CN107064483A - 一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，步骤一、在待检测的血清中取出两份相同的样品；步骤二、将试剂a和试剂b分别加入到两份样品中，并于相同条件下处理；试剂a是可以与尿素反应的试剂；试剂b是可以与尿素和肌酐反应的试剂；步骤三、依据试剂a与样品反应的结果，获得样品中尿素氮的含量；步骤四、依据试剂b与样品反应的结果，获得尿素氮和肌酐的总含量，减去步骤三获得的尿素氮含量，得到样品中肌酐的含量。本发明检测步骤紧凑、合理，检测结果准确可靠，检测效率高。

Description

一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法
技术领域
本发明属于血液检测领域，涉及一种血清中尿素氮和肌酐的测定方法，尤其涉及一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法。
背景技术
尿素是人体蛋白质代谢的主要终末产物，肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，尿素和肌酐均主要由肾小球滤过排出体外，故可用作肾小球滤过功能的诊断和过筛指标，当肾小球滤过功能减低时，血肌酐和尿素氮因滞留而增高。
目前，临床实验室血和尿中肌酐的测定常用酶法或碱性苦味酸法(Jaffe法)。其中，Jaffe法虽然试剂较便宜，重复性、准确性也较好，但易受血清中其他假性肌酐物质的干扰，尤其是当血清胆红素值≥165.5μmol/L时开始出现负偏差。此外，头孢类和维生素C及多巴胺等药物也使其结果出现较大干扰。
酶法利用肌酐在肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶等酶及显色剂和水、氧的共同作用下生成醌亚胺(红色)，在505nm波长下测定其吸光度A，其A值的大小和样品中肌酐的含量成正比。由于酶本身具有的特性，肌酐酰氨基水解酐在反应中仅针对肌酐而不受其他物质的干扰，这使得测定结果接近于真实值。
血清(或血浆)中的尿素氮，在尿素氮试剂的酸性环境中与二乙酰-肟(DAM)共沸后，可缩合成一红色化合物，称为fearon反应。其颜色的深浅与血清(或血浆)中尿素氮的含量成正比，与同样处理的尿素氮标准液比色，即可测算出血清(或血浆)中尿素氮的含量。由于此方法干扰性大，目前临床实验室多采用尿素酶偶联法，用尿素酶分解尿素产生氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH氧化为NAD+时，通过340nm吸光度的降低值可计算出尿素氮含量。
发明内容
本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，步骤一、在待检测的血清中取出两份相同的样品；步骤二、将试剂a和试剂b分别加入到两份样品中，并于相同条件下处理；试剂a是可以与尿素反应的试剂；试剂b是可以与尿素和肌酐反应的试剂；步骤三、依据试剂a与样品反应的结果，获得样品中尿素氮的含量；步骤四、依据试剂b与样品反应的结果，获得尿素氮和肌酐的总含量，减去步骤三获得的尿素氮含量，得到样品中肌酐的含量。
其中，步骤一中，两份相同的样品是指：两份样品的组成及其含量完全相同。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，还可以具有这样的特征：其中，试剂a包括尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH；试剂b包括尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH、肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二、试剂a和试剂b分别加入到两份样品中，混合均匀，并于36～38℃温浴3-6min。优选的，温浴温度为37℃。
其中，试剂a和试剂b同时与两份样品混合并温浴，以节省检测时间。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三，在340nm波长处测量试剂a和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得样品中尿素氮的含量；步骤四、在340nm波长处测量试剂b和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得样品中尿素氮和肌酐转换为尿素氮的总含量，再减去步骤三获得的尿素含量，得到样品中肌酐转换为尿素氮的含量，在通过计算获得样品中肌酐含量。
其中，“与相同处理的尿素氮标准液比较”是指：配置尿素氮标准液，加入试剂a(b)，混合均匀并温浴，其中，尿素氮标准液与样品等量，试剂a(b)的加入量与其加入至样品中的量相等，温浴温度和时间也与样品的处理条件相同。然后，在340nm波长处测量试剂a(b)和尿素氮标准液的混合液中NADH的吸光度下降速率，由于尿素氮标准液的浓度已知，通过计算可知样品中尿素氮(尿素氮和肌酐)的含量。并且，尿素氮标准液可以与样品同时处理，以使检测结果更加准确并节省检测时间。
其中，在试剂b与样品的反应过程中，肌酐先通过与肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶反应，生成尿素，尿素再与NADH等反应生成NAD+，因此，均可采用相同处理的尿素氮标准液进行比较。
其中，尿素氮标准液的浓度为6～8mmol/L。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，还可以具有这样的特征：其中，试剂a和试剂b还包括磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液的pH值为7.7±0.2；优选的，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，还可以具有这样的特征：其中，试剂a和试剂b还包括防腐剂；优选的，防腐剂为ProcIin-300。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，还可以具有这样的特征：其中，试剂a由磷酸盐缓冲液30～70nmol/L、尿素酶4000～6000U/L、谷氨酸脱氢酶8000～10000U/L、α-酮戊二酸140～180nmol/L、NADH2.0～4.0nmol/L、防腐剂150～250μl/L组成；
试剂b由磷酸盐缓冲液30～70nmol/L、尿素酶4000～6000U/L、谷氨酸脱氢酶8000～10000U/L、α-酮戊二酸140～180nmol/L、NADH2.0～4.0nmol/L、防腐剂150～250μl/L、肌酐酰氨基水解酶5～7KU/L、肌酸脒基水解酶5～17KU/L组成。
其中，试剂a和试剂b分别由其组分混合制成。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，还可以具有这样的特征：其中，样品与试剂a的体积比为1:70～80；样品与试剂b的体积比为1:70～80。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，在待检测血清中取得两份相同的样品，分别加入试剂a和试剂b，其中，试剂a包括尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH，血清中的尿素经尿素酶分解产生氨，氨在谷氨酸脱氢酶作用下将NADH氧化为NAD+，通过将NADH吸光度的下降速率与同样处理的尿素氮标准液比较，即可计算得出血清中尿素氮的含量；试剂b包括尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH、肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶，血清中的肌酐经肌酐酰氨基水解酶水解成肌酸，肌酸再经肌酸脒基水解酶水解产生尿素，这部分尿素和血清中原有的尿素共同在尿素酶等作用下将NADH氧化为NAD+，通过将NADH吸光度的下降速率与同样处理的尿素氮标准液比较，即可计算得出血清中尿素氮和肌酐的总含量，总含量减去已获得的尿素氮的含量，即可得出肌酐的含量。因此，将两份样品同时分别与试剂a和试剂b混合处理，经检测计算后可在短时间内快速获得尿素氮和肌酐两项数据，节省检测时间，提高检测效率。本发明检测步骤紧凑、合理，检测结果准确可靠，检测效率高。
具体实施方式
实施例一
本实施例提供一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法：
步骤一、在待检测的血清中取出两份相同的样品。
步骤二、将试剂a和试剂b同时分别加入到两份样品中，混合均匀，并于36℃温浴6min。
其中，试剂a由磷酸盐缓冲液30nmol/L、尿素酶4000U/L、谷氨酸脱氢酶8000U/L、α-酮戊二酸140nmol/L、NADH2.0nmol/L、防腐剂150μl/L组成。样品与试剂a的体积比为1:70。
试剂b由磷酸盐缓冲液30nmol/L、尿素酶4000U/L、谷氨酸脱氢酶8000U/L、α-酮戊二酸140nmol/L、NADH2.0nmol/L、防腐剂150μl/L、肌酐酰氨基水解酶5KU/L、肌酸脒基水解酶5KU/L组成。样品与试剂b的体积比为1:70。
其中，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂，防腐剂为ProcIin-300。
步骤三、在340nm波长处测量试剂a和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮的含量。
步骤四、在340nm波长处测量试剂b和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮和肌酐转换为尿素氮的总含量，再减去步骤三获得的尿素氮含量，得到样品中肌酐转换为尿素氮的含量，再通过计算获得样品中肌酐含量。
其中，尿素氮标准液的浓度为6mmol/L。在尿素氮标准液中加入试剂a(b)，混合均匀并温浴，其中，尿素氮标准液与样品等量，试剂a(b)的加入量与其加入至样品中的量相等，温浴温度和时间也与样品的处理条件相同。然后，在340nm波长处测量试剂a(b)和尿素氮标准液的混合液中NADH的吸光度下降速率，由于尿素氮标准液的浓度已知，通过计算可知样品中尿素氮(尿素氮和肌酐)的含量。
实施例二
步骤一、在待检测的血清中取出两份相同的样品。
步骤二、将试剂a和试剂b同时分别加入到两份样品中，混合均匀，并于38℃温浴3min。
其中，试剂a由磷酸盐缓冲液70nmol/L、尿素酶6000U/L、谷氨酸脱氢酶10000U/L、α-酮戊二酸180nmol/L、NADH4.0nmol/L、防腐剂250μl/L组成。样品与试剂a的体积比为1:80。
试剂b由磷酸盐缓冲液70nmol/L、尿素酶6000U/L、谷氨酸脱氢酶10000U/L、α-酮戊二酸180nmol/L、NADH4.0nmol/L、防腐剂250μl/L、肌酐酰氨基水解酶7KU/L、肌酸脒基水解酶17KU/L组成。样品与试剂b的体积比为1:80。
其中，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂，防腐剂为ProcIin-300。
步骤三、在340nm波长处测量试剂a和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮的含量。
步骤四、在340nm波长处测量试剂b和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮和肌酐转换为尿素氮的总含量，再减去步骤三获得的尿素氮含量，得到样品中肌酐转换为尿素氮的含量，再通过计算获得样品中肌酐含量。
其中，尿素氮标准液的浓度为8mmol/L。处理方式与实施例一相同。
实施例三
步骤一、在待检测的血清中取出两份相同的样品。
步骤二、将试剂a和试剂b同时分别加入到两份样品中，混合均匀，并于37℃温浴4min。
其中，试剂a由磷酸盐缓冲液50nmol/L、尿素酶5000U/L、谷氨酸脱氢酶9000U/L、α-酮戊二酸160nmol/L、NADH3.0nmol/L、防腐剂200μl/L组成。样品与试剂a的体积比为1:75。
试剂b由磷酸盐缓冲液50nmol/L、尿素酶5000U/L、谷氨酸脱氢酶9000U/L、α-酮戊二酸160nmol/L、NADH3.0nmol/L、防腐剂200μl/L、肌酐酰氨基水解酶6KU/L、肌酸脒基水解酶11KU/L组成。样品与试剂b的体积比为1:75。
其中，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂，防腐剂为ProcIin-300。
步骤三、在340nm波长处测量试剂a和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮的含量。
步骤四、在340nm波长处测量试剂b和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮和肌酐转换为尿素氮的总含量，再减去步骤三获得的尿素氮含量，得到样品中肌酐转换为尿素氮的含量，再通过计算获得样品中肌酐含量。
其中，尿素氮标准液的浓度为7mmol/L。处理方式与实施例一相同。
实施例四
步骤一、在待检测的血清中取出两份相同的样品。
步骤二、将试剂a和试剂b同时分别加入到两份样品中，混合均匀，并于37℃温浴5min。
其中，试剂a由磷酸盐缓冲液40nmol/L、尿素酶4500U/L、谷氨酸脱氢酶8500U/L、α-酮戊二酸150nmol/L、NADH2.5nmol/L组成。样品与试剂a的体积比为1:72。
试剂b由磷酸盐缓冲液60nmol/L、尿素酶5500U/L、谷氨酸脱氢酶9500U/L、α-酮戊二酸170nmol/L、NADH3.5nmol/L、肌酐酰氨基水解酶6.5KU/L、肌酸脒基水解酶15KU/L组成。样品与试剂b的体积比为1:78。
其中，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂。
步骤三、在340nm波长处测量试剂a和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮的含量。
步骤四、在340nm波长处测量试剂b和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮和肌酐转换为尿素氮的总含量，再减去步骤三获得的尿素氮含量，得到样品中肌酐转换为尿素氮的含量，再通过计算获得样品中肌酐含量。
其中，尿素氮标准液的浓度为7.5mmol/L。处理方式与实施例一相同。
实施例五
步骤一、在待检测的血清中取出两份相同的样品。
步骤二、将试剂a和试剂b同时分别加入到两份样品中，混合均匀，并于37℃温浴5min。
其中，试剂a由尿素酶5500U/L、谷氨酸脱氢酶9500U/L、α-酮戊二酸170nmol/L、NADH3.5nmol/L组成。样品与试剂a的体积比为1:78。
试剂b由尿素酶4500U/L、谷氨酸脱氢酶8500U/L、α-酮戊二酸150nmol/L、NADH2.5nmol/L、肌酐酰氨基水解酶5.5KU/L、肌酸脒基水解酶9KU/L组成。样品与试剂b的体积比为1:72。
步骤三、在340nm波长处测量试剂a和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮的含量。
步骤四、在340nm波长处测量试剂b和样品的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得样品中尿素氮和肌酐转换为尿素氮的总含量，再减去步骤三获得的尿素氮含量，得到样品中肌酐转换为尿素氮的含量，再通过计算获得样品中肌酐含量。
其中，尿素氮标准液的浓度为7.1mmol/L。处理方式与实施例一相同。

Claims (8)

1.一种血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，其特征在于：
步骤一、在待检测的血清中取出两份相同的样品；
步骤二、将试剂a和试剂b分别加入到两份所述样品中，并于相同条件下处理；
所述试剂a是可以与尿素反应的试剂；
所述试剂b是可以与尿素和肌酐反应的试剂；
步骤三、依据所述试剂a与所述样品反应的结果，获得所述样品中尿素氮的含量；
步骤四、依据所述试剂b与所述样品反应的结果，获得尿素氮和肌酐的总含量，减去步骤三获得的尿素氮含量，得到所述样品中肌酐的含量。
2.根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，其特征在于：
其中，所述试剂a包括尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH；
所述试剂b包括尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH、肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶。
3.根据权利要求2所述的血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，其特征在于：
其中，步骤二、所述试剂a和所述试剂b分别加入到两份所述样品中，混合均匀，并于36～38℃温浴3-6min。
4.根据权利要求2所述的血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，其特征在于：
其中，步骤三，在340nm波长处测量所述试剂a和所述样品的混合液中所述NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得所述样品中尿素氮的含量；
步骤四、在340nm波长处测量所述试剂b和所述样品的混合液中所述NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得所述样品中尿素氮和肌酐转换为尿素氮的总含量，再减去步骤三获得的尿素氮含量，得到所述样品中肌酐转换为尿素氮的含量，再通过计算获得所述样品中肌酐含量。
5.根据权利要求2所述的血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，其特征在于：
其中，所述试剂a和所述试剂b还包括磷酸盐缓冲液；
所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.7±0.2；
优选的，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂。
6.根据权利要求5所述的血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，其特征在于：
其中，所述试剂a和所述试剂b还包括防腐剂；
优选的，防腐剂为ProcIin-300。
7.根据权利要求6所述的血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，其特征在于：
其中，所述试剂a由磷酸盐缓冲液30～70nmol/L、尿素酶4000～6000U/L、谷氨酸脱氢酶8000～10000U/L、α-酮戊二酸140～180nmol/L、NADH2.0～4.0nmol/L、防腐剂150～250μl/L组成；
所述试剂b由磷酸盐缓冲液30～70nmol/L、尿素酶4000～6000U/L、谷氨酸脱氢酶8000～10000U/L、α-酮戊二酸140～180nmol/L、NADH2.0～4.0nmol/L、防腐剂150～250μl/L、肌酐酰氨基水解酶5～7KU/L、肌酸脒基水解酶5～17KU/L组成。
8.根据权利要求7所述的血清中尿素氮肌酐双项快速测定方法，其特征在于：
其中，所述样品与所述试剂a的体积比为1:70～80；
所述样品与所述试剂b的体积比为1:70～80。
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