CN104698170A - Il-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法利用ELISA方法检测血浆或血清中IL-11的表达；IL-11属于IL-6因子家族。本发明测定浆中/血清中IL-11的水平将对胰腺癌的早期诊断及预后的评价具有参考价值，有利于胰腺癌的早期诊断和预后评估。此外，本发明的方法灵敏度高，方法简单，血浆/血清标本获得简单无创，可重复性强。
Description
技术领域
本发明属于临床医学技术领域，尤其涉及一种IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法。
背景技术
胰腺癌是预后最差的消化道恶性肿瘤之一，在我国居恶性肿瘤死亡原因的第六位，确诊后平均生存时间4-6个月。在中国，胰腺癌患者的5年生存率为1％-3％，仅10％-15％的患者能够进行根治术，手术根治是治愈胰腺癌患者的最重要的手段，但在根治治疗的胰腺癌患者中，其预后依然比较差。导致胰腺癌不良预后的主要原因是血液和淋巴结肿瘤细胞的早期播散、腹腔肿瘤细胞的播散以至发生远处的器官的转移，且疾病的进展凶险。由于胰腺癌的发生受到环境因素、多基因多阶段等复制因素影响，目前对胰腺癌的早期诊断和预后评估等方面还存在很多挑战。缺少有效的实时动态检测胰腺癌疾病早期进展和预后评估的工具。
影像学目前对胰腺癌的早期诊断、治疗的监测和预后的评估具有重要的作用，但影像在检测肿瘤的灵敏度方面具有局限性，只能检测到直径大于0.3cm的肿瘤病灶，在治疗的监测过程中，当影像检测到胰腺癌发生远处器官的转移，患者往往失去治愈的机会，预后比较差。血清肿瘤标记物也是目前常用的诊断和监测治疗的标记物，目前胰腺癌最常用的血清标记物是唾液酸Lewis抗原CA19-9，主要作为辅助诊断和治疗监测的标记物，CA19-9在某些疾病中升高，如良性阻塞性黄疸和胰腺炎患者中，甚至在腹水的患者血清中也升高，另外在5％-10％的人群中Lewis抗原阴性，CA19-9值不会升高。细针穿刺(fine-needleaspiration，FNA)细胞学诊断能够提供细胞诊断的金标准，但此方法具有创伤性，容易引起胰液渗漏等并发症。
目前对胰腺癌的诊断临床多应用影像方法，血清肿瘤标记物等，最终通过细胞病理或者组织病理学确诊胰腺癌。胰腺癌预后的评估最经典的方式是病理TNM，即病理分期中肿瘤病理类型、肿瘤大小、肿瘤侵润转移情况影响着患者预后。但由于胃癌患者个体差异大，肿瘤细胞也存在异质性。仅仅通过TNM分期难以满足临床需要。胰腺癌的早期诊断及预后评估等方面还存在很多缺陷和不足。
IL-11属于IL-6细胞因子家族，具有抗炎作用，并且影响癌细胞的生长、侵袭和转移。通过血浆/血清中IL-6水平的异常变化将有助于对胰腺癌早期诊断和预后评估。为胰腺癌的早期诊断及预后评价提供新型的生物标记物。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种血浆中IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，旨在解决现有的胰腺癌诊断和预后评估的方法存在的由于胃癌患者个体差异大，肿瘤细胞也存在异质性，仅仅通过TNM分期难以满足临床需要的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法利用ELISA方法检测血浆或血清中IL-11的表达；IL-11属于IL-6因子家族；
具体包括以下步骤：
步骤一，采用血浆/血清样本，用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，室温静置5分钟后，4000rmp/min，离心5分钟，获取上清备用；样本通常24小时内完成检测，对于可能复查的标本；标本离心后，放置-80℃冰箱长期保存备用；所有的试剂和样本在使用之前放置在室温18℃-25℃；所有的样本复空；
步骤二，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，对血浆/血清样本1∶2稀释；
步骤三，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，溶解IL-11蛋白质标准品粉末，充分震荡混匀后；制备成4ng/ml的标准品；取100ul的4ng/ml的标准品，加入400ul的稀释液，配制成800pg/ml的标准品，在6管分别加入400ul的稀释液，800pg/ml的标准品中移出200ul，进行倍比稀释，分别得到266.7pg/ml、88.89pg/ml、29.6pg/ml、9.88pg/ml、3.29pg/ml、0pg/ml；
步骤四，加入100ul的标准品于IL-11抗体包被的96孔板中，血浆/血清/细胞上清/其他体液样本1∶2稀释，用专用薄膜覆盖孔后，室温孵育2.5小时或者4℃过夜，并轻微震荡；
步骤五，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，将山羊抗人IL-11抗体稀释为2μg/ml；在聚苯乙烯的96孔酶标板的微孔中加入50μl包被液，用保鲜膜封好，在4℃冰箱中放置过夜；次日，用350μl 150mM的PBST缓冲液浸泡式洗板，3min×3次；
步骤六，每孔加入300μl的2％BSA，室温封闭4h；用350μl PBST缓冲液浸泡式洗板，1min×3次；
步骤七，丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体；在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干；共洗涤4次；
步骤八，在每孔中加入100ul生物素标记的IL-11抗体，室温孵育1小时，并轻微震动；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体；在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干；共洗涤4次；
步骤九，加入100ul链亲和素溶液于每孔中，室温孵育45分钟并轻微震荡；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体；在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干；共洗涤4次；
步骤十，加入100ul的TMB底物试剂于每孔中，室温避光震荡孵育30分钟；加入50ul 2M H2SO4溶液终止反应；在酶标仪Model 680酶标仪中读取450nm吸光值；
步骤十一，结果的判读：首先确定3个阴性对照孔的读数，取平均值作为本底读数；对于每一例血浆/血清/细胞培养液/其他体液样品或IL-11标准品，先计算3个平行孔的孔间变异系数CV，对于CV值小于10％的样品，取3次重复的平均值作为样品的OD值；CV值大于10％的样品，去除一个异常值后，重新计算孔间变异，孔间变异＝两孔OD值之差/两孔OD值之和，变异值＜12％，样品为有效病例，并取两孔平均值作为样品的OD值，否则，舍弃该例样品，利用梯度稀释的IL-11标准品绘制标准曲线，从而计算出每一例有效病例的血浆/血清/细胞培养液/其他体液的IL-11浓度。
进一步，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法的IL-11属于IL-6因子家族，影响炎症因子趋化作用、癌细胞的运动和侵袭作用。
进一步，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法检测的标准和方法：
辅助诊断胰腺癌：血清中CA19-9未检测明显升高的患者，用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测；
预后的评估作用：对于临床病理学明确诊断的胰腺癌患者，通过检测血浆中IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况，用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成IL-11血浆检测，患者在未经过任何治疗措施前用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测；在胰腺癌患者在手术后、化疗后、放疗后3-7天检测血浆/血清中IL-11的表达水平，或者在手术后、同步放化疗后检测血浆/血清中IL-11的表达水平，最后，根据血浆/血清的IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况。
本发明提供的血浆/血浆中IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，测定血浆中IL-11的水平将对胰腺癌的早期诊断及预后的评价具有参考价值，有利于胰腺癌的早期诊断和预后评估。本发明的方法灵敏度高，方法简单，血浆标本获得简单无创，可重复性强。
附图说明
图1是本发明实施例提供的血浆中IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的血浆/血清的IL-11表达水平诊断胰腺癌的灵敏度和特异度示意图；
图3是本发明实施例提供的血浆/血清IL-11与胰腺癌患者预后的关系。当血浆/血清水平大于50pg/mL，患者具有较好的预后示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例的血浆中IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法包括以下步骤：
S101：血浆/血清样本：用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，室温静置5分钟后，4000rmp/min，离心5分钟，获取上清备用，标本离心后，放置-80℃冰箱长期保存备用，所有的试剂和样本在使用之前放置在室温(18℃-25℃)，所有的样本至少复空；
S102：用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3；35mM NaHCO3)作为稀释液，对血浆/血清样本1∶2稀释，同样适用其他类型的体液标本或者细胞培养上清；
S103：用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3；35mM NaHCO3)作为稀释液，溶解IL-11蛋白质标准品粉末，充分震荡混匀后，制备成4ng/ml的标准品，取100ul的4ng/ml的标准品，加入400ul的稀释液，配制成800pg/ml的标准品，在6管分别加入400ul的稀释液，800pg/ml的标准品中移出200ul，进行倍比稀释，分别得到266.7pg/ml、88.89pg/ml、29.6pg/ml、9.88pg/ml、3.29pg/ml、0pg/ml；
S104：加入100ul的标准品于IL-11抗体包被的96孔板中：，血浆/血清/细胞上清/其他体液样本1∶2稀释，用专用薄膜覆盖孔后，室温孵育2.5小时或者4℃过夜，并轻微震荡；
S105：用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3；35mM NaHCO3)作为稀释液，将山羊抗人IL-11抗体：稀释为2μg/ml，在聚苯乙烯的96孔酶标板的微孔中加入50μl包被液，用保鲜膜封好，在4℃冰箱中放置过夜(＞16h)，次日，用350μl 150mM的PBST缓冲液(137mM NaCl，2mM KH2PO4，10mMNa2HPO4，加入0.05％的Tween-20，调节至pH7.4)浸泡式洗板，3min×3次；
S106：每孔加入300μl的2％BSA：，室温封闭4h，用350μl PBST缓冲液浸泡式洗板，1min×3次；
S107：丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体，在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干，共洗涤4次；
S108：在每孔中加入100ul生物素标记的IL-11抗体，室温孵育1小时，并轻微震动，丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体，在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干。共洗涤4次；
S109：加入100ul链亲和素：溶液于每孔中，室温孵育45分钟并轻微震荡，丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体，在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干，共洗涤4次；
S110：加入100ul的TMB底物试剂于每孔中，室温避光震荡孵育30分钟，加入50ul 2M H2SO4溶液终止反应，立即在酶标仪Model 680酶标仪中读取450nm吸光值；
S111：结果的判读：首先确定3个阴性对照孔的读数，取平均值作为本底读数。对于每一例血浆/血清/细胞培养液/其他体液样品或IL-11标准品，利用梯度稀释的IL-11标准品绘制标准曲线，从而计算出每一例有效病例的血浆/血清/细胞培养液/其他体液的IL-11浓度。
在本发明的实施例中，IL-11属于IL-6因子家族，影响炎症因子趋化作用、癌细胞的运动和侵袭等作用。癌基因Ras调控IL-11基因，IL-11和gp130的受体的二聚体作用发挥信号传递作用。血浆中的IL-11是Gp130野生型的胃癌患者的侵袭和预后的标记物。IL11在胰腺癌的发生、侵袭和预后等的作用尚不清楚。IL可调控胰腺星状细胞，促进胰腺癌的恶性微环境的产生。IL11独立预测肝癌的骨转移。IL11信号的直肠癌的潜在治疗靶点。IL-11在不同类型的癌症其预后可能不同。IL-11具有抗炎功能。我们前期工作发现胰腺肉瘤样癌患者血浆中IL-11升高具有良好的预后。在血液来源的恶性肿瘤患者经过重组的IL-11治疗后可明显减轻菌血症、不明原因的感染，促进患者较好的预后。体内体外证实IL-11能够减轻IL-1介导的炎症及破坏作用，并且炎症在胰腺癌的发生发展等方面扮演重要作用。因此，IL-11可能在胰腺癌的发生、发展及预后等方面扮演重要作用。
检测的标准和方法：
入组标准：1)辅助诊断胰腺癌：对临床上首次入院的患者，临床症状上为胰腺癌疾病待排除的患者。影像诊断如CT与MRI等方法尚难以明确为胰腺癌的患者，血清中CA19-9未检测明显升高的患者。可对此类患者用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测。
2)预后的评估作用：对于临床病理学明确诊断的胰腺癌患者，可通过检测血浆中IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况。可对此类患者用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成IL-11血浆检测。患者可以在未经过任何治疗措施前用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测。也可以在胰腺癌患者在手术后、化疗后、放疗后3-7天检测血浆/血清中IL-11的表达水平，或者在手术后、同步放化疗后检测血浆/血清中IL-11的表达水平。最后，根据血浆/血清的IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况。
方法的具体步骤为：
3、试剂盒的选择，使用ELISA检测试剂盒(RayBiotech，GA，USA)公司。使用双抗夹心ELISA方法检测。
4、具体步骤和方法：
1)样本：样本要求，本发明主要采用血浆/血清样本，但同样适用于可疑胰腺癌患者或者明确诊断的胰腺癌患者其他体液标本，如胸水、腹水、穿刺的其他用于诊断的体液标本。血浆/血清样本：用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，室温静置5分钟后，4000rmp/min，离心5分钟，获取上清备用。样本通常24小时内完成检测，对于可能复查的标本。标本离心后，放置-80℃冰箱长期保存备用。所有的试剂和样本在使用之前放置在室温(18℃-25℃)。所有的样本至少复空。
2)样本稀释：用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3；35mMNaHCO3)作为稀释液，对血浆/血清样本1∶2稀释，同样适用其他类型的体液标本或者细胞培养上清。
3)制备标本品：IL-11标准品购买自(RayBiotech，GA，USA)公司。用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3；35mM NaHCO3)作为稀释液，溶解IL-11蛋白质标准品粉末，充分震荡混匀后。制备成4ng/ml的标准品。取100ul的4ng/ml的标准品，加入400ul的稀释液，配制成800pg/ml的标准品，在6管分别加入400ul的稀释液，800pg/ml的标准品中移出200ul，进行倍比稀释，分别得到266.7pg/ml、88.89pg/ml、29.6pg/ml、9.88pg/ml、3.29pg/ml、0pg/ml。
4)加入100ul的标准品于IL-11抗体包被的96孔板中(RayBiotech，GA，USA)，血浆/血清/细胞上清/其他体液样本1∶2稀释，用专用薄膜覆盖孔后，室温孵育2.5小时或者4℃过夜，并轻微震荡。
5)包被：用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液（15mM Na2CO3；35mM NaHCO3)作为稀释液，将山羊抗人IL-11抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)稀释为2μg/ml。在聚苯乙烯的96孔酶标板的微孔中加入50μl包被液，用保鲜膜封好，在4℃冰箱中放置过夜(＞16h)。次日，用350μl 150mM的PBST缓冲液(137mM NaCl，2mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，加入0.05％的Tween-20，调节至pH7.4)浸泡式洗板，3min×3次。
6)封闭：每孔加入300μl的2％BSA(Sigma-Aldrich公司，Cat.No.A7906)，室温封闭4h。用350μlPBST缓冲液浸泡式洗板，1min×3次。
7)丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体。在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干。共洗涤4次。
8)在每孔中加入100ul生物素标记的IL-11抗体(RayBiotech，GA，USA)，室温孵育1小时，并轻微震动。丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体。在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干。共洗涤4次。
9)加入100ul链亲和素(RayBiotech，GA，USA)溶液于每孔中，室温孵育45分钟并轻微震荡。丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体。在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干。共洗涤4次。
10)加入100ul的TMB底物(RayBiotech，GA，USA)试剂于每孔中，室温避光震荡孵育30分钟。加入50ul 2M H2SO4溶液终止反应。立即在酶标仪Model680酶标仪(Bio-rad公司)中读取450nm吸光值。
11)结果的判读：首先确定3个阴性对照孔的读数，取平均值作为本底读数。对于每一例血浆/血清/细胞培养液/其他体液样品或IL-11标准品，先计算3个平行孔的孔间变异系数(CV)，对于那些CV值小于10％的样品，取3次重复的平均值作为该样品的OD值；CV值大于10％的样品，去除一个异常值后，重新计算孔间变异(孔间变异＝两孔OD值之差/两孔OD值之和)，如果该变异值＜12％，认为该样品为有效病例，并取两孔平均值作为该样品的OD值，否则，舍弃该例样品。而后，利用梯度稀释的IL-11标准品绘制标准曲线，从而计算出每一例有效病例的血浆/血清/细胞培养液/其他体液的IL-11浓度。
本发明的工作原理：
利用ELISA方法检测或血清血浆中IL-11的表达，检测到血浆中IL-11大于43.2pg/mL可能提示胰腺癌，诊断的灵敏度是97.7％，特异度为70％。并且血浆中IL-11水平越高，胰腺癌患者预后预后。
研究对象分为两个阶段：第一阶段为筛选阶段：检测44例病理明确诊断的胰腺癌(中位年龄68y；42-86)，30例健康志愿者，15例慢性胰腺炎患者的血浆/血清IL-11表达水平。第二阶段独立验证阶段：检测45例病理明确诊断的胰腺癌(中位年龄69y；42-87)，31例健康志愿者，22例慢性胰腺炎患者的血浆/血清IL-11表达水平。血浆/血清IL-11的诊断(AUC：0.901，灵敏度：97.7％，特异度：70.0％)。胰腺癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期、血清乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ-谷胱甘肽转移酶、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白表达水平等指标与血浆/血清IL-11无相关性(P＞0.05)，具有转移的胰腺癌患者血浆中IL-11水平低于无转移的患者(P＝0.043)。胰腺癌患者血浆/血清中具有较高水平的IL-11水平(中位值大于43.2pg/mL)比低水平患者具有较好的预后(P＝0.004)。尤其当血浆/血清中IL-11中位水平大于50pg/mL时，胰腺癌患者的中位生存期10月，而血浆/血清的中位水平小于50pg/mL，胰腺癌患者的中位生存期为4个月，两者的差异具有显著性意义(P＝0.004)。
如图2和图3所示，本发明通过简单酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测不同分期的胰腺癌患者血浆/血清中IL-11的表达水平，同时对慢性胰腺癌、健康志愿者作为对照，评估血浆/血清中IL-11的表达水平对胰腺癌的诊断和预后的评估意义。
敏感性：此方法敏感性能够在在血浆/血清中检测小于3pg/ml。
回收率：把人IL-11的标准品分别加入到40例健康人的血浆/血清中，并计算平均回收率。
| 样本类型 | 平均回收率(％) | 变化范围(％) |
| 血浆 | 95.60 | 85-105 |
| 血清 | 97.81 | 82-104 |
线性：
| 样本类型 | 血浆 | 血清 |
| 1∶2平均预期％ | 93 | 94 |
| 变化范围 | 85-105 | 83-104 |
重复性和精密度：
组内变异CV＜10％，组间CV＜12％
特异度：本抗体检测IL-11具有高度特异性，与其他类型的IL因子和其他细胞因子没有交叉反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，其特征在于，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法利用ELISA方法检测血浆或血清中IL-11的表达；IL-11属于IL-6因子家族；
具体包括以下步骤：
步骤一，采用血浆/血清样本，用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，室温静置5分钟后，4000rmp/min，离心5分钟，获取上清备用；样本通常24小时内完成检测，对于复查的标本；标本离心后，放置-80℃冰箱长期保存备用；所有的试剂和样本在使用之前放置在室温18℃-25℃；所有的样本复空；
步骤二，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，对血浆/血清样本1∶2稀释；
步骤三，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，溶解IL-11蛋白质标准品粉末，充分震荡混匀后；制备成4ng/ml的标准品；取100ul的4ng/ml的标准品，加入400ul的稀释液，配制成800pg/ml的标准品，在6管分别加入400ul的稀释液，800pg/ml的标准品中移出200ul，进行倍比稀释，分别得到266.7pg/ml、88.89pg/ml、29.6pg/ml、9.88pg/ml、3.29pg/ml、0pg/ml；
步骤四，加入100ul的标准品于IL-11抗体包被的96孔板中，血浆/血清/细胞上清/其他体液样本1∶2稀释，用薄膜覆盖孔后，室温孵育2.5小时或者4℃过夜，并轻微震荡；
步骤五，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，将山羊抗人IL-11抗体稀释为2μg/ml；在聚苯乙烯的96孔酶标板的微孔中加入50μl包被液，用保鲜膜封好，在4℃冰箱中放置过夜；次日，用350μl 150mM的PBST缓冲液浸泡式洗板，3min×3次；
步骤六，每孔加入300μl的2％BSA，室温封闭4h；用350μl PBST缓冲液浸泡式洗板，1min×3次；
步骤七，丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；
步骤八，在每孔中加入100ul生物素标记的IL-11抗体，室温孵育1小时，并轻微震动；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；
步骤九，加入100ul链亲和素溶液于每孔中，室温孵育45分钟并震荡；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；
步骤十，加入100ul的TMB底物试剂于每孔中，室温避光震荡孵育30分钟；加入50ul 2M H2SO4溶液终止反应；在酶标仪Model 680酶标仪中读取450nm吸光值；
步骤十一，结果的判读：首先确定3个阴性对照孔的读数，取平均值作为本底读数；对于每一例血浆/血清/细胞培养液/其他体液样品或IL-11标准品，先计算3个平行孔的孔间变异系数CV，对于CV值小于10％的样品，取3次重复的平均值作为样品的OD值；CV值大于10％的样品，去除一个异常值后，重新计算孔间变异，孔间变异＝两孔OD值之差/两孔OD值之和，变异值＜12％，样品为有效病例，并取两孔平均值作为样品的OD值，否则，舍弃该例样品，利用梯度稀释的IL-11标准品绘制标准曲线，从而计算出每一例有效病例的血浆/血清/细胞培养液/其他体液的IL-11浓度。
2.如权利要求1所述的IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，其特征在于，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法的IL-11属于IL-6因子家族，影响炎症因子趋化作用、癌细胞的运动和侵袭作用。
3.如权利要求1所述的IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，其特征在于，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法检测的标准和方法：
辅助诊断胰腺癌：血清中CA19-9未检测明显升高的患者，用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测；
预后的评估作用：对于临床病理学明确诊断的胰腺癌患者，通过检测血浆中IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况，用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成IL-11血浆检测，患者在未经过任何治疗措施前用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测；在胰腺癌患者在手术后、化疗后、放疗后3-7天检测血浆/血清中IL-11的表达水平，或者在手术后、同步放化疗后检测血浆/血清中IL-11的表达水平，最后，根据血浆/血清的IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108931651A (zh) * | 2017-05-24 | 2018-12-04 | 宜昌市中心人民医院 | 一种激肽释放酶7在血液中的含量检测方法及其作为诊断胰腺癌的血清标志物上的应用 |
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| CN113063949A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-07-02 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法 |
| CN113075398A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-07-06 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种血浆中特异性IgG抗体的定量测定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101833001A (zh) * | 2010-04-21 | 2010-09-15 | 黄若磐 | 一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法 |
| CN103534594A (zh) * | 2011-03-04 | 2014-01-22 | 伊缪诺维亚公司 | 确定胰腺癌存在的方法、阵列以及用途 |
-
2015
- 2015-03-17 CN CN201510115556.XA patent/CN104698170A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101833001A (zh) * | 2010-04-21 | 2010-09-15 | 黄若磐 | 一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法 |
| CN103534594A (zh) * | 2011-03-04 | 2014-01-22 | 伊缪诺维亚公司 | 确定胰腺癌存在的方法、阵列以及用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WILLIAM P. STEFURA ET AL: "Ultrasensitive ELISA for Measurement of Human Cytokine Responses in Primary Culture", 《ALLERGY METHODS AND PROTOCOLS》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108931651A (zh) * | 2017-05-24 | 2018-12-04 | 宜昌市中心人民医院 | 一种激肽释放酶7在血液中的含量检测方法及其作为诊断胰腺癌的血清标志物上的应用 |
| WO2021126100A1 (en) | 2019-12-18 | 2021-06-24 | Sabanci Universitesi | Interleukin 11 (il-11) as a biomarker and drug target in fatal liver cancer |
| CN113063949A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-07-02 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法 |
| CN113075398A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-07-06 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种血浆中特异性IgG抗体的定量测定方法 |
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