RU2298795C2 - Набор для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям torch-инфекций методом дот-иммуноанализа - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, в частности к наборам для иммунохимического анализа препаратов крови и направлено на усовершенствование тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний. Сущность изобретения состоит в том, что в предлагаемый набор входят плотные подложки в виде отдельных стрипов. На каждом стрипе дискретно нанесены антигены и человеческие иммуноглобулины. Набор содержит растворы для отмывок, разведения образца и конъюгата, конъюгат и систему проявления. Техническим результатом является возможность определения в одном анализе сразу ряда параметров и значительного сокращения времени на обследование пациента. 7 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 ил.

Description

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа препаратов крови и направлено на усовершенствование тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний, в частности для обследования беременных женщин и новорожденных детей на наличие TORCH-инфекций. Термином TORCH-инфекции (Toxoplasma, Others, Rubella, Cytomegalovirus, Herpes) обозначают большую группу инфекционных заболеваний, приводящих к не вынашиванию и внутриутробным поражениям плода вплоть до его гибели. В подгруппу Others входят заболевания, передающиеся половым путем (сифилис, трихомониаз, гонорея, бактериальный вагиноз, мико - и уреаплазмоз и др.). Большинство заболеваний TORCH-группы характеризуются: широким (30% и более) распространением среди населения разных регионов мира, множественностью путей заражения, возможностью внутриутробного инфицирования плода, частым сочетанием двух и более возбудителей, взаимно усиливающих патогенность, а также скудностью и отсутствием специфичности клинической симптоматики.

Одним из основных способов диагностики и дифференциации таких заболеваний является серологическое обследование пациентов с целью выявления антител (IgG и IgM) к отдельным возбудителям. В настоящее время такое обследование проводится с помощью тест-систем, которые позволяют выявлять антитела только к одному-двум возбудителям [1-4]. Поскольку при комплексном обследовании пациентов необходимо провести около десятка анализов, оно представляет собой длительную и весьма дорогую процедуру.

Настоящее изобретение предполагает одновременное (в одном анализе) выявление в исследуемых образцах специфических, антител к восьми возбудителям TORCH-инфекций (Toxoplasma gondii, Clamidia trachomatis, Rubella virus, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealytica, Treponema pallidum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus-1). Сущность такого выявления заключается в образовании специфических комплексов между антителами исследуемого образца и известными антигенами, в определенном порядке дискретно зафиксированными на плотной подложке. Образовавшиеся комплексы затем обнаруживаются с помощью вторичного иммунореагента, специфичного к антителам анализируемой сыворотки (антивидовые антитела, стафилококковые белки А и G и др.), и связанного с легко выявляемой меткой - каталитически активными золями золота или серебра.

Сочетание нескольких анализов на одной подложке имеет сложности, связанные с разнообразием химических и эксплуатационных характеристик используемых антигенов. Способ получения антигенов, их биохимические и конформационные особенности часто требуют тщательного подбора условий сорбции белков и выполнения анализа. Возможно, этим и объясняется тот факт, что до настоящего времени комплексный подход в клинической практике иммунодиагностики не реализован. Появление новых технологий получения и очистки антигенов позволило в значительной степени унифицировать их свойства и сделать возможным их совместное использование.

Известны наборы ИФА для определения суммарных антител к 4 инфекциям [5, 6]. В наборах используют смесь конъюгатов 4 антигенов с пероксидазой, выявляя антитела ко всем 4 инфекциям в одной лунке.

Недостатком этих наборов является невозможность дифференцированного выявления отдельных возбудителей.

Известен также набор "Orgenics immunocomb HIV 1+2 bi-spot" фирмы «Orgenics» (Франция) для определения антител на непористых носителях [7]. Этот набор позволяет проводить одновременно выявление антител к вирусам имунодефицита человека 1 и 2 типов (HIV 1+2) в одном из вариантов дот-иммуноанализа на поверхности непористого носителя. Его рабочий элемент (твердая фаза) представлен в виде плоской пластиковой гребенки, на каждом зубце которой нанесены в виде отдельных пятен антигены HIV 1 и 2, а также человеческие иммуноглобулины - контроль для проверки работы конъюгата. Набор содержит все рабочие растворы, готовые к применению. При положительном результате анализа в месте нанесения антигена образуются визуально определяемые синие пятна. Эту тест-систему можно рассматривать как набор для дифференциального, многопрофильного анализа, но только на две близкородственные инфекции. Кроме того, в этой тест-системе применена относительно дорогая и нестабильная система детекции со щелочной фосфатазой.

Наиболее близким техническим решением является набор, описанный в Патенте США №5486452 [8, прототип], в состав которого входит устройство для иммунологического анализа, представляющее собой пористую подложку, содержащую множественные ограниченные области адсорбированных на ее поверхности различных антигенов, представленные в виде точек, микроточек или линий, расположенных в определенном геометрическом порядке, и полученные путем нанесения аликвот антигенов на подложку дозирующими устройствами. Свободные от антигенов участки подложки блокированы неспецифическим белком. Набор содержит также реактивы индикаторной системы, позволяющей выявлять комплексы антиген-антитело.

Приведенный выше набор имеет следующие недостатки:

1. В качестве плотной подложки устройства используется пористая матрица, предпочтительно из нитроцеллюлозы, с толщиной листа, предпочтительно, 0,1 мм. Такие матрицы отличаются хрупкостью и малой механической прочностью, что значительно затрудняет их рутинное использование. Другим недостатком таких подложек является сложность удаления не связавшихся компонентов реакции из мелких пор матрицы (длительная, многократная отмывка с активацией), что значительно усложняет методику и повышает вероятность фоновых явлений.

2. С целью миниатюризации описанного устройства, зоны адсорбции антигенов представлены в виде пятен диаметром менее 2 мм или линиями с шириной менее 2 мм (получаемые нанесением аликвот антигенов в объеме менее 1 мкл), что предполагает использование специальных считывающих устройств и не позволят проводить достоверный прямой визуальный учет результатов анализа.

3. В качестве индикаторной системы используются антитела или белок комплемента, конъюгированные с изотопной, флуоресцентной или ферментной (пероксидазой хрена) меткой. Работа с изотопами требует обеспечения специальных условий безопасности и не может широко использоваться в рутинных анализах. Использование флуоресцентных меток требует весьма дорогого и потому обычно недоступного для клинической практики оборудования для инструментального учета результатов анализа. Для анализов с применением в качестве метки пероксидазы хрена в сочетании с субстратами, дающими нерастворимые продукты (4-хлоро-1-нафтол или 3,3-диаминобензидин) характерна относительно невысокая чувствительность, примерно на порядок уступающая чувствительности планшетного варианта иммунопероксидазного теста с использованием субстратов, дающих растворимые окрашенные продукты [9].

4. В указанном наборе растворы для отмывок и разведения иммунореагентов не содержат компонентов, снижающих вероятность образования иммунных комплексов с низкой авидностью, что может негативно сказываться на специфичности полученных результатов. В таких условиях для снижения фоновых реакций авторы применяют высокие (минимум 1:100) разведения образца, что может привести к ложноотрицательному определению образцов с низким содержанием специфических антител.

Технической задачей настоящего изобретения является получение набора для многопрофильного чувствительного определения антител к возбудителям TORCH-инфекций с визуальным учетом результатов, пригодного для рутинного использования в клинической практике.

Поставленная задача решается использованием предлагаемого набора, включающего:

1. Плоскую непористую подложку, изготовленную из пластика (предпочтительно из белого полистирола), на которой дискретно, в определенном порядке нанесены в виде отдельных пятен антигены возбудителей TORCH-инфекций, и положительный контроль. Плотные подложки имеют ширину от 7 до 10 мм и длину от 50 до 70 мм. Ширина подложки позволяет наносить антигены в два ряда аликвотами до 3 мкл, а длина - позволяет удобно работать с растворами, разлитыми в пенфлаконы. На каждой подложке дискретно нанесены восемь антигенов возбудителей TORCH-инфекций (Toxoplasma gondii, Clamidia trachomatis, Rubella vims, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealytica, Treponema pallidum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus-1), а также человеческие иммуноглобулины - контроль эффективности работы конъюгата (иммунозоля) (см. фиг.1). Отрицательным контролем служат участки, свободные от антигенов и положительного контроля. Антигены на подложку наносятся в насыщающей концентрации для отдельных антигенов эта концентрация может варьировать от 5 до 25 мкг/мл (предпочтительно - 10 мкг/мл). В качестве антигенов могут быть использованы как природные, так и рекомбинантные белки, однако все они в одинаковых условиях анализа должны эффективно связывать специфические антитела. Подбор антигенов для такой системы может быть осуществлен в планшетном варианте ИФА с одинаковыми условиями сорбции антигена и постановки анализа. Таким же образом может быть подобрана концентрация антигена для сорбции на твердую подложку. Нанесение антигена может быть в виде дозированных аликвот объемом 1-3 мкл или в виде электроспрея. В последнем варианте антиген может наноситься в виде пятен или символов определенных очертаний, что в дальнейшем повышает достоверность учета результатов. Порядок нанесения антигенов маркируется на нерабочей части подложки и приводится в инструкции по применению. После фиксации антигенов свободные участки подложки блокируются одним или несколькими природными или синтетическими полимерами, такими как казеин (предпочтительно), бычий сывороточный альбумин или полиэтиленгликоль.

2. Конъюгат (иммунозоль), представляющий собой золь золота или серебра (средний диаметр частиц 10-20 нм), связанный с антителами против иммуноглобулина G человека или со стафилококковыми протеинами А или G. Иммунозоли получают в соответствии с известными методиками [10, 11].

3. Физический проявитель для усиления иммунологического сигнала, содержащий растворимую соль серебра и восстанавливающий агент.

Предпочтительно в наборе используется двухкомпонентный проявитель, содержащий:

- сухую смесь метола и лимонной кислоты в соотношении по массе 2:5, соответственно, таблетированную или расфасованную по 35 мг,

- 10%-ный раствор AgNO₃ (во флаконе из темного стекла). Проявитель готовят непосредственно перед использованием, растворяя одну порцию сухой смеси в 5 мл дистиллированной воды и, затем, добавляя в полученный раствор 100 мкл раствора азотнокислого серебра [12].

4. Раствор для отмывок конъюгата (ТСР-Т): 0,01 моль/л трис-HCl с 0,17 моль/л NaCl и 0,1% твин-20, рН 7,2-7,4.

5. Раствор для разведения конъюгата (РБР-К) в нем используется ТСР-Т с добавкой 5% лизата клеток Е.coli, рН 7,2-7,4 (в качестве лизата клеток Е.coli может быть, например, использован коммерческий препарат - «концентрат блокирующего раствора» (КБР), производства фирмы «Капель», г.Москва).

6. Раствор для разведения образцов сывороток (РБР-С): РБР-К, доведенный 0,1 моль/л раствором NaOH до рН 9,5-9,7.

Схема многопрофильного анализа с использованием предлагаемого набора включает в себя последовательные инкубации подложки:

- в разведении анализируемой сыворотки или плазмы крови 1:10 на РБР-С (30 мин, 37°С),

- в двух сменах отмывочного раствора (по 2 мин, 20°С),

- в растворе рабочего разведения конъюгата (30 мин, 37°С), в двух сменах отмывочного раствора (по 2 мин, 20°С) с последующим ополаскиванием дистиллированной водой,

- в физическом проявителе (субстрате для проявления золя) (10 мин, 20°С).

После проявления устройство в течение 1 мин промывается дистиллированной водой и подсушивается на воздухе. Учет результатов производится визуально по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения соответствующих антигенов. Возможен инструментальный учет с использованием сканирующего устройства и последующей компьютерной обработки изображения.

Предлагаемый набор имеет следующие отличия от прототипа:

- плоская подложка для иммунологического анализа изготовлена из непористого пластика, обладающего механической прочностью, хорошими адсорбционными свойствами, совместимого с компонентами набора и легко отмывающегося от избыточных и не связавшихся компонентов анализа (см. Пример 1);

- на подложке устройства нанесен определенный набор из восьми антигенов возбудителей TORCH-инфекций (Toxoplasma gondii, Clamidia trachomatis, Rubella virus, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealytica, Treponema pallidum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus-1), а также положительный контроль (человеческие иммуноглобулины) - контроль эффективности работы конъюгата (см. Фиг.1);

- антигены и контроль на поверхности подложки нанесены в виде расположенных в определенном порядке отдельных точек, что позволяет прямой визуальный учет результатов анализа;

- антигены и контроль наносятся на подложку в виде растворов с концентрацией белка от 5 до 25 мкг/мл (предпочтительно 10 мкг/мл) аликвотами от 1 до 3 мкл;

- в наборе использованы: в качестве конъюгата - иммунозоль золота или серебра, а в качестве проявляющей системы - физический проявитель, способные повысить чувствительность определения, по сравнению с пероксидазными конъюгатами (см. Пример 2);

- в состав растворов для отмывок, разведения образцов и конъюгата введен неионный детергент (твин-20), а в состав раствора для разведения конъюгата, кроме того, введен лизат клеток Е.coli, это позволяет за счет снижения вероятности образования иммунных комплексов с низкой авидностью повысить специфичность анализа и выполнять его при малом разведении образца (1:10).

Предлагаемый набор содержит полный комплект компонентов и может использоваться не только в крупных, но и в слабо оснащенных лабораториях, как для массового скрининга сывороток, так и для индивидуальных анализов. Чувствительность многопрофильного анализа с использованием предлагаемого набора не уступает чувствительности серийно выпускающихся планшетных моноспецифических иммунопероксидазных тестов (см. Пример 3). При использовании в наборе в качестве конъюгата - золя золота или серебра, связанного с антителами против IgG человека, и нанесении в точке положительного контроля на подложке IgG-антител человека, набор может быть использован для определения в образцах спектра IgG-антител к указанным возбудителям. Предлагаемый набор позволяет за счет определения в одном анализе сразу ряда параметров значительно сократить время на обследование пациента. Кроме того, поскольку один анализ с использованием предлагаемого набора эквивалентен нескольким анализам в моноспецифических системах и по стоимости эти анализы близки, внедрение изобретения в широкую практику может дать значительный экономический эффект.

Описание чертежа.

На чертеже показана схема нанесения антигенов и контроля на подложку. Все антигены и контроль нанесены в концентрации 10 нг/мл аликвотами по 2 мкл (20 нг белка на точку). Блокировка подложки казеином.

Долее следуют примеры конкретного применения набора.

В пробных экспериментах используют:

Устройства для многопрофильного иммуноанализа с нанесенными по схеме, приведенной на чертеже, в количестве 20 нг белка на точку антигенами:

1) рекомбинантный антиген (В10) Toxoplasma gondii;

2) смесь рекомбинантных белков (р17 и р41) Treponema pallidum;

3) смесь рекомбинантных белков (Е1, Е2 и С) Rubella virus;

4) рекомбинантный антиген (G1) Herpes simplex virus - 1 type (HSV-1);

5) рекомбинантный антиген (p150) Cytomegalovirus (CMV);

6) рекомбинантный антиген (МОМР) Chlamidia trachomatis;

7) натуральный антиген Mycoplasma hominis;

8) натуральный антиген Ureaplasma urealytica;

9) IgG из сыворотки крови человека - положительный контроль

Растворы:

- ТСР-Т - 0,01 моль/л Трис-HCl с 0,17 моль/л NaCl и 0,1% твин-20, рН 7,2-7,4;

- РБР-К - TCR-T с 5% лизата Е.coli рН 7,2-7,4.

- ББ - 0,025 М Na-тетраборатный буфер, рН 8,0;

- РБР-С - раствор для разведения сывороток - РБР-К доведенный 0,1 моль/л раствором NaOH до рН 9,6,

- Физический проявитель - водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,2% метола и 0,2% нитрата серебра.

ПРИМЕР 1. ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ ЛИСТОВЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПОДЛОЖКИ ДЛЯ МНОГОПРОФИЛЬНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ В ЖИДКИХ ОБРАЗЦАХ.

Получение подложки

Образцы трех категорий листовых синтетических материалов:

пористых нитроцеллюлозных матриц, непористых органических полимеров (полистирола, поливинилхлорида и лавсана) и синтетической бумаги (см. табл.1) отмывают дистиллированной водой и нарезают на стрипы с размерами 8×60 мм. На поверхность пластика, в два ряда вдоль стрипа с интервалами по 5 мм, наносят антигены (см. фиг.1), а также IgG из сыворотки человека (контроль работы конъюгата) в концентрации 10 мкг/мл на ББ, аликвотами по 2 мкл, и высушивают при комнатной температуре. Длина рабочей части стрипа (участка с нанесенными антителами) составляет около 25 мм, свободную часть стрипа используют как рукоятку. Стрипы на 2/3 длины рабочей частью погружают в 0,2%-ный раствор казеина инкубируют 1 ч при 37°С. Ополаскивают стрипы дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре.

Применение подложки

На подложках, изготовленных из разных материалов, параллельно осуществляют многопрофильный дот-иммуноанализ одного образца сыворотки, содержащего (по данным ИФА) антитела к HCV-1, CMV, Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis. Подложки рабочей частью погружают в образец сыворотки в разведении 1:10 на РБР-С и инкубируют 30 мин при 37°С. Отмывают двукратно погружением на 2 мин в ТСР-Т, инкубируют 30 мин при 37°С в рабочем разведении золя золота, связанного со стафилококковым белком A (Au-SpA). Отмывают двукратно погружением на 2 мин в ТСР-Т и ополаскивают дистиллированной водой. Погружают подложки на 10 мин в физический проявитель, ополаскивают водой и подсушивают на воздухе. После выполнения анализа проводят визуальную сравнительную оценку интенсивности цветных сигналов на подложках из разных материалов. При этом оценивают два основных параметра:

- эффективность адсорбции антигенов и контроля на подложке, о которой судят по интенсивности специфического сигнала в местах нанесения контроля, а также антигенов HCV-1, CMV, Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis.

- способность материала к неспецифическому связыванию (удерживанию при отмывках) компонентов или к спонтанному проявлению, о которых судят по наличию фонового сигнала на несенсибилизированных участках устройства.

Потенциально пригодными для изготовления подложки устройства считают механически прочные материалы, обеспечивающие адсорбцию антигенов и не провоцирующие фоновых сигналов. Полученные результаты оценки материалов приведены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты оценки пригодности различных синтетических материалов для изготовления подложки устройства для многопрофильного анализа антител.
Характеристики материала			Результаты оценки
Категория, марка, (ТУ), источник получения	Толщина мм	Цвет	Прочность	Сорбция	Фон	Пригодность
Пористые мембраны HAWP Millipore, США	0,1	Белый	-	+	+/-	Нет
Полистирол УППС-0801 (ТУ-24-27-90) ЗАО «Кайрос», г.Омск	0,2	Белый	+	+	-	Да
ПВХ Titrrteck, Финляндия	0,5	Прозрачный	+	+/-	-	Да
Полиэтилен-терифталат (Лавсан) ООО «Амипак», г.Москва	0,3	Прозрачный	+	+/-	-	Да
Синтетическая бумага "POLILITH" Фирма «Берег», С-Петербург,	0,15	Белый	+	+	-	Да
+ сильный сигнал +/- слабый сигнал - нет сигнала

ПРИМЕР 2. СРАВНЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МНОГОПРОФИЛЬНОГО АНАЛИЗА НА ПОДЛОЖКАХ ЛИСТОВОГО ПОЛИСТИРОЛА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В КАЧЕСТВЕ МЕТКИ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОРЕАГЕНТОВ КАТАЛИТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЗОЛЕЙ И ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА.

Анализ проводят на подложках, изготовленных из белого листового полистирола марки УППС-0801, так, как это описано в Примере 1.

По три одинаковых подложки в вертикальном положении инкубируют 30 мин при 37°С в разведении 1/10 на РБР-С каждого из 6 образцов исследуемых сывороток и отмывают двукратно погружением на 2 мин в ТСР-Т. Затем по одной подложке из каждого образца инкубируют 30 мин при 37°С в одном из конъюгатов:

- золе серебра (10 нм), связанном с антителами против IgG человека (Ag-a/IgG);

- золе золота (20 нм), связанном со стафилококковым белком А (Au-SpA);

- моноклональными антителами против IgG человека, связанными с пероксидазой хрена (коммерческий препарат фирмы «Капель», Москва).

Подложки отмывают по 2 мин в двух сменах ТСР-Т и ополаскивают дистиллированной водой. Подложки, бывшие в контакте с иммунозолями золота и серебра, проявляют 10 мин при 20°С в физическом проявителе, а инкубировавшиеся с пероксидазным конъюгатом - проявляют 20 мин при 20°С в коммерческом диаминобензидиновом субстрате «Peroxidase substrate Kit DAB" (Cat. SK-41100), производства "Vector lab. Inc.", Burllingem, CA, США. Проявленные подложки ополаскивают водой и визуально оценивают наличие и интенсивность цветных сигналов в местах нанесения соответствующих антигенов. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты сравнения чувствительности многопрофильного дот-иммуноанализа, выполненного с использованием иммунозолей и пероксидазного конъюгата.
Антиген	Результаты многопрофильного дот-иммуноанализа с конъюгатами:
	Ag-a/IgG						Au-SpA						ПХ-a/IgG
	Образцы сывороток
	1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
Toxoplasma	-	±	+	-	-	-	-	±	+	-	-	-	-	-	+	-	-	-
Rubella	±	+	+	-	+	-	±	+	+	-	+	-	-	+	-	-	+	-
CMV	+	-	±	+	-	+	+	-	+	+	-	+	-	-	-	-	-	+
Chlamidia	+	-	-	+	-	±	+	-	-	+	-	+	+	-	-	-	-	-
HSV-1	+	-	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+	-	-	+	+	+
Tr. pallidum	+	-	-	±	-	-	+	-	-	+	-	-	+	-	-	-	-	-
Ureaplasma	±	-	-	+	±	-	±	-	-	+	+	-	-	±	-	-	-	-
Mycoplasma	-	+	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+
IgG-контроль	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
+ отчетливо определяемое пятно в месте нанесения антигена (положительный результат), ± слабо определяемое пятно в месте нанесения антигена (слабоположительный результат), - чистый фон подложки (отрицательный результат).

ПРИМЕР 3. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВОЗБУДИТЕЛЯМ TORCH-ИНФЕКЦИЙ В МНОГОПРОФИЛЬНОМ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ И В ПЛАНШЕТНОМ АНАЛИЗЕ НА МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ.

Многопрофильный анализ проводят на подложках, изготовленных из синтетической бумаги «Polylith» марки GC-1 (фирма «Берег», С-Петербург). Подготовку подложек и выполнение дот-иммуноанализа проводят так, как это описано в Примере 1. Результат считают положительным, если в месте нанесения соответствующего антигена визуально определяется четко различимое темное пятно.

Иммунопероксидазный планшетный анализ проводят на моноспецифических тест-системах для определения антител к отдельным TORCH-инфекциям, серийно выпускающихся ЗАО «ИмДи» (г.Новосибирск). Выполнение иммуноанализа и учет результатов проводят в соответствии с инструкциями производителя. Для определения титра антител, готовят серию двукратных разведений на РБР-С образцов сывороток (от 1:10) и анализируют каждое разведение. За титр антител принимают наибольшее разведение образца, в котором уровень сигнала превышает ОП Крит. Результаты, полученные с использованием предлагаемого набора, в сравнении с данными моноспецифического иммуноферментного анализа приведены в таблице 3.

Таблица 3. Сравнительные результаты определения антител к возбудителям TORCH-инфекций в моноспецифическом ИФА и многопрофильном дот-анализе
Тест-система	Обратные титры (Т-1) сывороток в моноспецифическом планшетном варианте ИФА								Результаты многопрофильного дот-анализа
Конъюгат	ПХ-a/IgG								Au-SpA
Сыворотка	1	2	3	4	5	6	7	8	1	2	3	4	5	6	7	8
T.pallidum	640	отр	отр	20	отр	отр	80	отр	+	-	-	+	-	-	+	-
Rubella	20	10	отр	40	отр	160	40	отр	+	±	-	+	-	+	+	-
Chlamidia	640	отр	отр	40	отр	10	отр	40	+	-	-	+	-	±	-	+
Toxoplasma	10	отр	40	160	80	отр	отр	отр	+	-	+	+	+	-	-	-
HSV-1	160	40	отр	40	20	отр	80	80	+	+	-	+	+	-	+	+
CMV	40	отр	40	отр	640	отр	80	40	+	-	+	-	+	-	+	+
Ureaplasma	отр	отр	отр	отр	отр	20	20	20	-	-	-	-	-	+	+	+
Mycoplasma	отр	отр	20	отр	отр	10	отр	20	-	-	+	-	-	±	-	+
Контроль									+	+	+	+	+	+	+	+
+ отчетливо определяемое пятно в месте нанесения антигена (положительный результат), ± слабо определяемое пятно в месте нанесения антигена (слабоположительный результат), - чистый фон подложки (отрицательный результат).

Источники информации

1. Заявка РФ №96106064 «Мешочек для размещения полоски с реагентом, комбинация подушечки с реагентом и камеры», A 61 J 19/00.

2. Патент США №6265176 «Dot immunoassay on plastic sheets", G 01 N 33/543.

3. Патент США №5486452 "Devices and kits for immunological analysis", G 01 N 33/548.

4. Патент США №5508168 "Method and reagents for the detection of Herpes simplex virus, Treponema pallidum and Haemophilus duecreyi" С 12 Q 1/70.

5. Патент Китая №1286403 «Process for preparing reagent kit to detect 4 pathogen antibodies», G 01 N 33/53.

6. Патент Китая №1340712 «Reagent kit for ELISA of rubella, macrocell and monosper mouse viruses and Toxoplasma antibody», G 01 N 33/569.

7. www.biograd.ru: www.orgenics.com

8. Патент США №5486452 "Devices and kits for immunological analysis", G 01 N 033/548.

9. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. школа, 1991. - 360 с.

10. Raska I. Electron microscopic immunocytoshemistry with colloidal gold. - Laboratory manual of the practical course organized by the Institute of Experimental Medicine, Czechoslovak Academy of Sciences in collaboration with the Czechoslovak Biochemical Society of the Czechoslovak Academy of Sciences, Prague, May 29th - Jine 3rd,1988.

11. Полтавченко А.Г., Тузиков Ф.В., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Получение серебряных золей - маркеров для иммуноанализа. - Сибирь-Восток, 2002, №4 (52), с.18-20.

12. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Проявление золей серебра в микротитровальных планшетах Сибирь-Восток, 2002, №9 (57), с.7-9.

Claims (8)

1. Набор для многопрофильного иммунологического анализа антител, включающий плоскую плотную подложку с нанесенными на ее поверхности антигенами, дополнительно блокированную неспецифическими природными или синтетическими полимерами; растворы для отмывок, разведения образца и конъюгата, конъюгат и систему проявления, отличающийся тем, что плотная подложка выполнена из непористого пластика, на поверхности которого нанесены антигены возбудителей TORCH-инфекций, в качестве конъюгата используют антитела к иммуноглобулинам человека или стафилококковые белки А или G, связанные с каталитически активными солями золота или серебра, в качестве раствора для отмывок и разведения конъюгата используют раствор, содержащий 0,01 моль/л трис HCl с 0,17 моль/л NaCl и 0,1% твин-20, рН 7,2-7,4, а в качестве системы проявления используют «физические проявители», включающие в себя соли серебра и восстанавливающие агенты.

2. Набор по п.1, отличающийся тем, что плотная подложка выполнена из белого полистирола.

3. Набор по п.1, отличающийся тем, что раствор для разведения конъюгата дополнительно содержит 5% лизат клеток Е.coli, рН 7,2-7,4.

4. Набор по п.1, отличающийся тем, что для разведения сывороток используют раствор, содержащий 0,01 моль/л трис HCl с 0,17 моль/л NaCl и 0,1% твин-20, 5% лизат клеток Е.coli, доведенный 0,1 моль/л раствором NaOH до рН 9,5-9,7.

5. Набор по п.1, отличающийся тем, что набор антигенов на устройстве включает специфические белки Toxoplasma gondii, Chlamidia trachomatis, Rubella virus, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealytica, Treponema pallidum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus-1.

6. Набор по п.1-3, отличающийся тем, что иммобилизованные на подложке антигены представлены рекомбинантными белками, или природными белками, или комбинацией рекомбинантных и природных белков.

7. Набор по п.1, отличающийся тем, что кроме антигенов на подложку нанесены иммуноглобулины G человека (положительный контроль) в качестве контроля качества конъюгата.

8. Набор по п.1, отличающийся тем, что нанесение антигенов и контроля на подложку осуществлено в виде растворов с концентрацией белка от 5 до 25 мкг/мл (предпочтительно 10 мкг/мл) аликвотами по 1-3 мкл.