CN104181303A - 一种精密度好线性相关性强的肌钙蛋白检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种精密度好线性相关性强的肌钙蛋白检测试剂盒，包括体积比为3:1的试剂R1和试剂R2，其组分分别为：试剂R1由PIPES(哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸))缓冲液、聚乙二醇、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠试剂、乙醇胺组成；试剂R2由PIPES缓冲液、结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球颗粒、吐温-20、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白组成；本发明提供的检测试剂盒灵敏度和线性相关性要优于现有的检测试剂盒。

Description

一种精密度好线性相关性强的肌钙蛋白检测试剂盒
技术领域
 本发明涉及一种精密度好线性相关性强的肌钙蛋白检测试剂盒，属体外诊断技术领域。
背景技术
肌钙蛋白是调节横纹肌和心肌收缩相关的结构蛋白。肌钙蛋白由肌钙蛋白T(TnT）、肌钙蛋白I(TnI）及肌钙蛋白C(TnC）三种亚单位所组成。其中，TnI是肌原纤维AFP酶的抑制性亚单位，分子量18kD。肌钙蛋白I包绕着TnC的中央螺旋，成为Ca2+结合位点的组成部分。三种亚单位组合与原肌球蛋白一起构成复合体，调节肌细胞的收缩力和速度。心肌钙蛋白I(cardiactroponinI，CTnI)是惟一的不同于骨骼肌中发现的肌钙蛋白I。心肌钙蛋白I在N端具有一个附加的31个氨基酸顺序，使CTnI具有心肌的特异性，因而被广泛地研究作为心肌损伤的敏感的和特异的血清标志物。 
急性心肌梗死病人CTn动态变化曲线和CK-MB很相近，急性心肌梗死后4～8h在血清中高于决定值，出现晚于肌红蛋白，但其升高持续时间（窗口期）长，CTn一旦升高往往持续4～10d,甚至可达3周。和CK-MB比较，正常人血清中几乎测不到CTn，因而它对急性心肌梗死有较高的分辨能力。CTn是心肌特有的，具有在血中出现时间早、敏感度高、特异性强和诊断窗口期长等特点，是诊断急性心肌梗死的理想指标。 此外，CTnT还可用于评估溶栓疗法的成功与否，观察冠状动脉是否复通，研究表明，用CTnT评估复通90min时优于CK-MB和肌红蛋白，如果结合其他诊断AMI指标，如12导联心电图的S-T段变化，效果更好。 
目前已知的测定肌钙蛋白的方法有电化学发光免疫检测法（ECLIA）、酶联免疫法吸收法、酶联荧光分析法（ELFA），但由于具有操作繁琐、耗时长、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验。目前比较常用的是胶体金免疫层析法，但此方法敏感性不好，重复性不好，只能用于定性检测，对于临床病人的疗效观察有局限性。胶乳颗粒增强比浊法是目前较准确，稳定的检测方法。其原理是当交联有抗体的微球与抗原反应凝集时，改变反应液的透光性能，但也存在着灵敏度不高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳胶包被的肌钙蛋白检测试剂盒。该试剂盒应用于全自动生化分析仪上，结果准确性强，灵敏度较高便于大规模推广。
为实现上述目的，本发明提供的试剂盒包括体积比为3:1的试剂R1和试剂R2，其组分分别为 ：
试剂 R1 ：
PIPES(哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸))缓冲液
聚乙二醇       200-220mmol/L
叠氮钠          5-10 mmol/L
乙二胺四乙酸钠试剂      1-5 mmol/L
乙醇胺      2-3 mmol/L；
试剂R2 ：
PIPES缓冲液
结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球颗粒   200-220mmol/L
吐温-20                             5%
叠氮钠                             1-5mmol/
乙二胺四乙酸钠                   0.5-3 mmol/L
牛血清白蛋白                   1-5mmol/L。
本试剂盒的制备方法及操作步骤如下：
（a）     按下列比例配制好试剂
试剂R1：PIPES缓冲液、200-220mmol/L聚乙二醇、5-10 mmol/L叠氮钠、1-5 mmol/L乙二胺四乙酸钠、2-3 mmol/L乙醇胺；
试剂R2：PIPES缓冲液 ，200-220mmol/L结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球 5%（v/v）吐温-20、1-5mmol/L叠氮钠、0.5-3 mmol/L乙二胺四乙酸钠、1-5mmol/L牛血清白蛋白 。
（b）将R1、R2试剂与待测样本按一定比例混合；
（c）用全自动生化分析仪500nm条件下测定吸光度的变化 ；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中肌钙蛋白的浓度。
其中，所述结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球颗粒采用如下制备方法制备而成：配制PH值为5.0和6.8的50mM 的MES缓冲溶液、150mg/mlNHS、50mg/ml EDAC，其中，PH值为5.0的50mM MES缓冲液：150nm10%的微球：NHS： EDAC为70:10:15:5，40℃恒温振荡器上活化40min，15000rps离心15min，去掉上清液，收集离心沉淀。加入PH值为6.8的MES，使用水浴超声仪超声2min，离心，洗涤3次后，加入肌钙蛋白抗体200ul，在振荡器上偶联1.5h，离心洗涤加入10%的封闭液1000rpm摇床上封闭过夜。
全自动生化仪参数设置
(a) 检测温度 ：37℃
(b) 检测波长 ：主波长为 500nm ；副波长设为 0 ；
(c) 反应时间 ：10分钟。其中，孵育时间 3 分钟，反应时间 100 秒，检测时间 200 秒。
3. 检测步骤
1.样品（检测的样品包括蒸馏水、标准品和临床样本）加试剂1混匀，37℃孵育5 min后读取吸光度A0，立即加入试剂2混匀，37℃反应 5 min 后，在 500nm 条件下检测，读取吸光度 A1，ΔA ＝ A1-A0。其中样本用量6 μl，试剂1用量 225 μl，试剂2用量 75 μl。
 通过读取的吸光度值计算出肌钙蛋白的浓度。
本发明提供的检测试剂盒，灵敏度高，相关性好。
附图说明
图1为本发明线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
试剂 R1 ：
PIPES(哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸))缓冲液
聚乙二醇       200mmol/L
叠氮钠         8 mmol/L
乙二胺四乙酸钠试剂     4 mmol/L
乙醇胺    2 mmol/L  ；
试剂R2 ：
PIPES缓冲液
结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球颗粒   200mmol/L
吐温-20                             5%
叠氮钠                             3mmol/
乙二胺四乙酸钠                  2 mmol/L
牛血清白蛋白                  3mmol/L。
采用全自动生化分析仪500nm条件下测定吸光度的变化：
全自动生化仪参数设置：
(a) 检测温度 ：37℃
(b) 检测波长 ：主波长为 500nm ；副波长设为 0 ；
(c) 反应时间 ：10分钟。其中，孵育时间 3 分钟，反应时间 100 秒，检测时间 200 秒。
检测步骤
样品（检测的样品包括蒸馏水、标准品和临床样本）加试剂1混匀，37℃孵育5 min后读取吸光度A0，立即加入试剂2混匀，37℃反应 5 min 后，在 500nm 条件下检测，读取吸光度 A1，ΔA ＝ A1-A0。其中样本用量6 μl，试剂1用量 225 μl，试剂2用量 75 μl。
 通过读取的吸光度值计算出肌钙蛋白的浓度。
实验结果及分析
1、重复性实验 以产品标准要求选择浓度为4.86ug /mL的定值样本作为实验样本, 用胶乳增强免疫透射比浊法先对此样本重复测定20次, 计算出均值、标准差和变异系数等相关数据见表1，为本发明试剂检测结果；表2为对照试剂（北京九强生物技术有限公司提供）检测结果.经两表的对照显示，本发明试剂的重复性优于市场上的对比试剂。
 
表1 本试剂重复性数据
表2  对照试剂重复性数据
2 准确度试验
取质控品5.46ug/mL作为检测样本进行检测，测定三次，取平均值，计算相对偏差。见表3。本发明试剂准确度偏差为0.12%，对照试剂（北京九强生物技术有限公司提供）为1.83%。
 
                     表3 准确度检测结果
试剂 1 2 3 准确度偏差
本试剂 5.44 5.49 5.47 0.12%
对照试剂 5.26 5.39 5.43 1.83%
2.线性实验
以17.7ug /mL的标准液做为已知样本,按1/2,1/4,1/8,1/16进行倍比稀释得到系列浓度的样本, 用胶乳增强免疫透射比浊法对每例样本作3次重复测定, 计算平均值记录结果, 根据配制关系可以计算出6例样本的TNI浓度,作为这些样本的预期值, 以预期值为横坐标, 实测平均值为纵坐标, 行直线回归分析, 观察其线性范围, 结果显示,浓度在1.1mg /L-17.7mg /mL范围内线性良好, 相关方程为y=0.9442x+0.5070, 见图1。
本发明具有的优点 ：
本发明通过在试剂1中加入乙醇胺作为稳定剂，可以加速正常抗原抗体结合的效率，在一定时间内，完全与正常白蛋白结合，保证了试剂检测样本结果的准确性及重复度。
本发明试剂2微球与抗体的偶联条件有效优化，大大提高偶联效率。线性相关系数R=0.9987，保证临床样本线性区间。使用方便、便于大规模推广。所需检测仪器（生化分析仪）在各大医院和检测中心普遍使用，使试剂尽快达到反应重点，保证了试剂的高效检测效果，显著提高了试剂的市场空间。 
实施例2
试剂 R1 ：
PIPES(哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸))缓冲液
聚乙二醇      220mmol/L
叠氮钠       10 mmol/L
乙二胺四乙酸钠试剂     5mmol/L
乙醇胺     2 mmol/L
试剂R2 ：
PIPES缓冲液
结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球颗粒  220mmol/L
吐温-20                             5%
叠氮钠                           5mmol/
乙二胺四乙酸钠                 3 mmol/L
牛血清白蛋白                  5mmol/L。
R1与R2的体积比为3:1；测定方法同上。
实施例3
试剂 R1 ：
PIPES(哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸))缓冲液
聚乙二醇     200mmol/L
叠氮钠        5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠试剂    1 mmol/L
乙醇胺    2 mmol/L
试剂R2 ：
PIPES缓冲液
结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球颗粒   200mmol/L
吐温-20                             5%
叠氮钠                            1mmol/
乙二胺四乙酸钠                0.5 mmol/L
牛血清白蛋白                  1mmol/L。
R1与R2的体积比为3:1；测定方法同上。

Claims (1)

1.一种精密度好线性相关性强的肌钙蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括体积比为3:1的试剂R1和试剂R2，其组分分别为 ：
试剂 R1 ：
PIPES(哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸))缓冲液
聚乙二醇       200-220mmol/L
叠氮钠          5-10 mmol/L
乙二胺四乙酸钠试剂      1-5 mmol/L
乙醇胺      2-3 mmol/L
试剂R2 ：
PIPES缓冲液
结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球颗粒   200-220mmol/L
吐温-20                             5%
叠氮钠                             1-5mmol/
乙二胺四乙酸钠                   0.5-3 mmol/L
牛血清白蛋白                   1-5mmol/L；
所述结合有肌钙蛋白单克隆抗体的微球颗粒采用如下制备方法制备而成：
配制PH值为5.0和6.8的50mM 的MES缓冲溶液、150mg/mlNHS、50mg/ml EDAC，其中，PH值为5.0的50mM MES缓冲液：150nm10%的微球：NHS： EDAC为70:10:15:5，40℃恒温振荡器上活化40min，15000rps离心15min，去掉上清液，收集离心沉淀；加入PH值为6.8的MES，使用水浴超声仪超声2min，离心，洗涤3次后，加入肌钙蛋白抗体200ul，在振荡器上偶联1.5h，离心洗涤加入10%的封闭液1000rpm摇床上封闭过夜。
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