CN112126674B - 一种尿素检测试剂盒、其制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种尿素检测试剂盒、其制备方法和使用方法,所述试剂盒包括R1试剂和R2试剂,其中,R1试剂包括Tris缓冲液、二磷酸腺苷、尿素酶和谷氨酸脱氢酶,R2试剂包括Tris缓冲液、还原型辅酶Ⅰ和α‑酮戊二酸。本发明提供的试剂盒成分简单,采用酶法中的酶偶联速率法,保持了灵敏度更高,线性范围宽,成本低、抗干扰能力强、准确度高的优点,而且可普遍用于全自动化及半自动化分析仪。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂领域,具体涉及一种尿素检测试剂盒、其制备方法和使用方法。
背景技术
尿素是机体蛋白质代谢的主要终末产物,分子量小且不与血浆蛋白结合,可自由滤过肾小球。进入原尿中的尿素约50%被肾小管和集合管重吸收,肾小管有少量排泄。肾实质受损时,肾小球滤过率下降,血尿素浓度会升高,通过测定血尿素或血尿素氮浓度可以观察肾小球滤过功能。
目前血尿素的测定方法大体上可归纳为酶学方法和化学方法,酶学方法为简介测定法,先用尿素酶将尿素分解成铵离子和碳酸根,然后用Berthelot反应或谷氨酸脱氢酶法。测定反应过程中铵离子的生成量,化学方法为直接测定法,二乙酰一肟的乙酰基直接与尿素缩合反应,生成色原二嗪。酶学方法不需要昂贵的设备,可以实现自动化,且可测定大量标本,但目前用于该方法的检测试剂成分复杂,导致生产成本较高、工艺复杂。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的尿素检测试剂盒成分复杂,不利于工业生产的缺陷,从而提供一种尿素检测试剂盒。
本发明还提供一种尿素检测试剂盒的制备方法和使用方法。
为此,本发明提供一种尿素检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其中,R1试剂包括Tris缓冲液、二磷酸腺苷、尿素酶和谷氨酸脱氢酶,R2试剂包括Tris缓冲液、还原型辅酶Ⅰ和α-酮戊二酸。
产品性能原理:
尿素在尿素酶催化下,水解生成NH4 +和二氧化碳。NH4 +在α-酮戊二酸和还原型辅酶Ⅰ(NADH)存在下,经谷氨酸脱氢酶(GLDH)催化,生成谷氨酸,同时,NADH被氧化成NAD+,NAD+的生成引起340nm波长处吸光度下降,下降速率与样品中尿素的含量呈正比。
进一步地,R1试剂组成为:Tris缓冲液100-140mmol/L,二磷酸腺苷1.2-1.8mmol/L,尿素酶20-60KU/L和谷氨酸脱氢酶0.2-0.6KU/L,R2试剂组成为Tris缓冲液100-140mmol/L,还原型辅酶Ⅰ800-1200U/L和α-酮戊二酸20-28mmol/L。
进一步地,R1试剂组成为:Tris缓冲液120mmol/L,二磷酸腺苷1.5mmol/L,尿素酶40KU/L和谷氨酸脱氢酶0.4KU/L,R2试剂组成为Tris缓冲液120mmol/L,还原型辅酶Ⅰ1000U/L和α-酮戊二酸24mmol/L。
进一步地,Tris缓冲液的制备方法为将Tris溶于纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至8.0±0.2,0.105MPa╱cm2高压处理30分钟。
本发明还提供一种尿素检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
将二磷酸腺苷、尿素酶和谷氨酸脱氢酶加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R1试剂;
将还原型辅酶Ⅰ、α-酮戊二酸加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R2试剂;
将R1试剂和R2试剂按照体积比为3:1组成试剂盒。
本发明还提供一种尿素检测试剂盒的使用方法,包括:
将血清样本加入到试剂R1,37℃下孵育2-5分钟,然后再加入试剂R2,37℃下孵育2-3分钟,连续监测3分钟的吸光度变化率,与尿素标准品中的尿素含量与吸光度关系曲线进行比较,得到样本的尿素含量。
进一步地,R1试剂和R2试剂的体积比3:1。
本发明技术方案,具有如下优点:
1、本发明提供的试剂盒成分简单,采用酶法中的酶偶联速率法,保持了灵敏度更高,线性范围宽,成本低、抗干扰能力强、准确度高的优点,而且可普遍用于全自动化及半自动化分析仪。
2、本试剂盒使用的原料主要是普通化学试剂,没有易燃、易爆、有毒、有害物品,并且没有污染,对人体及周围环境没有任何危害,其中的生物制品均经过纯化和灭活处理,不含有任何传染性和致病性成分,加之本产品不直接用于人体,因此在产品运输、使用过程中对使用者和环境没有安全隐患。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例中6种不同浓度的尿素样本的线性分析图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
一种尿素检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其中,
R1试剂包含:
按上述配比准备原料,将三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于1L纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至7.8,0.105MPa╱cm2高压处理30分钟,得到Tris缓冲液;
将二磷酸腺苷、尿素酶和谷氨酸脱氢酶加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R1试剂。
R2试剂包含:
Tris缓冲液 100mmol/L;
还原型辅酶Ⅰ 800U/L;
α-酮戊二酸 28mmol/L;
按上述配比准备原料,将三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于1L纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至7.8,0.105MPa╱cm2高压处理30分钟,得到Tris缓冲液;
将还原型辅酶Ⅰ、α-酮戊二酸加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R2试剂。
分别取R1试剂和R2试剂按照体积比为3:1组成试剂盒。
实施例2
一种尿素检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其中,
R1试剂包含:
按上述配比准备原料,将三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于1L纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至8,0.105MPa╱cm2高压处理30分钟,得到Tris缓冲液;
将二磷酸腺苷、尿素酶和谷氨酸脱氢酶加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R1试剂。
R2试剂包含:
Tris缓冲液 120mmol/L;
还原型辅酶Ⅰ 1000U/L;
α-酮戊二酸 24mmol/L;
按上述配比准备原料,将三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于1L纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至8,0.105MPa╱cm2高压处理30分钟,得到Tris缓冲液;
将还原型辅酶Ⅰ、α-酮戊二酸加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R2试剂。
分别取R1试剂和R2试剂按照体积比为3:1组成试剂盒。
实施例3
一种尿素检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其中,
R1试剂包含:
按上述配比准备原料,将三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于1L纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至8.2,0.105MPa╱cm2高压处理30分钟,得到Tris缓冲液;
将二磷酸腺苷、尿素酶和谷氨酸脱氢酶加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R1试剂。
R2试剂包含:
Tris缓冲液 140mmol/L;
还原型辅酶Ⅰ 1200U/L;
α-酮戊二酸 20mmol/L;
按上述配比准备原料,将三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于1L纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至8.2,0.105MPa╱cm2高压处理30分钟,得到Tris缓冲液;
将还原型辅酶Ⅰ、α-酮戊二酸加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R2试剂。
分别取R1试剂和R2试剂按照体积比为3:1组成试剂盒。
实施例4
一种尿素检测试剂盒的使用方法。
使用迈瑞BS-800全自动生化分析仪,利用两点终点法进行测定,检测主波长为340nm。
取R1试剂180μl加入到样品管中,然后加入尿素样本3μl,在37℃下孵育5分钟后加入R2试剂60μl,37℃下继续孵育2分钟,连续观测3分钟的吸光度变化,计算△A样本/min。
用同样的方法测定尿素标准品的吸光度变化率△A标准/min,利用公式:尿素含量(mmol/L)=(△A样本/min÷△A标准/min)×C标准计算尿素样本中的尿素含量。
具体操作方法如表1所示。
表1
实验例
以实施例2的试剂做以下测试:
试剂空白吸光度、吸光率:以纯化水为检测样本,按实施例4所述方法检测其吸光度,重复两次,空白吸光度均大于1,吸光度变化率为0.03/min和0.02/min。
线性测试:
取尿素含量为35.7mmol/L的样本,用生理盐水进行系列稀释,配制6个不同浓度的样本,浓度依次为35.7mmol/L、23.8mmol/L、17.9mmol/L、10mmol/L、5mmol/L、0.9mmol/L,每个浓度的样本分别测定三次,取平均值,检测结果如图1和表2所示。
表2
理论浓度(mmol/L) | 35.7 | 23.8 | 17.9 | 10 | 5 | 0.9 |
测试浓度(mmol/L) | 34.8 | 24.1 | 18.3 | 9.4 | 5.2 | 0.8 |
经计算,相关系数r为0.999,Y=0.985x+0.107。
准确度测试:
对尿素含量为50umol/L的样本进行测定,重复测定三次,测定结果分别为:50.6umol/L、49.2umol/L和50.7umol/L,均值为:50.17mg/L,相对偏差为0.34%。
灵敏度测试:
对尿素含量为10umol/L的样本进行测定,重复测定三次,吸光度变化率(减去试剂空白吸光度变化率)△A/min分别为0.4、0.4和0.5,灵敏度较高。
批内精密度测试:
用同一批次的试剂盒分别测定低值样本(尿素含量为50umol/L)和高值样本(尿素含量为35mmol/L),重复进行10次测定,对所得的结果进行标准差SD和变异系数CV计算,结果如表3所示。
表3
批间精密度:
用三个批号的试剂盒检测同一样本(尿素含量为35mmol/L),重复进行10次测定,对所得的结果进行标准差SD和变异系数CV计算,结果如表4所示。
表4
经计算,均值为35.11mmol/L,标准差SD为0.45,变异系数CV为1.28%。
稳定性:
长期稳定性:将连续三批次的试剂盒在2-8℃的条件下放置14个月,分别在0个月、3个月、6个月、9个月、12个月和14个月时对同一样本进行测试(尿素含量为35mmol/L),每个样本测试5次,取平均值,测试结果如表5所示。
表5
开瓶稳定性:将连续三批次的试剂盒开瓶后在2-8℃的条件下放置35天,然后对同一样本进行测试(尿素含量为35mmol/L),每个样本测试5次,取平均值,测试结果分别为:35.4mmol/L、34.8mmol/L和35.2mmol/L。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种尿素检测试剂盒,其特征在于,包括R1试剂和R2试剂,其中,R1试剂包括Tris缓冲液、二磷酸腺苷、尿素酶和谷氨酸脱氢酶,R2试剂包括Tris缓冲液、还原型辅酶Ⅰ和α-酮戊二酸;
R1试剂组成为:Tris缓冲液100-140mmol/L,二磷酸腺苷1.2-1.8mmol/L,尿素酶20-60KU/L和谷氨酸脱氢酶0.2-0.6KU/L,R2试剂组成为Tris缓冲液100-140mmol/L,还原型辅酶Ⅰ800-1200U/L和α-酮戊二酸20-28mmol/L。
2.根据权利要求1所述的尿素检测试剂盒,其特征在于,R1试剂组成为:Tris缓冲液120mmol/L,二磷酸腺苷1.5mmol/L,尿素酶40KU/L和谷氨酸脱氢酶0.4KU/L,R2试剂组成为Tris缓冲液120mmol/L,还原型辅酶Ⅰ1000U/L和α-酮戊二酸24mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的尿素检测试剂盒,其特征在于,Tris缓冲液的制备方法为将Tris溶于纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至8.0±0.2,0.105MPa╱cm2高压处理30分钟。
4.权利要求1-3中任一项所述的尿素检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将二磷酸腺苷、尿素酶和谷氨酸脱氢酶加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R1试剂;
将还原型辅酶Ⅰ、α-酮戊二酸加入到Tris缓冲液中,混匀,得到R2试剂;
将R1试剂和R2试剂按照体积比为3:1组成试剂盒。
5.权利要求1-3中任一项所述的尿素检测试剂盒或权利要求4所述的制备方法制备的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括:
将尿素样本加入到R1试剂中,37℃下孵育2-5分钟,然后再加入R2试剂,37℃下孵育2-3分钟,连续监测3分钟的吸光度变化率△A样本/min,用同样的方法测定尿素标准品的吸光度变化率△A标准/min,利用公式:尿素含量=(△A样本/min÷△A标准/min)×C标准计算尿素样本中的尿素含量。
6.根据权利要求5所述的尿素检测试剂盒的使用方法,其特征在于,R1试剂和R2试剂的体积比3:1。
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