CN113063949A

CN113063949A - 一种血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法

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Publication number: CN113063949A
Application number: CN202110310770.6A
Authority: CN
Inventors: 曹海军; 杜晞; 李长清; 张容; 马莉; 王宗奎; 刘凤娟; 叶生亮
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2021-07-02

Abstract

本发明公开了一种血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法，属于抗体检测领域。该方法包括：1)将1份血浆样本分成2组，作为待测血浆和待处理对照血浆；2)用过量的抗原与待处理对照血浆孵育，中和其中的待检抗体，获得对照血浆；3)以待测血浆和对照血浆为样本，通过其与连接到固相载体的对应抗原结合，借助该抗原抗体复合物与IgM抗体、信号分子相继结合，产生可量化数据，并将2组可量化数据相减，得到检测数据；4)以千人份混合血浆作为标准品，稀释成不同浓度按照1)～3)所述制作标准曲线；5)将待测样品检测数据代入标准曲线，即获得血浆中特异性IgM抗体含量。本发明的测定方法可排除非特异性结合的影响，检测结果可靠。

Description

一种血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法

技术领域

本发明属于抗体检测领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一种起病隐匿的神经退行性疾病，也是导致老年痴呆最常见的原因。大多数AD患者发病在65岁以后，并且其发病率及病情程度与患者的年龄成正相关。AD目前无法治愈，且罕有药物可减缓其病程的发展。随着全球人口老龄化的加剧，AD患病率逐年增加，由此也将产生巨大的社会公共支出。我国已是世界上老龄人口最多的国家，随着未来几十年老龄化程度的不断加剧，AD患者将不断增加。AD之所以罕有药物可减缓其病程的发展，主要原因有两个：(1)AD起病隐匿，初期不易发觉，从而丧失了早期干预的“黄金期”；(2)AD发病机制复杂，目前尚未完全明确。尽管AD发病机制尚未明确，但关于这方面的研究已取得了很大进展。在诸多对AD发病机理的研究中，当前较为全面的是“β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)级联假说”，其认为AD的发生是由于Aβ在体内生成与清除的代谢失衡，使其在特定脑区沉积形成老年斑，并进一步触发tau蛋白过度磷酸化形成NFTs，最终导致突触丢失和神经元凋亡。此外，尽管AD发病机制还有其他假说，但均没有否定Aβ在AD发生、发展中的重要角色和地位。

对于内源性Aβ，如在体内异常积累，人体会产生有效的自身抗Aβ抗体以降低Aβ毒性作用。研究表明，Aβ代谢的异常比AD临床症状出现早二十多年，因此监测Aβ的变化对AD的早期预警具有重要意义。血液取材相对便捷，但Aβ在血液中含量甚微，再加之与血液其他成分结合，检测过程受其他成分影响等因素，很难在血液中准确定量。Aβ抗体含量变化可间接反映Aβ代谢是否异常，尤其是在AD临床症状发生前。相对于IgG抗体，IgM的多聚体对抗原有很高的亲和力，特别是抗原有多个重复表位的情况下。因此，IgM对Aβ的特异性要高于IgG，其对Aβ代谢异常预测要优于IgG。目前关于血浆中抗Aβ抗体的检测大多采用酶联免疫法，主要针对IgG，且没有统一的标准。不同研究的检测方法有细微不同，但结果差异很大。主要步骤是：包被Aβ抗原用来捕捉血浆中Aβ抗体，再依次加入二抗、酶及底物与其反应。通过测定底物吸光度来反映血浆中抗体浓度。此外，大多是以鼠源Aβ单抗(IgG)作为标准品来标定血浆中IgG抗体浓度。这种方法存在很大局限性：首先，血浆成分复杂，Aβ抗体以外的血浆成分会与包被的Aβ非特异性结合，最终影响检测的准确性；其次，鼠源的单抗和人源的多抗存在明显差异，Aβ有单体、多聚体等不统一的存在形式，其产生的抗体包含了很多多克隆抗体，以鼠源单抗来标定人源多抗本身就存在问题。

近年来人们已认识到非特异性结合对抗体检测的影响，因此已采取一定措施，主要方式包括：(1)对封闭剂、孵育时间、血清的稀释比、二抗种类进行替换/调整；(2)在洗涤剂中加入去垢剂(如吐温20)，洗去部分非特异性结合；(3)在检测血清和酶标抗体中用牛血清白蛋白稀释，增强特异性吸附。但这些方式只是在一定程度降低非特异性结合或提高特异性结合，但均不能避免非特异性结合对检测结果的影响。此外，对于特异性抗Aβ的IgM抗体检测而言，鼠源的IgM单抗及人源抗Aβ的IgM抗体均没有成型商品，检测过程中如要定标，还需制备标准品，也为检测带来了极大不便。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种几乎不受非特异性结合影响的特异性IgM抗体的定量测定方法。

本发明的技术方案如下：

一种血浆中特异性IgM抗体的测定方法，包括如下步骤：

1)将同一份血浆样本分成2组，作为待测血浆和待处理对照血浆；

2)使用过量的抗原与待处理对照血浆孵育，完全中和去除该血浆中的待检抗体，获得对照血浆；

3)以待测血浆和对照血浆为样本，使两组血浆内组分与连接到固相载体的对应抗原结合，形成复合物；加入生物素化二抗结合该复合物，再加入链霉素标记的信号分子，使信号分子间接地连接于前述固相载体；通过检测该信号分子，产生可量化数据，并将2组可量化数据相减，得到检测数据；

4)将检测数据代入标准曲线，计算获得特异性IgM抗体的含量；

所述抗原是待检抗体的抗原；

步骤3)所述的信号分子为酶、化学发光分子、荧光分子或放射性元素；

步骤4)所述标准曲线是以浓度已知的血浆或同种动物(包括人)上千个体的混合血浆作为标准品进行稀释后，按步骤1)～3)得到检测数据，与血浆浓度或稀释倍数数据分别取对数后，作出的标准曲线。

进一步地，步骤3)所述的酶为碱性磷酸酶，通过加入碱性磷酸酶的底物产生显色反应，测定吸光度得可量化数据。

进一步地，所述血浆为人血浆，步骤4)所述动物为人。

进一步地，所述特异性IgM抗体的抗原为β-淀粉样蛋白。

进一步地，所述β-淀粉样蛋白为Aβ₄₂寡聚体。

进一步地，所述Aβ₄₂寡聚体的制备方法如下：

向Aβ单体中加入聚合液，在4℃条件下聚合48-72h；

所述聚合液成分包括0.005～0.015M PBS、0.07～0.1％质量体积比的NaCl、0.025％～0.075％质量体积比的SDS，介质为水，pH为7.0～7.4；

优选地，所述聚合液成分包括0.01M PBS、0.085％质量体积比的NaCl、0.05％质量体积比的SDS，介质为水，pH为7.2。

进一步地，所述步骤2)的孵育过程中，抗原的浓度为50～100μg/ml。

进一步地，步骤2)的孵育在pH为7.2～9.6的环境中进行。

进一步地，步骤2)的孵育的温度为4℃或37℃。

进一步地，步骤2)的孵育时间为1～3h。

本发明方法具有如下有益效果：

本发明的方法将过量抗原孵育后的血浆作为对照血浆，可消除非特异性结合对检测结果的影响。

实验表明，将本发明的方法用于检测IgM抗体，的确具有优良的检测效果，比如，用于检测Aβ₄₂ IgM抗体时，可达到较宽的线性范围(6.25％-200％相对浓度下R²为0.9866，以40倍稀释的千人份血浆为100％)，还具有较低的检测限(2.07％)以及良好的重复性(CV值为5.4％)。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：Aβ₄₂不同形式孵育的对照血浆标线。A，Aβ₄₂寡聚体孵育；B，Aβ₄₂单体孵育。

图2：不同孵育时间的对照血浆标线。A，孵育1h；B，孵育3h。

图3：不同pH下孵育后的对照血浆标线。A，pH7.2；B，pH8.8；C，pH9.6。

图4：血浆中Aβ₄₂ IgM抗体标准曲线。

图5：常规方法检测血浆中Aβ₄₂ IgM抗体标准曲线。

图1～5中横轴标签为100％的抗体浓度等同于40倍稀释的千人份血浆中的抗体浓度。

具体实施方式

实施例1血浆中特异性抗Aβ₄₂寡聚体的IgM抗体的定量测定方法

本发明的方法包括如下步骤：

1.Aβ寡聚体制备：Aβ₄₂多肽，经过处理(向Aβ₄₂多肽中加入六氟异丙醇(HFIP)，并于通风橱中自然挥发至干燥5-6小时)使其变为均一的Aβ₄₂单体后，加入聚合液(0.01M PBS，0.085％质量体积比的NaCl，0.05％质量体积比的SDS，介质为水，pH 7.2)使Aβ₄₂浓度至100M，在4℃条件下聚合48-72h(聚合浓度450μg/ml)。

2.包被：将制备好的Aβ₄₂寡聚体用0.01M磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释后加入酶标板，4℃包被过夜。

3.封闭：倒掉微孔板液体，用洗板液洗板5次。加入200μl/孔封闭液，封闭37℃，3h。

4.标准血浆、待测血浆及对照血浆的准备：以千人份混合血浆做为标准品，分别用稀释液(1.5％BSA-TBS-T)稀释10倍，20倍，40倍，80倍，160倍，320倍，640倍，待测血浆稀释20倍或40倍。每个标准血浆和待测血浆均分为2等份，其中一份加入过量Aβ₄₂孵育，以达到完全去除血浆中抗体的目的，以此血浆做为对照血浆。

需要说明的是，血浆加入过量Aβ₄₂孵育后，所形成的混合体系仍是液体，不进行离心或过滤等分离。

5.加样：倒掉微孔板液体，洗板液洗5次，每孔加入100μl标准血浆、待测血浆和每个血浆的对照血浆(去除抗体的)，4℃放置过夜。

6.加二抗：倒掉微孔板液体，洗板液洗5次，每孔加入100μl用稀释液2000倍稀释的生物素-羊抗人IgM二抗，25℃孵育3h。

7.加酶：倒掉微孔板液体，洗板液洗5次，加入100μl用洗板液1500倍稀释的链霉素-AP(碱性磷酸酶标记的链霉素)，37℃孵育1.5h。

8.加底物：倒掉微孔板液体，洗板液洗5次，加入100μl pNPP(对硝基苯磷酸二钠)，室温孵育30min。

9.终止：加入100μl 1M NaOH终止后，测405nm处吸光度。

10.结果计算：标准血浆及单人份血浆的吸光值减去其一一对应的对照血浆的吸光值，以减去后的标准血浆为标准曲线计算单人份血浆中Aβ₄₂ IgM抗体相对于千人份混合血浆的含量。

以下用实验例进一步说明本发明的有益效果。

实验例1Aβ₄₂与血浆共同孵育条件优化

以下将以千人份混合血浆稀释到不同浓度后，各浓度分成2份，其中一份为标准血浆，另一份经Aβ₄₂孵育后作为对照血浆，对Aβ₄₂与血浆共同孵育条件进行优化(所未提及的Aβ₄₂抗体检测步骤同实施例1)，优化效果的好坏以标准血浆最终检测值制得的标准曲线优劣进行评判。

条件1：不同Aβ₄₂种类与血浆共同孵育：稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍血浆分别与Aβ₄₂寡聚体和Aβ₄₂单体在pH8.8缓冲液37℃条件下孵育3h。以其做为对照血浆，检测血浆中Aβ₄₂ IgM抗体含量，以不同稀释度血浆测得的吸光度减去对应的与Aβ₄₂共同孵育的血浆测得的吸光度为纵坐标，血浆Aβ₄₂抗体浓度为横坐标，测得吸光度见表1；以二者的对数做标线，见图1。

从结果可知，血浆与Aβ₄₂寡聚体共同孵育时去除Aβ₄₂ IgM抗体效果略优于血浆与Aβ₄₂单体体共同孵育。

表1以不同A_β42种类孵育的对照血浆测得的吸光度

条件2：Aβ₄₂与血浆共同孵育不同时间：稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍血浆分别与Aβ₄₂寡聚体在pH8.8缓冲液37℃条件下孵育1h、3h。以其做为对照血浆，检测血浆中Aβ₄₂ IgM抗体含量，以不同稀释度血浆测得的吸光度减去对应的与Aβ₄₂共同孵育的血浆测得的吸光度为纵坐标，血浆Aβ₄₂抗体浓度为横坐标，测得吸光度见表2；以二者的对数做标线，见图2。

从结果可知，血浆与Aβ₄₂寡聚体共同孵育3h时去除Aβ₄₂ IgM抗体效果明显优于共同孵育1h。

表2以不同Aβ₄₂浓度孵育的对照血浆测得的吸光度

条件3：不同缓冲液条件Aβ₄₂与血浆共同孵育：稀释20倍、40倍、80倍、160倍血浆与100μg/mlAβ₄₂寡聚体在pH7.2、pH8.8、pH9.6缓冲液条件下，37℃条件下孵育3h。以其作为对照血浆，检测血浆中Aβ₄₂ IgM抗体含量，以不同稀释度血浆测得的吸光度减去对应的与Aβ₄₂共同孵育的血浆测得的吸光度为纵坐标，血浆Aβ₄₂ IgM抗体浓度为横坐标，测得吸光度见表3；以2者的对数做标线，见图3。

从结果可知血浆在pH7.2缓冲液条件下与Aβ₄₂寡聚体共同孵育时去除血浆中Aβ₄₂抗体效果优于在pH8.8、pH9.6缓冲液条件。

表3以不同pH缓冲液条件下Aβ₄₂孵育的对照血浆测得的吸光度

标准曲线：用稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍血浆与100μg/mlAβ₄₂寡聚体在pH7.2缓冲液条件下37℃条件下孵育3h。以其作为对照血浆，检测血浆中Aβ₄₂ IgM抗体含量，以不同稀释度血浆测得的吸光度减去对应的与Aβ₄₂共同孵育的血浆测得的吸光度为纵坐标，血浆Aβ₄₂IgM抗体浓度为横坐标，测得吸光度，以2者的对数做标线，标准曲线线性良好，R²为0.9866，见图4。设定40倍稀释血浆作为Aβ₄₂ IgM抗体含量为100％，此方法测得血浆中Aβ₄₂抗体含量的线性范围为6.25％-200％。

可见，本发明的Aβ₄₂抗体检测方法线性范围较宽，线性良好。

实验例2本发明的方法学验证

本实验例对实施例1的方法进行方法学评估，具体如下：

1.方法检测限：将空白对照测定8次，OD值分别为0.097、0.102、0.099、0.095、0.102、0.097、0.102、0.097，计算出标准偏差δ为0.0028，带入公式(LOD＝3.3*δ/标准曲线斜率)计算LOD值为0.0146。再将其带入标线计算得到方法检测限为：2.07％。

2.方法重复性：将一待测血浆样品稀释三个不同浓度：50倍稀释、100倍稀释、200倍稀释，每一浓度三个重复进行检测，计算CV值。测得结果分别为91.14％、95.68％、99.029％、42.46％、46.54％、42.15％、23.20％、23.98％、23.98％。按稀释倍数换算后其值分别为113.92％、119.60％、123.79％、106.15％、116.36％、105.38％、116.00％、119.91％、119.91％，均值为115.67％，CV值为5.4％。

3.专属性：将与过量Aβ₄₂寡聚体孵育的40倍稀释血浆作为专属性考察样本。经过检测此样本吸光度为0.0001，将其带入标准曲线公式lgY＝0.6832lgX-1.9248计算其抗体含量，结果为0.00091％。而实际此样本经过抗原抗体反应后基本不含Aβ₄₂ IgM抗体，此结果与实际情况相符。

注：上述百分比均是以40倍稀释的千人份血浆中Aβ₄₂抗体含量(作为100％)为参照。

可见，本发明的方法检测限较低，重复性、专属性良好。

实验例3常规方法(不减对照)的方法学验证

在实施例1的方法的基础上，不设置对照血浆，作为对象，进行如下方法学评估：

1.线性范围：血浆稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍，检测不同浓度血浆中Aβ₄₂ IgM抗体含量，以不同稀释度血浆测得的吸光度为纵坐标，血浆Aβ₄₂ IgM抗体浓度为横坐标，以2者的双对数做标线，见图5。标准曲线线性较好，R²为0.9898。设定40倍稀释血浆的Aβ₄₂抗体含量为100％，则此方法测得血浆中Aβ₄₂抗体含量的线性范围为6.25％-200％。

2.专属性：将与过量Aβ₄₂寡聚体孵育的40倍稀释血浆作为专属性考察样本。经过检测此样本吸光度为0.263，将其带入标准曲线公式lgY＝0.4144lgX-1.0904计算其抗体含量，结果为17.3％。而实际此样本经过抗原抗体反应后基本不含Aβ₄₂ IgM抗体，说明血浆中其它物质严重干扰了检测，造成了假阳性结果，该方法并不能准确的反应血浆中真实Aβ₄₂IgM含量。

综上，本发明的血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法具有较宽的线性范围，较低的检测限，良好的重复性和专属性。

Claims

1.一种血浆中特异性IgM抗体的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：

所述抗原是待检抗体的抗原；

步骤4)所述标准曲线是以浓度已知的血浆或同种动物上千个体的混合血浆作为标准品进行稀释后，按步骤1)～3)得到检测数据，与血浆浓度或稀释倍数数据分别取对数后，作出的标准曲线。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：

步骤3)所述的酶为碱性磷酸酶，通过加入碱性磷酸酶的底物产生显色反应，测定吸光度得可量化数据。

3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：

所述血浆为人血浆，步骤4)所述动物为人。

4.如权利要求1～3任一所述的测定方法，其特征在于：

所述特异性IgM抗体的抗原为β-淀粉样蛋白。

5.如权利要求4所述的测定方法，其特征在于：

所述β-淀粉样蛋白为Aβ₄₂寡聚体。

6.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于：所述Aβ₄₂寡聚体的制备方法如下：

向Aβ单体中加入聚合液，在4℃条件下聚合48-72h；

7.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于：所述步骤2)的孵育过程中，抗原的浓度为50～100μg/ml。

8.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于：

步骤2)的孵育在pH为7.2～9.6的环境中进行。

9.如权利要求5～8任一所述的测定方法，其特征在于：

步骤2)的孵育的温度为4或37℃。

10.如权利要求5～8任一所述的测定方法，其特征在于：

步骤2)的孵育时间为1～3h。