CN114487421A - 一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，公开了一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用，所述衬底上通过Lys‑Au NPs@MoS2纳米复合材料固定有多种重组蛋白捕获抗体条形码，所述试剂盒，包括衬底、检测样本加载芯片、生物素标记的多种单克隆检测抗体、APC标记的链霉亲和素、工作液和多种抗原。本发明所公开的衬底上的Lys‑Au NPs@MoS2纳米复合材料的制备方法新颖、材料廉价、制备过程简单易操作；本发明的衬底以及试剂盒可以同时检测多种炎症因子，有利于提高检测效率；并且检测灵敏度高，耗时短，检测成本低。

Description

一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用。
背景技术
炎症(inflammation)：就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应。可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等，且炎症不仅仅局限于感染和创伤的病理生理过程。
近年来，随着对炎症因子的深入研究,发现炎症与多种疾病之间存在及其复杂的网络联系，例如动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭、心梗、心衰、血液栓塞、心肌病以及由宿主反应失调导致的器官功能障碍的脓毒症等的发病过程都伴随着炎症因子的参与。其中，心血管疾病已经成为人们死亡的首要原因。脓毒症的死亡率已经超过心肌梗死，成为死亡率较高的疾病。因此，提前检测和干预此类疾病已经成为当前的首要问题。
炎症因子包含很多种，其中包括降钙素原(PCT)、白介素6(IL6)、C反应蛋白(CRP)、肌钙蛋白I(CTnI)、肌钙蛋白T(CTnT)、N末端脑钠肽前体(NT-BNP)等。其中，PCT是用于检测细菌感染所致炎症反应的较好指标。IL6是一种炎症因子，感染反应发生后引起炎症反应，进而诱导PCT发生变化，但是对后续的监测效果较差。CRP在脓毒症感染后一定时间内升高，然后下降速度缓慢，对早期识别临床患者有利且其作为心肌梗死重要的预测因子之一，在临床上扮演着重要的角色。
迄今为止，检测炎症因子的方法得到了快速的发展。如:酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析，电化学阻抗谱、电化学和表面增强拉曼光谱(SERS)等方法。酶联免疫吸附法所需大量实验试剂，样品处理复杂，成本高，且检测过程容易出现假阳性；电化学阻抗谱指的是给电化学系统施加小振幅的交流电势波，通过测量交流电势与电流信号的比值达到检测的目的。然而该方法体系不稳定，检测线性范围窄，限制于单一生物标志物的检测，诊断效率低，为临床带来了极大的不便。近年来，表面增强拉曼光谱方法凭借其较高的分子特异性、较低的样品消耗量以及快速无创伤受到了极大的欢迎。然而，该方法实验过程繁琐，检测物单一且实验过程中通过金银纳米颗粒的拉曼增强效果达到最终检测的目的，大大降低了工作效率。总的来说，虽然以往开发的方法具有很好的特异性，但是当检测物浓度是痕量时，检测的精度往往要求很高且临床往往需要几种标志物辅助检测达到识别病因的目的。因此，建立一种操作简单、线性范围宽、分析时间短、灵敏度高且满足同时检测方法多种样本是至关重要的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用，以达到可以快速、低成本、高灵敏度进行多种炎症因子的检测的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种检测多种炎症因子的衬底，所述衬底上通过Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料固定有多种重组蛋白捕获抗体条形码。
上述方案中，所述多种重组蛋白捕获抗体条形码重复排列。
一种如上所述的检测多种炎症因子的衬底的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，纳米复合材料溶液的制备以及基片的前处理：
所述纳米复合材料溶液的制备包括如下过程：
(1)将MoS2纳米溶液超声处理备用，然后将Tween20，HAuCl4·H2O和柠檬酸钠加入超声处理后的MoS2纳米溶液中，剧烈搅拌在温度为70-90℃条件下反应20-60分钟；
(2)离心纯化得到AuNPs@MoS2纳米复合材料，并将其分散在超纯水中；
(3)将配置好的Lys水溶液与AuNPs@MoS2纳米复合材料溶液混合，常温下搅拌，过夜放置，得到Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液；
所述基片的前处理包括如下过程：
(1)将基片在食人鱼溶液中煮沸后，再用去离子水进行超声清洗；
(2)将清洗过的基片采用等离子体清洗机进行表面处理；
(3)将等离子体清洗机处理过的基片用APTMS处理，然后用去离子水超声清洗并吹干；
步骤二，基片上生长纳米复合材料：
将APTMS处理后的基片置于Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液中，一段时间后取出，用去离子水超声清洗并吹干，得到纳米复合材料功能化衬底；
步骤三，制备条形码铺设芯片：
利用光刻技术在硅基底上制备条形码铺设芯片模板，将PDMS与固化剂均匀铺到模板中，放入烘箱中，60-85℃烘烤10-30分钟后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间；从模板上将制备好的条形码铺设芯片揭下，制得的条形码铺设芯片上开设有多个进样孔、多个出样孔以及多条平行的流道，每条所述流道的两端分别连通一个进样孔和一个出样孔；
步骤四，重组蛋白捕获抗体与纳米复合材料功能化衬底的固定结合：
将制得的条形码铺设芯片与步骤二得到的纳米复合材料功能化衬底结合，通过重力贴合在一起；向每个进样孔中加入不同的重组蛋白捕获抗体，使其在流道中与纳米复合材料功能化衬底上的Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料结合，15-50分钟后冲洗流道移除多余的捕获抗体，然后将条形码铺设芯片揭下，并吹干纳米复合材料功能化衬底，至此，固定有多种重组蛋白捕获抗体条形码的衬底制备完成。
一种检测多种炎症因子的试剂盒，包括如上所述的衬底、检测样本加载芯片、生物素标记的多种单克隆检测抗体、APC标记的链霉亲和素、工作液和多种抗原。
上述方案中，所述衬底上的重组蛋白捕获抗体包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP重组蛋白捕获抗体，所述多种单克隆检测抗体包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP单克隆检测抗体，所述多种抗原包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP抗原。
上述方案中，所述检测样本加载芯片采用PDMS材料制备，其上开设多个上下贯穿的检测微腔。
上述方案中，所述工作液是BSA的DPBS溶液，BSA的质量占DPBS溶液的体积比例为1％，所述工作液的pH为7.2-7.4，浓度为0.01mol/L。
一种如上所述的检测多种炎症因子的试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)标准曲线绘制：将多种抗原分别用工作液进行浓度梯度稀释，作为标准品，将检测样本加载芯片贴附于衬底上，将标准品加入到检测样本加载芯片的各个检测微腔中，使得抗原与衬底上的特定捕获抗体结合，孵育完成后，将多余的液体移除；然后揭下检测样本加载芯片，将衬底用工作液冲洗，将没有吸附在衬底上的抗原冲洗干净；然后将提前混合好的生物素标记的多种单克隆检测抗体平铺在衬底上，使其充分与衬底上的抗原特异性结合，孵育完成之后，用工作液冲洗，将没有吸附在衬底上的检测抗体冲洗干净；紧接着将APC标记的链霉亲和素平铺在衬底上，使其与检测抗体结合，然后用工作液冲洗；最后检测荧光信号强度，绘制不同抗原的标准曲线；
(2)样本采集：抽取一定量的病人血液后，放在室温下，无菌环境中静置，取最上层淡黄色液体，将此液体低温离心；取上层液体，放入离心管中作为待测样本；
(3)样本检测：将检测样本加载芯片贴附于衬底上，将待测样本加入到检测样本加载芯片的各个检测微腔中，然后按照步骤(1)的方法进行待测样本中多种抗原的检测，根据得到的荧光值对照标准曲线，得到对应的不同炎症因子的含量。
通过上述技术方案，本发明提供的一种检测多种炎症因子的衬底及制备方法、试剂盒及应用具有如下有益效果：
1、本发明的衬底上的Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料的制备方法新颖、材料廉价、制备过程简单易操作；
2、本发明的衬底以及试剂盒可以同时检测多种炎症因子，并且可同时检测多个样本，有利于提高检测效率，节省检测时间；
3、本发明的衬底以及试剂盒检测灵敏度高，耗时短，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例所公开的一种检测多种炎症因子的衬底示意图；
图2为本发明实施例所公开的条形码铺设芯片示意图；
图3为本发明实施例所公开的检测样本加载芯片示意图；
图4为本发明实施例所公开的纳米复合材料溶液的制备以及基片的前处理过程示意图；
图5为检测多种炎症因子的原理示意图；
图6为CRP荧光强度与浓度之间的标准曲线图；
图7为本发明的方法对健康人与心血管病人多种蛋白标志物同时检测结果图。
图中，1、衬底；2、条形码；3、条形码铺设芯片；4、进样孔；5、出样孔；6、流道；7、检测样本加载芯片；8、检测微腔；9、捕获抗体；10、不同炎症因子；11、混合好的生物素标记的多种单克隆检测抗体；12、APC标记的链霉亲和素。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种检测多种炎症因子的衬底1，如图1所示，衬底1上通过Lys-AuNPs@MoS2纳米复合材料固定有多种重组蛋白捕获抗体9的条形码2。
本实施例中，条形码2呈几字型重复排列，肉眼不可见。
上述的一种检测多种炎症因子的衬底1的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，纳米复合材料溶液的制备以及基片的前处理：
纳米复合材料溶液的制备包括如下过程：
(1)将MoS2纳米溶液超声处理30min备用，在合成过程中，取2mL0.1mg/mL的MoS2纳米溶液加入到两口烧瓶中，然后向其中加入10μL浓度为100mM的Tween20，100μLHAuCl4·H2O和50μL浓度为100mM的柠檬酸钠，然后将该混合物在油浴锅中剧烈搅拌，加热至70℃，且在该温度下保持20分钟；
(2)将上述溶液进行离心纯化，得到AuNPs@MoS2纳米复合材料，并将其分散在超纯水中；
(3)将配置好的浓度为10mM的Lys水溶液与AuNPs@MoS2纳米复合材料溶液按照体积比为2:1进行混合，常温下搅拌30min，过夜放置，得到Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液。
基片的前处理包括如下过程：
(1)将基片(材料可以是玻璃，石英，硬质塑料)在食人鱼溶液中煮沸后，再用去离子水进行超声清洗；
(2)将清洗过的基片采用等离子体清洗机进行表面处理，进行衬底1羟基化；
(3)将等离子体清洗机处理过的基片用APTMS(氨丙基三甲氧基硅烷)处理，进行衬底1氨基化，然后用去离子水超声清洗并吹干。
步骤二，基片上生长纳米复合材料：
将APTMS处理后的基片置于步骤一制得的Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液中，30min后取出，用去离子水超声清洗并吹干，得到纳米复合材料功能化衬底。
步骤三，制备条形码铺设芯片3：
利用光刻技术在硅基底上制备条形码铺设芯片模板，将PDMS与固化剂均匀铺到模板中，放入烘箱中，80℃下烘烤50min后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间；从模板上将制备好的条形码铺设芯片3揭下，如图2所示，制得的条形码铺设芯片3上开设多个进样孔4、多个出样孔5以及多条平行的流道6，每条流道6的两端分别连通一个进样孔4和一个出样孔5。本实施例中，显示有6个进样孔4、6个出样孔5和6条流道6，也可以更多。
步骤四，重组蛋白捕获抗体9与纳米复合材料功能化衬底的固定结合：
将制得的条形码铺设芯片3放置在步骤二得到的纳米复合材料功能化衬底上，通过重力贴合在一起；向每个进样孔4中分别加入不同的重组蛋白捕获抗体9(CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP重组蛋白捕获抗体9)，使其在流道6中与纳米复合材料功能化衬底上的Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料结合，30分钟后用缓冲液冲洗流道6，将条形码铺设芯片3揭下，甩干纳米复合材料功能化衬底，至此，固定有多种重组蛋白捕获抗体9的衬底1制备完成(图1所示)。
缓冲液是采用去离子水、KH2PO4和Na2HPO4·2H2O配制PBS溶液，PH值在7-7.6。
一种检测多种炎症因子的试剂盒，包括如上的衬底1、检测样本加载芯片7、生物素标记的多种单克隆检测抗体、APC标记的链霉亲和素12、工作液和多种抗原。
本实施例中，多种单克隆检测抗体包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP单克隆检测抗体，多种抗原包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP抗原，用于制作标准品，绘制标准曲线。
检测样本加载芯片7采用PDMS材料制备，将PDMS与固化剂均匀铺到加载芯片模板中，放入烘箱中，80℃下烘烤50min后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间，将检测样本加载芯片7从加载芯片模板上取下。如图3所示，制备好的检测样本加载芯片7上开设多个上下贯穿的检测微腔8。
本实施例中，工作液是BSA的DPBS溶液，BSA的质量占DPBS溶液的体积比例为1％，工作液的pH为7.2-7.4，浓度为0.01mol/L。
一种如上所述的检测多种炎症因子的试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)标准曲线绘制：将多种抗原分别用工作液进行浓度梯度稀释，作为标准品，将检测样本加载芯片7贴附于衬底1上，用移液器将标准品加入到检测样本加载芯片7的各个检测微腔8中，使得抗原与衬底1上的特定捕获抗体9结合，孵育完成后，将多余的液体用移液器移除；然后揭下检测样本加载芯片7，将衬底1用工作液冲洗，将没有吸附在衬底1上的抗原冲洗干净；然后将提前混合好的生物素标记的多种单克隆检测抗体11平铺在衬底1上，使其充分与衬底1上的抗原特异性结合，孵育完成之后，用工作液冲洗，将没有吸附在衬底1上的检测抗体冲洗干净；紧接着将APC标记的链霉亲和素12平铺在衬底1上，使其与检测抗体结合，然后用工作液冲洗，检测原理如图5所示；最后通过GenePix 4400微阵列扫描仪检测荧光信号强度，其检测波长为488nm，绘制不同抗原的标准曲线；本实施例中用CRP抗原绘制的浓度与荧光强度的标准曲线如图6所示。
(2)样本采集：采用非抗凝管抽取一定量的病人血液后，放在室温下，无菌环境中静置3个小时，取最上层淡黄色液体，将此液体低温离心，3000rpm，10分钟；取上层液体，放入离心管中，-80℃保存，作为待测样本；
(3)样本检测：将另一干净的检测样本加载芯片7贴附于另一干净的衬底1上，将待测样本用移液器加入到检测样本加载芯片7的各个检测微腔8中，然后按照步骤(1)的方法进行待测样本中多种抗原的检测，检测原理如图5所示，根据得到的荧光值对照标准曲线，得到对应的不同炎症因子10的含量。
利用本发明的上述方法对15个健康人与20个心血管病人的血液中的不同炎症因子10同时进行检测，检测结果如图7所示，每条线为一种炎症因子的蛋白标志物，A为心血管病人，C为健康人。从图7可以看到，本发明的衬底1和试剂盒可以同时检测多组样品，并且能够同时检测出每个样本中的多种炎症因子。
本发明的试剂盒内有已绘制好的标准曲线图，用户也可以根据需要自己绘制标准曲线。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种检测多种炎症因子的衬底，其特征在于，所述衬底上通过Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料固定有多种重组蛋白捕获抗体条形码。
2.根据权利要求1所述的一种检测多种炎症因子的衬底，其特征在于，所述多种重组蛋白捕获抗体条形码重复排列。
3.一种如权利要求1所述的检测多种炎症因子的衬底的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，纳米复合材料溶液的制备以及基片的前处理：
所述纳米复合材料溶液的制备包括如下过程：
(1)将MoS2纳米溶液超声处理备用，然后将Tween20，HAuCl4·H2O和柠檬酸钠加入超声处理后的MoS2纳米溶液中，剧烈搅拌在温度为70-90℃条件下反应20-60分钟；
(2)离心纯化得到AuNPs@MoS2纳米复合材料，并将其分散在超纯水中；
(3)将配置好的Lys水溶液与AuNPs@MoS2纳米复合材料溶液混合，常温下搅拌，过夜放置，得到Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液；
所述基片的前处理包括如下过程：
(1)将基片在食人鱼溶液中煮沸后，再用去离子水进行超声清洗；
(2)将清洗过的基片采用等离子体清洗机进行表面处理；
(3)将等离子体清洗机处理过的基片用APTMS处理，然后用去离子水超声清洗并吹干；
步骤二，基片上生长纳米复合材料：
将APTMS处理后的基片置于Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料溶液中，一段时间后取出，用去离子水超声清洗并吹干，得到纳米复合材料功能化衬底；
步骤三，制备条形码铺设芯片：
利用光刻技术在硅基底上制备条形码铺设芯片模板，将PDMS与固化剂均匀铺到模板中，放入烘箱中，60-85℃烘烤10-30分钟后，从烘箱中取出，在室温下放置一段时间；从模板上将制备好的条形码铺设芯片揭下，制得的条形码铺设芯片上开设有多个进样孔、多个出样孔以及多条平行的流道，每条所述流道的两端分别连通一个进样孔和一个出样孔；
步骤四，重组蛋白捕获抗体与纳米复合材料功能化衬底的固定结合：
将制得的条形码铺设芯片与步骤二得到的纳米复合材料功能化衬底结合，通过重力贴合在一起；向每个进样孔中加入不同的重组蛋白捕获抗体，使其在流道中与纳米复合材料功能化衬底上的Lys-Au NPs@MoS2纳米复合材料结合，15-50分钟后冲洗流道移除多余的捕获抗体，然后将条形码铺设芯片揭下，并吹干纳米复合材料功能化衬底，至此，固定有多种重组蛋白捕获抗体条形码的衬底制备完成。
4.一种检测多种炎症因子的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的衬底、检测样本加载芯片、生物素标记的多种单克隆检测抗体、APC标记的链霉亲和素、工作液和多种抗原。
5.根据权利要求4所述的一种检测多种炎症因子的试剂盒，其特征在于，所述衬底上的重组蛋白捕获抗体包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP重组蛋白捕获抗体，所述多种单克隆检测抗体包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP单克隆检测抗体，所述多种抗原包括CRP、CTnI、CTnT、PCT、IL6和NT-BNP抗原。
6.根据权利要求4所述的一种检测多种炎症因子的试剂盒，其特征在于，所述检测样本加载芯片采用PDMS材料制备，其上开设多个上下贯穿的检测微腔。
7.根据权利要求4所述的一种检测多种炎症因子的试剂盒，其特征在于，所述工作液是BSA的DPBS溶液，BSA的质量占DPBS溶液的体积比例为1％，所述工作液的pH为7.2-7.4，浓度为0.01mol/L。
8.一种如权利要求4所述的检测多种炎症因子的试剂盒的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)标准曲线绘制：将多种抗原分别用工作液进行浓度梯度稀释，作为标准品，将检测样本加载芯片贴附于衬底上，将标准品加入到检测样本加载芯片的各个检测微腔中，使得抗原与衬底上的特定捕获抗体结合，孵育完成后，将多余的液体移除；然后揭下检测样本加载芯片，将衬底用工作液冲洗，将没有吸附在衬底上的抗原冲洗干净；然后将提前混合好的生物素标记的多种单克隆检测抗体平铺在衬底上，使其充分与衬底上的抗原特异性结合，孵育完成之后，用工作液冲洗，将没有吸附在衬底上的检测抗体冲洗干净；紧接着将APC标记的链霉亲和素平铺在衬底上，使其与检测抗体结合，然后用工作液冲洗；最后检测荧光信号强度，绘制不同抗原的标准曲线；
(2)样本采集：抽取一定量的病人血液后，放在室温下，无菌环境中静置，取最上层淡黄色液体，将此液体低温离心；取上层液体，放入离心管中作为待测样本；
(3)样本检测：将检测样本加载芯片贴附于衬底上，将待测样本加入到检测样本加载芯片的各个检测微腔中，然后按照步骤(1)的方法进行待测样本中多种抗原的检测，根据得到的荧光值对照标准曲线，得到对应的不同炎症因子的含量。
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