流して固定するプローブ分子固定作製装置の概念図である。

図１０は、反応させたチップを読みとる吸光検出システムに用いる、装置の概念図である。チップは押し出し機構２５からチップを一枚ずつ取り出し，励起光源２７を検出部２６に当て、発光する蛍光を蛍光検出部２８において検出し、それによって、個別チップを順次送り込むと共に識別信号を検出部２６にて読みとり、データ処理部２９により識別信号が処理される。

図１１は、図１０の概要図である。ハイブリダイズ装置３０によりハイブリダイズされた生成物は、光源部３２、モジュール格納部３３及び観測ユニット３４からなる蛍光観測装置３１により蛍光検出され、データ処理装置２９により検出される。なお、反応プローブ堆積体は、基本的に多数の反応プローブチップからなるが、場合によっては一個だけを用いることもできる。

次に、上記の図面に記載した担体及びその他の構成要素などの材質、寸法及びその他の設計上の要素などについて説明する。
本発明のアフィニティー検出分析チップに使用するプローブとして有用な物質としては、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）及びその断片、任意の塩基配列をもったオリゴヌクレオチド、抗原、抗体あるいはエピトープ、酵素、タンパク質あるいはその機能部位ポリペプチド鎖等が例示される。しかしながら、本発明ではこれら以外の、プローブに有用などのような物質を使用することができる。

本発明でこれらプローブを担持する材料である担体の例としては、多孔質ガラスの粉（図２Ｄの８で示される）、多孔質の膜（図２Ｃの６で示される）や不織布（図２Ｄの７で示される）のような多孔質材料が好ましい。しかしながら、多孔構造であれば、穴の形状はどのような構造のものであっても良い。即ち、反応場である多孔質材料の材質は問わないが、アフィニティー反応プローブ分子を固定化もしくは成長させうる素材であれば良く、多孔質ガラス、ガラス繊維濾紙などが特に好ましい。

なお、多孔質ガラス粉や膜の孔径は０．１〜０．５μｍであることが好ましく、不織布や濾紙などの微細間隙は数μｍ以下であることが好ましいが、余りに微細であると蛍光標識したサンプルのろ過が困難になるので、０．１μｍ以上であることが必要である。

保持リングは、中央に貫通穴が設けられ、その貫通穴中に、プローブ分子が固定化された担体が充填保持されている。保持リングの特徴の一つは、各リングの特性（例えば、プローブの数及び種類、担体の構造及び構成材料等）を表示する識別信号がその表面上に記載されていることである。

保持リングの大きさは、直径が３ｍｍから１０ｍｍが好ましく、より好ましくは５ｍｍから７ｍｍであり、厚さが０．１ｍｍから１ｍｍが好ましく、より好ましくは０．１ｍｍから０．５ｍｍである。

保持リングは、形状安定性であり、必要な物理的強度を有し、さらに材料の溶出や腐食などによる材料の劣化を生じにくい材料であればどのような材料も使用できる。このような材料としては、好ましくは、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などの樹脂が挙げられる。また、ガラス、セラミックも使用でき、さらに、アルミニウムなどの金属でも良い。しかしながら、特にホウケイ酸ガラス、石英ガラス及びＰＥＥＫが好ましい。なお、保持リングの形態は機能さえあれば問われず、図１に示すように中央に貫通穴を有する円板である通常のリングであっても良く、また円若しくは方形の貫通穴を有する四角形のカード状であってもよい。

保持リングに開けられた貫通穴の大きさは、一般的に０．１ミクロンから５ｍｍ，好ましくは、０．５ミクロンから３ｍｍである。しかしながら、貫通穴は遺伝子などの分析対象が十分通り抜けられる大きさがあればよく、通常０．１ミクロンから１０ミクロン、好ましくは０．５ミクロンから５ミクロンであることができる。

個別識別情報は、リング状・点マトリックスなどのバーコードシステム、ＩＣタグなどの電子認識システムなどであることができる。唯一の要件は保持リングに情報が書き込まれていることである。この情報は色別信号でも凹凸信号でも良いが、実用的には積み重ね機構に支障を与えない形であれば良い。しかしながら、積み重ねる必要がない場合は特に形には制約がない。

以下に、本発明のアフィニティー反応プローブ検出分析チップの構造、作製法、反応、検出、システム及び装置について詳しく説明する。
（構造）
本発明のアフィニティー反応プローブ検出分析チップ１は、図１で示されるように、円板状の基板で形成された保持リング２の中央に貫通穴３を開け、そこに反応性プローブを固定された担体４が充填保持された構造である。担体４がある反応場には、図４の１１で示されるようなプローブ分子が固定され、保持リング２には個別識別信号５が記載されている。担体４は多孔性膜６（図２Ｃ）もしくは不織布７（図２Ｄ）などからなってもよい。

貫通穴３内の反応場の形は、図２で示されるように幾つかの形が考えられるが、いずれの場合でも、分析対象の遺伝子などが十分通り抜けられる大きさの貫通穴が有り、かつ反応可能なプローブ分子が保持される機構で有ればよい。図２Ａは貫通穴３一杯に担体４が充填されたものであり、図２Ｂは貫通穴３の半分位に担体４が充填されたものであり、図２Ｃは貫通穴３の下部に多孔性膜６が貫通穴３を塞ぐように張られたものであり、図２Ｄは貫通穴３の下部に不織布７が同様に張られ、それに多孔質である多孔質ガラス粉が付着しているものを示す。多孔質ガラス粉は、不織布７の繊維に絡むか或いは結合するような構造となっていることが好ましい。
（作製法）
上記の構造のチップ１は、図６のように複数個積み重ねて、上から貫通穴３に液を順次流すことにより、適当な方法（例えばホスホアミダイト法）を用いて、オリゴヌクレオチドを担体の上で合成し、合成されたアフィニティー反応プローブ分子として用いることができる。この場合、図６に示すように、重ね合わせたチップの貫通穴の一つずつで合成することで、同時に同じ特性を持ったチップをたくさん作ることができる。なお、この場合重ねなくても問題はないが、図６のように重ねた方がより均一な反応が起こりチップの特性が向上する。

また、同じく重ね合わせた孔を利用してｃＤＮＡなどを流せば、多層同時に担時できるので、ｃＤＮＡを固定したチップも容易に作製できる（図６）。
これらのいずれかの方法で作製したチップはどれも同じ特性を持ち、抜き取り試験により容易にその特性を検定することができ、品質管理上有利である。
（反応）
この様にして作製したチップを用いて検出する際は、図７に示したような堆積体２０にする。この場合、必要な組み合わせで、それぞれ異なったアフィニティー反応プローブ検出分析チップを重ね合わせて使用するが、何らかのホルダー（容器）１８内に重ねた形で固定できるようにするのが好ましい。ただし、反応が充分に進行すれば、重ね合わせは必ずしも必要ではなく、識別信号に支障がなければ、泳がせるような形であっても良い。

堆積体にした場合、蛍光ラベルしたｃＤＮＡなどのサンプルは、吸引若しくは圧入によりチップの貫通穴内を通過する。このため、サンプルはプローブ分子近傍を通過させることができるので、容易にハイブリタイズさせることができる。このため、反応が早く且つ均一になり、ハイブリタイズにかかる装置が簡便になる（図７）。
（検出）
反応の終了したチップは一枚ずつ蛍光検出器２６にかけられる。そのとき同時に識別信号が読み取られる。読み取り終わったチップは廃棄されるが、場合によっては保存され、抽出操作により特定のＤＮＡを回収する事もできる。
（システム及び装置）
以上に述べた検出分析チップを作製するには、専用の反応装置が必要である。図９は、堆積構造になったチップ内に順次反応試薬を流してオリゴヌクレオチドを合成するが、若しくはｃＤＮＡなどを流して固定する装置の概念図である。

検出システムを実行するには、反応させたチップを読み取るある種の吸光検出システムが必要である。図１０はそれに用いる装置の概念図であり、個々のチップを順次送り込むと共に識別信号を読み取り、検出を行う。

ハイブリタイズと検出の流れをまとめた概念は図１１の様になる。
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。但し、本発明はこれらの実施例にのみに限定されるものではない。
［実施例１］
中央に直径２ｍｍの貫通穴が形成された厚さ０．３ｍｍ、直径５ｍｍのポリエチレンテレフタレートのリング状基板からなる保持リングを多数枚用意した。なお、保持リングに前記の貫通穴を設ける位置は、前記保持リングを堆積したときに、同じ位置となるように正確なものとした。ガラス繊維濾紙をこの保持リングで挟み、加熱溶着する事により反応チップを作製した。この製造方法で得られる反応チップは、厚さが０．６ｍｍである。リング上には点マトリックス型のバーコードを印刷した。この保持リングを１００枚重ね、それぞれの穴の中に順次試薬を通過させることにより、特定の構造のオリゴヌクレオチドを合成した。それぞれ異なった構造のオリゴヌクレオチドを有し、かつ識別信号を付した個々の反応チップ５０枚を重ねて、堆積体を構成した。

この反応チップの堆積体をポリプロピレン製の反応セルに入れ、蛍光剤でラベルした検出対象のｃＤＮＡを流し込み反応させた。反応・洗浄の後、セルより取り出されたチップは、一枚ずつ蛍光検出器により解析され、同時に識別された。
［実施例２］
中央に直径１ｍｍの貫通穴が形成された石英ガラス基板からなる保持リングを用意した。前記貫通穴の位置は実施例１と同様に正確なものとした。この貫通穴中に細孔径１００ｎｍで粒子径１０ミクロンの多孔質ガラスの粉を充填し焼き付けた。保持リングの上下面は、研磨により平滑化された。基板上にはエッチングにより、リング状点マトリクスの識別信号が書き込まれた。保持リングは、化学的に洗浄された後、シランカップリング剤を用いて表面アミノ化を行った。この保持リング１００枚を重ね、定法により貫通穴に異なった種類のｃＤＮＡを固定化した。

この保持リングをポリプロピレン製の反応セルに入れ、蛍光剤でラベルした検出対象のｃＤＮＡを流し込み反応させた。反応・洗浄の後、セルより取り出されたチップは蛍光検出器により解析された。
［実施例３］
直径１０ｍｍ、厚さ１ｍｍで中央に直径０．５ｍｍの貫通穴が形成されたＰＥＥＫ基板からなる保持リングを用意した。この保持リングの上面に再生セルロースからなる多孔質膜を張り付けた。別に細孔径１００ｎｍで粒子径５ミクロンの多孔質ガラスの粉を用意し、この多孔質膜上に再生セルロース（ビスコース）溶液を用いて固定した。これを５００枚重ね、下部より通液しながら各種オリゴヌクレオチドを合成した。この保持リングをポリプロピレン製の反応セルに入れ、蛍光剤でラベルした検出対象のｃＤＮＡを流し込み反応させた。反応・洗浄の後、セルより取り出されたチップは個別に蛍光検出器により解析された。
［実施例４］
直径５ｍｍ、厚さ０．３ｍｍで中央に直径１０ミクロンの貫通穴が形成されたＰＥＥＫ基板からなる保持リングを用意した。このそれぞれの保持リングに上面に再生セルロースからなる多孔質膜を張り付けた。別に細孔径１００ｎｍで粒子径３ミクロンの多孔質ガラスの粉を用意し、この多孔質膜上に再生セルロース（ビスコース）溶液を用いて固定した。この保持リングを５０枚重ね、下部より通液しながら各種オリゴヌクレオチドを合成した。これらの保持リングの堆積体をポリプロピレン製の反応セルに入れ、蛍光剤でラベルした検出対象のｃＤＮＡを流し込み反応させた。反応・洗浄の後、セルより取り出されたチップは個別に蛍光検出器により解析される。
［実施例５］
直径５ｍｍ、厚さ０．３ｍｍで中央に直径５ミクロンの貫通穴が形成されたＰＥＥＫ基板からなる保持リングを使用して、実施例４を繰り返した。５０枚のこれら保持リングを実施例４のように処理して、所望のチップを得る。
［産業上の利用可能性］
本発明によれば、フォトリソグラフィー設備等の特別な設備を要することなく、任意の構成を持つタンパク質もしくは任意の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドなどの反応性プローブ物質を用い特定の分子と選択的に結合する物質を用い、それに対応する物質を選択的に検出する手段を容易に提供できる。また、検出手段は多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段であり、かつ無理なく高感度分析ができる検出手段である。

また、各種反応性物質を担持した単位反応チップを準備しておけば、様々な種類の反応性物質プローブを固定化し反応性を保証されたアフィニティー反応プローブ検出分析チップセットを、必要なときに必要な組み合わせでより簡便に供給できる。

本発明はさらに低コストかつ安定性の高い反応検出プローブ分析チップシステムを提供することができる。
従って、各個人の必要に対応したＤＮＡなどの検反応検出プローブ分析チップシステムの構築が可能となり、オーダーメイドの医療に貢献できる。

また、より温度条件等反応条件をコントロールしやすいのでこれまでのいわゆるＤＮＡチップと異なり、タンパク検出など新しい領域の検出手段を与えるものである。

図１Ａは、貫通穴（その中に、反応性プローブが固定された担体が保持されている）を有する保持リングの平面図である。

図１Ｂは，図１Ａのリングの縦断面図である。
図２Ａは、保持リングの貫通穴内における反応場の４つの例を示す断面図である。

図２Ｂは、保持リングの貫通穴内における反応場の４つの例を示す断面図である。
図２Ｃは、保持リングの貫通穴内における反応場の４つの例を示す断面図である。
図２Ｄは、保持リングの貫通穴内における反応場の４つの例を示す断面図である。
図３Ａは、保持リング上に、識別記号として、リング状バーコードを設けた保持リングを示す平面図である。

図３Ｂは、保持リング上に、識別記号として、点マトリックスバーコードを設けた保持リングを示す平面図である。
図４は、担体表面に、ｃＤＮＡなどのプローブ分子を、リンカーを用いて固定する方法を示す説明図である。図５は、担体の表面に、プローブ分子として合成されたオリゴヌクレオチドを、リンカーを用いて表面に固定する方法を示す説明図である。図６は、担体が保持されたチップを積み重ねて、合成試薬もしくはプローブ分子を順次流すことにより、プローブ分子をチップに固定する方法を示す説明図である。図７は、それぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を固定したチップを積み重ねた反応プローブチップの集合体または堆積体に、サンプル溶液を流して検出する方法を示す説明図である。図８は、ホルダー内に保持された、反応の終了したチップを一枚ずつ蛍光検出器にかける検出の方法を示した図である。図９は、堆積構造になったチップ内に、試薬供給機で反応試薬を順次流して、切り替えバルブ、ポンプを通してオリゴヌクレオチドを合成する、もしくはｃＤＮＡなどを流して固定する、プローブ分子を固定及び作製する装置の概念図である。図１０は、意図した反応を行ったチップを一枚ずつ取り出し、その識別記号を読みとる吸光検出システムに用いるための装置の概念図である図１１は、ハイブリダイズ装置及び蛍光観測装置の概要図である。

Claims

個別識別信号が付され、かつ貫通穴が開けられた保持リング；及び
貫通穴に充填保持された、プローブ分子が固定化された担体；
を含んでなるアフィニティー反応プローブ検出分析チップ。
前記プローブ分子が固定化された担体が、多孔構造を有する材料である請求項１に記載の分析チップ。
前記担体が多孔質ガラス粒子、多孔質ガラス膜、ガラス繊維不織布、又はガラス繊維製濾紙である請求項２に記載の分析チップ。
前記プローブ分子がリンカーを介して担体に固定化されている請求項１又は２に記載の分析チップ。
個別識別信号が付され、貫通穴（この中に、担体が充填保持されている）を備えた保持リングを有するチップを複数枚積み重ねる工程、
あらかじめ合成した、あるいは天然物から抽出したプローブ分子を含む液を、積み重ねられたチップの貫通穴中に通す工程、及び
前記プローブ分子をリンカーを用いて前記担体の表面に固定する工程、
を含んでなるアフィニティー反応プローブ検出分析チップの作製方法。
個別識別信号が付され、貫通穴（この中に、担体が充填保持されている）を備えた保持リングを有するチップを提供する工程、
このチップを積み重ねる工程、及び
前記担体の表面にプローブ分子であるオリゴヌクレオチドを合成する工程、
を含んでなるアフィニティー反応プローブ検出分析チップの作製方法。
請求項１に記載の複数のアフィニティー反応プローブ検出分析チップの堆積体（ここで、前記担体に固定したプローブ分子は異なった特異的な結合反応を起こし、各チップの貫通穴は連結され、分析対象を通過させることのできる通路を形成する）である、アフィニティー反応プローブ検出分析チップ集合体。
個別識別信号を付した保持リング（当該保持リングには貫通穴があり、そこに担体が充填保持されている）を備えた複数のチップからなる堆積体、及び
該堆積されたチップの貫通穴が連結して形成された通路に、順次薬剤を流すための手段、
を含んでなるアフィニティー反応プローブ検出分析チップの作製装置。