CN101833001A - 一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒，包括(1)同时固定有若干种特异性抗体的底膜，所述特异性抗体与炎症因子能够发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点；和(2)反应剂和检测剂，用于通过array-ELISA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。本发明还公开了一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，该方法包括一将特异性抗体固定于底膜的步骤。本发明的试剂盒采用蛋白质芯片技术，能够检测四十项炎症因子，克服了的诸多缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。

Description

一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒。

技术背景

炎症是生物体排除有害刺激和促进愈合的一种自生保护性机制，其过程涉及复杂的生化反应，这些有害刺激包括致病原、受损细胞或刺激物等。炎症一般表现为急性炎症和慢性炎症，其中，急性炎症是身体对有害刺激物的最初反应，通过提高受损组织的血浆量和白血球数得以实现，并伴随有一系列连锁生物反应，包括局部微循环、免疫系统和受损组织内各种不同的细胞；而慢性炎症则会导致炎症处细胞逐渐变化，是损伤和愈合并存的过程，可能持续数日、数月甚至数年，而且持久的慢性炎症的也会引起周边组织的损害。

炎症可能引起多种人类疾病，包括过敏、哮喘、内脏疾病、关节炎和自身免疫性疾病，研究发现，炎症可能引发其它慢性疾病，如心血管疾病、肥胖症、老年痴呆症、抑郁症和癌症。其中，在在炎症过程中，肿瘤围绕肿块建立一个微环境，使癌细胞激增、扩散、转移、提高癌细胞新成代谢。

炎症的复杂生化反应过程有多种分子参与，其中，有一类分子在炎症过程中起到促进作用，如白细胞介素1α、白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、转化促进因子β、粒状巨噬细胞、促进因子、白细胞介素11、白细胞介素12、白细胞介素17。另一类分子则对抗炎症有抑制作用，这类分子包括白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13、白细胞介素16、溶解性肿瘤坏死因子受体，当然还有其他趋化因子也参与炎症过程。不同疾病具有不同的炎症因子，而检测这些炎症因子的表达水平不仅能帮助我们了解疾病的发生、发展机制，也能帮助我们找到疾病的特殊靶标记和个体医疗生物标志。

目前常用的炎症因子检测方法主要包括：酶联免疫吸附法(ELISA)，放射免疫分析(radio immunoassay，RIA)，免疫印绩法(western blot)，流式细胞仪(Flow-Cytometry)等。其中，酶联免疫吸附法是最普遍的方法，具灵敏度高、特异性较好、操作简便等优点。但一次试验只能检测单一指标，通量低、成本高，在具有多指标特性的炎症因子检测中，该方法存在明显的不足；放射免疫分析(RIA)虽然灵敏度高，是由于具有放射性污染，现在已很少采用；免疫印绩法能测定分子的大小，且无非特异的反应，但操作繁琐，灵敏度低，且只能检测单一指标，不适合运用于炎症因子的检测；流式细胞仪能在细胞水平上检测炎症分子的水平，但却存在低灵敏、低通量、高成本等缺点。

因此，本领域技术人员开始尝试用蛋白质芯片的方法克服上述技术方案中存在的不足，例如，现有技术中，采用液体芯片能够同时检测10至20类分子，但由于样品间容易发生相互作用，影响检测结果，很难发展成高通量方法，且此方法中采用的设备结构复杂，不易推广。

有鉴于此，开发出一种新型的炎症因子检测试剂盒，克服现有技术中存在的不足，实现炎症因子检测检测的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的炎症因子检测试剂盒，采用蛋白质芯片技术，能够检测四十项炎症因子，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。

为了解决上述技术问题，本发明提供的一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒，包括：(1)同时固定有若干种特异性抗体的底膜，所述特异性抗体与炎症因子能够发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点；和(2)反应剂和检测剂，用于通过array-ELISA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。

其中，其中所述特异性抗体为针对选自如下蛋白质之抗体：嗜酸细胞活化趋化因子(EOTAXIN)，白细胞诱素-2(EOTAXIN-2)，粒细胞集落刺激因子，(GCSF)，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)，干扰素-γ(IFN-γ)，活化人T细胞-种基因产(I-309)，白细胞介素-1α(IL-1α)，白细胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-6sR(IL-6sR)，白细胞介素-7(IL-7)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-10(IL-10)，白细胞介素-11(IL-11)，白细胞介素-12p40(IL-12p40)，白细胞介素-12p70(IL-12p70)，白细胞介素-13(IL-13)，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素-16(IL-16)，白细胞介素-17(IL-17)，趋化因子干扰素诱导蛋白10(IP-10)，趋化蛋白-1(MCP-1)，趋化蛋白-2(MCP-2)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，趋化因子CXCL9(MIG)，巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)，巨噬细胞炎性蛋白-1δ(MIP-1δ)，趋化因子(RANTES)，转化生长因子-β1(TGF-β1)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，s肿瘤坏死因子受体1(s TNFRI)，s肿瘤坏死因子受体2(s TNFRII)，生长因子-BB(PDGF-BB)，抑制因子金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)，上述各种特异性抗体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点。

优选地，所述独立识别位点上固定有单一浓度的一种抗体，一种抗体以一种或者一种以上的浓度分别固定于底膜形成一个或者一个以上独立识别位点。

优选地，所述特异性抗体中的任意一种以0.2ng～20ng的含量点样固定于所述独立识别位点。

在本发明的一个优选实施方案中，所述特异性抗体为生物素标记的抗体；底膜采用所述底膜为硝酸纤维素膜(nitrocellulose)、聚偏氟乙烯膜(PVDF)或者尼龙膜(Polyamide)。反应剂包括抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶液，且特异性抗体标记有生物素；另外，所述反应剂还包括用于识别生物素标记的抗生物素蛋白链菌素(Streptavidin)，所述抗生物素蛋白链菌素标记有辣根过氧化物酶(HRP)。

另一方面，本发明的所有解决的技术问题还在于提供一种测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，该方法包括一将特异性抗体固定于底膜的步骤，该步骤包括：

(1)将50-500nl的含0.5-100ng特异性抗体蛋白质的Tris缓冲液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)点样于底膜上，

(2)将点样好的底膜放于室温条件下静置5分钟到8分钟，于2℃到8℃保存备用。

其中，步骤(1)中采用全自动点样仪完成点样操作，各特异性抗体蛋白质芯片点阵排布于所述底膜。

优选地，所述底膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜或者尼龙膜。

由于本发明的方法中，采用的底膜材料和点样液的优良特性，在结合本发明的蛋白质芯片试剂盒在检测炎症因子时的使用方法与现有技术的区别性，使本发明的方法中，将特异性抗体固定于底膜的步骤等到了极大的简化，无须现有技术中普遍采用的点样后封闭底膜上的有效成分的操作步骤。

在本发明就的一个实施例中，步骤(1)的点样操作中，采用Bio-Rad公司或Perkin Elmer公司生产的全自动点样仪器，而用于固定特异性抗体的底膜则采用硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜由GE公司提供(Hybond-ECL产品号RPN303D)。各特异性抗体蛋白质芯片点阵排布于硝酸纤维素底膜，而在具体的操作过程中，各特异性抗体蛋白质的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的蛋白质芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。

采用本发明的检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒，能够同时检测出四十项炎症因子，并且能够实现多样本多指标的并行检测，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。

另外本发明的蛋白质芯片试剂盒所用到的将特异性抗体蛋白质固定于地膜的方法，由于其采用了全自动点样仪，为实现炎症因子的蛋白质芯片试剂盒的高通量、多位点提供了一种可能；另外，通过对在点样和包被过程中用到的底膜进行优选，也优化了蛋白质芯片试剂盒在灵敏度、准确性、高通量等方面的性能。

附图说明：

图1为本发明蛋白质芯片试剂盒工作原理图；

图2本发明炎症因子检测蛋白质芯片试剂盒的抗体芯片的点样示意图；

图3为本发明蛋白质芯片试剂盒的检测结果。

具体实施方式：

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒的制备。

为了检测样品中是否存在相应的炎症因子，制备固定有针对于如下蛋白质的特异性抗体的底膜：嗜酸细胞活化趋化因子(EOTAXIN)，白细胞诱素-2(EOTAXIN-2)，粒细胞集落刺激因子，(GCSF)，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)，干扰素-γ(IFN-γ)，活化人T细胞-种基因产物(I-309)，白细胞介素-1α(IL-1α)，白细胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-6sR(IL-6sR)，白细胞介素-7(IL-7)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-10(IL-10)，白细胞介素-11(IL-11)，白细胞介素-12p40(IL-12p40)，白细胞介素-12p70(IL-12p70)，白细胞介素-13(IL-13)，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素-16(IL-16)，白细胞介素-17(IL-17)，趋化因子干扰素诱导蛋白10(IP-10)，趋化蛋白-1(MCP-1)，趋化蛋白-2(MCP-2)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，趋化因子CXCL9(MIG)，巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)，巨噬细胞炎性蛋白-1δ(MIP-1δ)，趋化因子(RANTES)，转化生长因子-β1(TGF-β1)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，s肿瘤坏死因子受体1(s TNFRI)，s肿瘤坏死因子受体2(s TNFRII)，生长因子-BB(PDGF-BB)，抑制因子金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)。

1、抗体的制备：

采用针对表1中所列蛋白质的特异性抗体，抗体的来源、浓度、及其针对的蛋白质名称均在表1详细说明：

表1特异性抗体所针对的抗原蛋白质名称，抗体的来源、浓度信息

2、点样

将50-500nl的含0.5-100ng的特异性的抗体的Tris缓冲液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)用全自动了点样仪点样于硝酸纤维膜上，具体的芯片点阵示意图如图2所示，生物素标记的bovine IgG作为阳性对照。在本实施例中芯片点阵采用如图2所示的排布方式，但事实上，在其他实施例中，用于点样的芯片点阵还可以以其他方式的排布方式进行组合，并不局限于如图所表示的形式。

3、晾干、保存

将点样好的底膜放于室温条件下静置5分钟到8分钟，于2℃到8℃保存备用。

在本实施例中，全自动了点样仪采用Bio-Rad公司或Perkin Elmer公司生产的产品；硝酸纤维膜购自GE公司，其Hybond-ECL产品号为RPN303D。当然，在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。

实施例2：用本发明的试剂盒检测炎症因子的实验。

将底膜放于配套方盒内，由于本实施例的底膜上分布有多个芯片点阵，故而在本实施例中方盒设置有8个方格，通过方盒之间的方格将每个芯片点阵划分为相互独立的反应区，本实施例中采用的设置有8个方格方盒由RayBiotech自制，向每个方格内加2毫升封闭液后放置于室温下培养30分钟，而后依次进行如下各步骤的操作：

1、加样

吸出每个方格中的封闭液，将100微升～5毫升经封闭液稀释过的样品放入有膜的方格内，然后放在摇床上室温下摇动1至2小时，或者亦可在4℃下反应12-18小时。

2、洗膜

洗涤液I清洗：从方格内吸出样品，用1～5毫升1倍的洗涤液I清洗，之后放在摇床上室温摇动5分钟，再重复此清洗步骤两次。

洗涤液II清洗：从方格内吸出残液，用1～5毫升1倍的洗涤液II清洗，之后放在摇床上室温摇动5分钟，再重复此清洗步骤一次。

3、加入标记有生物素的抗体混合液

向每个方格加入生物素标记的，混合有针对表1中所列抗原蛋白质的特异性抗体的混合液500微升～2毫升，然后放在摇床上室温摇动1至2小时。亦可在4℃下反应12-18小时。而后从方格内吸出标记有生物素的抗体混合液，重复步骤2的洗膜步骤。

4、加入HRP-Streptavidin

向每个方格加入500微升～2毫升稀释过的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素(HRP-Streptavidin)，然后放在摇床上室温条件下摇动1至2小时，亦可在4℃下反应12-18小时。而后从方格内吸出HRP-Streptavidin，重复步骤2的洗膜步骤。

其中，HRP-Streptavidin商购自BD公司(产品号554066)，实验前，需要用封闭液进行20,000倍稀释。

另外，需要说的是，在本实施的步骤1至步骤4中，用到如下容易，其成分可配制方法如下：

2M Tris缓冲液(pH7.5)：Trizma Base 484g，纯化水1.3L，调节酸碱度至7.5，纯化水加至2L。

封闭液的配制方法如下：先将20×PBS(KCl16g，NaCl 640g，KH2PO4 16g，Na2HPO4 92g，溶解于2.6L纯化水后，再加纯化水至4升)稀释成1×PBS(20×PBS 200ml，纯化水3800ml)，然后配制10％BSA(BSA 400g，1×PBS加至4升)，最后配制封闭液(10％BSA4升，Casein 4升，混匀)。

20×洗涤液II(20×TBS)配分如下：2M Tris缓冲液(pH7.5)800ml，5M NaCl 4800ml(NaCl 1461g，纯化水3.3升，溶解后纯化水加至5升)，混匀后，纯化水加至8升。使用时，将20×洗涤液II倍比稀释即可。

20×洗涤液I(2％Tween/20×TBS)配分如下：20×洗涤液II 1L，Tween 20ml，混匀。使用时，将20×洗涤液II倍比稀释即可。

5、检测

用镊子夹出底膜并置于垂直状态使多余的液体滴干；而后将膜放在清洁的塑料片上，保证底膜固定有抗体的一面朝上；加入500微升配制好的(A∶B＝1∶1)发光液(商购自BIOFX公司，产品号LUMB-0500-01)到每张底膜上并在室温下放置2分钟，此过程必须确保发光液完全覆盖到整张膜；再用另一张干净的朔料片覆盖于底膜表面，小心地将朔料片中的气泡挤压出去，在将朔料片中的气泡挤压出去的过程中应当避免在膜上用力。

上述步骤后，将底膜放在室温下5到10秒成像，拍摄时采用低温CCD，并采用相配套的UV扫描仪中读取数据，实验结果如图3所示。在本实施例中，通过测试所有待检测位点均为阳性，ICAM-1、IL-4、IL-16、MIP-1b、sTNF、RI同时为阳性，IL-1α、IL-6sR、PDGF-BB同时为阳性，MIP-1β为阳性，IL-16Ag为阳性，阴性对照六个样品，说明本发明的蛋白质芯片试剂盒能够准确地检测出相应的炎症因子，而根据相同的原理和实验方法，对于其他各类炎症因子，只要本发明的蛋白质芯片阵列存在其相对应的独立识别位点，既可以通过上述实验检测出来。

在本实施例中，生物素标记的bovine IgG作为阳性对照，其作用是识别膜的方向和比较不同膜的相对表达程度，以阳性对照为标准，通过比较信号的强弱，可以得到细胞素的相对表达程度高低，另外还可以通过测光密度技术可将信号的强弱数字化。在比较几张膜时，其结果可用阳性对照的数据标准化，而本发明试剂盒的实验结果可用为炎症因子的蛋白质芯片试剂盒而制作的分析软件进一步分析，其功能不但可以编译和组织实验数据，而且能够减少在实验结果分析过程中复杂的计算和繁琐的操作。

应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒，其特征在于包括：(1)同时固定有若干种特异性抗体的底膜，所述特异性抗体与炎症因子能够发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点；和(2)反应剂和检测剂，用于通过array-ELISA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所述特异性抗体为针对选自如下蛋白质之抗体：嗜酸细胞活化趋化因子，白细胞诱素-2，粒细胞集落刺激因子，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子，细胞间粘附分子-1，干扰素-γ，活化T细胞-种基因产物，白细胞介素-1α，白细胞介素-1β，白细胞介素-2，白细胞介素-3，白细胞介素-4，白细胞介素-6，白细胞介素-6sR，白细胞介素-7，白细胞介素-8，白细胞介素-10，白细胞介素-11，白细胞介素-12p40，白细胞介素-12p70，白细胞介素-13，白细胞介素-15，白细胞介素-16，白细胞介素-17，趋化因子干扰素诱导蛋白10，趋化蛋白-1，趋化蛋白-2，巨噬细胞集落刺激因子，趋化因子CXCL9，巨噬细胞炎性蛋白-1α，巨噬细胞炎性蛋白-1β，巨噬细胞炎性蛋白-1δ，趋化因子，转化生长因子-β1，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，s肿瘤坏死因子受体1，s肿瘤坏死因子受体2，生长因子-BB，抑制因子金属蛋白酶组织抑制因子-2；上述各种特异性抗体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述独立识别位点上固定有单一浓度的一种抗体，一种抗体以一种或者一种以上的浓度分别固定于底膜形成一个或者一个以上独立识别位点。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性抗体中的任意一种以0.2ng～20ng的含量点样固定于所述独立识别位点。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：反应剂包括抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶液，且特异性抗体标记有生物素。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述反应剂还包括用于识别生物素标记的抗生物素蛋白链菌素，所述抗生物素蛋白链菌素标记有辣根过氧化物酶。

7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述底膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜或者尼龙膜。

8.一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，有一将权利要求1或2中所述的特异性抗体固定于底膜的步骤，该步骤包括：

(1)将50-500nl的含0.5-100ng特异性抗体蛋白质的Tris缓冲液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)点样于底膜上，

(2)将点样好的底膜放于室温条件下静置5分钟到8分钟，于2℃到8℃保存备用。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中采用全自动点样仪完成点样操作，各特异性抗体按蛋白质芯片点阵排布于所述底膜。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述底膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜或者尼龙膜。

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