CN1632578A - 胆汁酸测定试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胆汁酸测定试剂。本发明的测定试剂包括试剂1和试剂2两个组成部分，在本发明的试剂中添加了丙酮酸钠和亚铁氰化钾等试剂，提高了试剂的稳定性和灵敏度，并增加了试剂对甘氨酸的亲和能力。
Description
技术领域：
本发明涉及生物诊断试剂，具体涉及一种胆汁酸测定试剂。
背景技术：
1974年挪威科明公司采用纯制的3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)成功地生产出第一代酶法胆汁酸试剂，使胆汁酸的测定真正进入到临床领域。总胆汁酸测定方法较快，到目前为止已经发展到第五代。
肝细胞损伤、肝流血量减少，和肝内外门脉分流等，皆影响肝脏对胆汁酸的清除作用，从而使周围中胆汁酸盐含量增加：胆管梗阻和胆汁淤滞时，胆汁酸盐反流入血，使胆汁酸盐浓度显著升高。隐私，检查血、尿中胆汁酸盐能反映肝脏德摄取，合成及排泄功能。很多证据表明，胆汁酸的生成和代谢与肝脏有十分密切的关系，血清胆汁酸水平是反映肝实际损伤的一个重要指标。
胆酸是在肝脏从胆固醇生成的24-碳类固醇化合物。在体液中被发现的以下四个胆酸形式占99％以上，四种胆酸形式分别为脱氧胆酸、石胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨胆酸，其中甘氨胆酸又是胆酸主要的存在形式。检测甘氨胆酸又具有十分重要的临床意义，如：肝细胞损伤程度，急性肝炎的病情观察，判断肝硬化等(详见张宋英、候振江、王英文“甘氨胆酸诊断肝病的价值”《新消化病学杂志》1996.4(7)：395-396)已有详细报道。
目前，临床上应用的是第五代酶法测定胆汁酸试剂，该第五代酶法测定与原有的方法相比具有灵敏度高、对分析仪器污染弱等特点，但其试剂的稳定性较差，测临床低值样本不够准确等，同时对血清中甘氨胆酸的反应也不够灵敏。因而，在应用上存在一定局限.
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计一种新的胆汁酸测定试剂，提高检测中的灵敏度和试剂稳定性。
本发明提供了一种胆汁酸测定试剂，该试剂包括两个试剂组份：
试剂1：
甘氨酸 1.5g/L～3.75g/L
Thio-NAD 0.95g/L
NaN3 1g/L
Triton X-100 1ml/L
丙酮酸钠 0.1g/L～150g/L
亚铁氰化钾 0.1g/L～100g/L
试剂2：
二乙醇胺 6.0g/L～16.2g/L
苯或烷基二醇 10ml/L～100ml/L
硼氢化物 0.8g/L～10g/L
3αHSD 12.5ku/L
NaN3 1g/L
TritoNX-100 1ml/L
α-糊精 5g/L～20g/L
NADH 6g/L
本发明提供的胆汁酸测定试剂是发明人通过改进试剂组份而实现了克服已有技术存在的缺陷。本发明人为提高试剂对甘氨酸的亲和能力，在试剂1的组份中，添加了丙酮酸钠和亚铁氰化钾；为提高试剂的稳定性，在试剂2的组份中，添加了硼氢化物和烷基或苯基二醇作为稳定剂，保护NADH的稳定；为提高试剂对测低值标本的准确性，同时在试剂2的组份中，增加了α-糊精，有效地提高了试剂对样本反应的灵敏度。
上述添加试剂的浓度范围为：
烷基二醇或苯二醇：0.01％-10％
硼氢化物：0.01％-25％
丙酮酸钠：0.01％-15％
亚铁氰化钾：0.01％-10％
α-糊精：0.01％-10％
本发明人对本发明试剂的灵敏度、稳定性和对甘氨胆酸的亲和能力分别进行了检测，其结果如下：
一、提高试剂的灵敏度
配制试剂1含有：甘氨酸1.5g/L，Thio-NAD 0.95g/L，NaN3 1g/L，TritonX-100 1ml/L，丙酮酸钠10g/L，亚铁氰化钾10g/L
配制试剂2含有：二乙醇胺16.2g/L，苯二醇10ml/L，硼氢化钠10g/L，3αHSD 12.5ku/L，NaN3 1g/L，Triton X-100 1ml/L，NADH 6.0g/L
| 加入物 | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
| 试剂A | 270ul | 270ul | 270ul |
| 蒸馏水 | 4ul |
| 标准液 | 4ul | ||
| 标本 | 4ul | ||
| 混合，置37℃预孵育3至5分钟 | |||
| 试剂B | 90ul | 90ul | 90ul |
| 混匀，置37℃孵育1分钟，在主波长405nm，副波长660nm处连续监测各管2-3分钟，计算ΔA/min变化 | |||
胆汁酸浓度(umol/L)＝ΔA样本管/ΔA标准管*标准浓度
按图1测50μmol/l样本，测得ΔA＝0.0500A/min
在试剂2中添加α-糊精(分子量5000)18g/l后，按图1测50μmol/l样本，
测得ΔA＝0.2000A/min
灵敏度提高了300％，这样对测低值样本时更具有准确性。
结果表明在试剂中添加α-糊精能有效提高试剂对样本反应的灵敏度。
二、检测试剂的稳定性
配制试剂：二乙醇胺16.2g/L，3αHSD 12.5ku/L，NaN3 1g/L，Triton X-1001ml/L，α-糊精(分子量5000)18g/L，NADH 6.0g得A溶液
在405nm处检测溶液A的吸光度，得下列结果
| 时间 | 0个月 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 12个月 |
| 试剂的吸光度 | 0.92A | 0.74A | 0.51A | 0.24A | 0.11A |
在A溶液基础上添加苯二醇10ml/L和硼氢化钠10gL后，在405nm处检
测试剂A的吸光度，得下列结果
| 时间 | 0个月 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 12个月 |
| 试剂得吸光度 | 0.992A | 0.990A | 0.987A | 0.984A | 0.976A |
试剂稳定效果明显
结果显示在试剂中添加了苯二醇和硼氢化钠，使试剂稳定性明显得到了提高。
三、试剂对甘氨胆酸的亲和能力的检测
配制试剂1：甘氨酸15g/L，Thio-NAD 0.95g/L，NaN3 1g/L，TritoN X-1001ml/L
配制试剂2：二乙醇胺16.2g/L，苯二醇10ml/L，硼氢化钠10g/L，3αHSD12.5ku/L，NaN3 1g/L，TritoN X-100 1ml/L，NADH 6.0g/L
按图1分别检测40μmol/l的脱氧胆酸，石胆酸，鹅去氧胆酸，甘氨胆酸的样本，得下列结果
| 底物 | Km of AHS |
| 脱氧胆酸 | 0.02377 |
| 石胆酸 | 0.01179 |
| 鹅去氧胆酸 | 0.05979 |
| 甘氨胆酸 | 0.03121 |
在试剂1中添加入亚铁氰化钾10g/L和丙酮酸钠10g/L后，依上法分别检测40μmol/l的脱氧胆酸，石胆酸，鹅去氧胆酸，甘氨胆酸的样本，得下列结果
| 底物 | Km of AHS |
| 脱氧胆酸 | 0.02411 |
| 石胆酸 | 0.01214 |
| 鹅去氧胆酸 | 0.06002 |
| 甘氨胆酸 | 0.07543 |
通过实验表示，在试剂1中添加亚铁氰化钾和丙酮酸钠，能使试剂对甘氨胆酸的结合能力得到明显提高。
本发明所述的试剂中，硼氢化物可以为硼氢化钠或硼氢化钾；烷基或苯基二醇可以为乙二醇、丙二醇、丁二醇或苯二醇；α-糊精的分子量为1000～2000。
本发明试剂与酶循环法测定试剂同时对30例临床样本进行了检测，说明本发明的试剂是符合临床检测要求，与日本产品相符。
本发明提供的胆汁酸测定试剂具有稳定性好，灵敏度高的优点，并增加了试剂对甘氨胆酸的亲和能力强，因此，在临床上有较好的应用前景。
附图说明：
图1本发明试剂与日本第一化学株式会社制的试剂对30例临床样本检测应。其中X：横座标 表示日本试剂
Y：纵座标 表示本发明试剂
回归方程：Y＝1.001X+0.680；
相关系数r＝0.998
具体实施方式：
实例
例1：
试剂1
甘氨酸 1.5g/L
Thio-NAD 0.95g/L
NaN3 1g/L
Triton X-100 1ml/L
丙酮酸钠 10g/L
亚铁氰化钾 10g/L
试剂2
二乙醇胺 16.2g/L
苯二醇 10ml/L
硼氢化钠 10g/L
3αHSD 12.5ku/L
NaN3 1g/L
Triton X-100 1ml/L
α-糊精(分子量5000) 18g/L
NADH 6.0g/L
例2：
试剂1
甘氨酸 3.75g/L
Thio-NAD 0.95g/L
NaN3 1g/L
Triton X-100 1ml/L
丙酮酸钠 5.7g/L
亚铁氰化钾 105g/L
试剂2
二乙醇胺 6g/L
乙二醇 10ml/L
硼氢化钾 5g/L
3αHSD 12.5ku/L
NaN3 1g/L
吐温20 0.5g/L
α-糊精(分子量3000) 20g/L
NADH 6.0g/L
例3：
试剂1
甘氨酸 1.5g/L
Thio-NAD 0.95g/L
NaN3 1g/L
Triton X-100 1ml/L
丙酮酸钠 1g/L
亚铁氰化钾 1g/L
试剂2
二乙醇胺 16.2g/L
丙二醇 50ml/L
硼氢化钠 1g/L
3αHSD 12.5ku/L
NaN3 1g/L
Triton X-100 1ml/L
α-糊精(分子量20000) 18g/L
NADH 6.0g/L
例4：
试剂1
甘氨酸 3.75g/L
Thio-NSD 0.95g/L
NaN3 1g/L
Triton X-100 1ml/L
丙酮酸钠 60g/L
亚铁氰化钾 15g/L
Nacl 1g/L
试剂2
二乙醇胺 6.0g/L
丁二醇 100ml/l
硼氢化钾 0.8g/L
3αHSD 12.5ku/L
NaN3 1g/L
吐温20 0.5g/L
α-糊精(分子量1000) 5g/L
NADH 6.0g/L
Claims (3)
1、一种胆汁酸测定试剂，其特征在于该试剂包括下列两个试剂组份：
试剂1：
甘氨酸 1.5g/L～3.75g/L
Thio-NAD 0.95g/L
NaN3 1g/L
Triton X-100 1ml/L
丙酮酸钠 0.1g/L～150g/L
亚铁氰化钾 0.1g/L～100g/L
试剂2：
二乙醇胺 6.0g/L～16.2g/L
苯基或烷基二醇 10ml/L～100ml/L
硼氢化物 0.8g/L～10g/L
3αHSD 12.5ku/L
TritoNX-100 1ml/L
α-糊精 5g/L～20
NADH 6g/L
2、根据权利要求1所述的一种胆汁酸测定试剂，其特征在于其中所述试剂2中的硼氢化物为硼氢化钠或硼氢化钾；烷基或苯基二醇为乙二醇、丙二醇、丁二醇或苯二醇；α-糊精的分子量为1000～20000。
3、根据权利要求1所述的一种胆汁酸测定试剂，其特征在于所述下列组份在试剂中的添加范围为烷基或苯二醇为0.01％～10％；硼氢化物为0.01％～25％；丙酮酸钠为0.01％～15％；亚铁氰化钾为0.01％～10％；α-糊精为0.01％～10％。
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| CN106565809A (zh) * | 2016-07-08 | 2017-04-19 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种β半乳糖苷酶的酶供体偶联物及其在甘胆酸检测中的用途 |
| CN107703288A (zh) * | 2017-06-27 | 2018-02-16 | 廊坊恒益生物技术有限公司 | 提高反应稳定性的胆汁酸检测试剂 |
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2004
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