CN111587286A - 用于电化学肌酐测定和血尿素氮的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
用于分析物水平的电化学检测的系统包括测试条,所述测试条包括电极和反电极,所述电极和反电极位于样品接收区附近。所述系统还包括在所述电极和反电极之一上的涂层,所述涂层包括用于分析物的试剂涂层。所述试剂涂层包括肌酐亚氨基水解酶,脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+。
Description
背景技术
肌酸(C4H9O2N3或α-甲基胍基乙酸)是一种存在于脊椎动物肌肉组织中的化合物,主要为磷酸肌酸。肌酸主要在肝脏中合成,也在胰腺和肾脏中合成。肌酸有助于产生收缩肌肉所需的能量,并且它以相对恒定的速率产生。肌酸最终通过肌肉自发降解为肌酐并释放到血液中。然后肌酐由肾脏排出,并通过肾小球过滤由机体去除。
给定人体内所产生的肌酐量是相对稳定的。因此,血清肌酐水平取决于其被去除的速率,去除速率是肾功能的粗略指标。如果肾功能下降,那么血清肌酐水平将上升。因此,血液肌酐水平是肾功能的一项良好指标。通常,除非存在明显的肾损害,否则不会出现肌酐水平升高。
根据美国糖尿病协会(ADA),20%至30%的糖尿病患者会发展糖尿病肾病(肾病)。此外,一些权威机构建议测定非糖尿病患者的血清肌酐水平以筛查肾功能不全,因为越来越多的证据表明,一旦出现肾功能不全,饮食蛋白质限制和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的使用均可以延缓进展。因此,很好确立了肌酐测试作为肾功能指标的需求。
另外,肾脏相关健康的另一种测量涉及血液尿素氮(BUN)浓度。在许多情况下,报告肌酐与血液尿素氮的比率非常有用。因此,对两种分析物进行互补测试将有用。
发明内容
在一个实施方案中,用于检测血液分析物的方法包括从第一反应产生氨(NH3)并使所述氨与脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+反应以生成NAD+。所述方法还包括用至少两个电极测量所述血液分析物的水平。或者,使NAD+与脱氢酶反应以进行所述测量。在一个替代方案中,所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶。在另一替代方案中,在所述测量中还使用了黄递酶和介体(mediator)。可替代地,所述血液分析物是肌酐并且所述第一反应包括将肌酐与肌酐亚氨基水解酶反应。在另一替代方案中,所述血液分析物是尿素并且所述第一反应包括使尿素与尿素酶反应。
在一个实施方案中,一种用于分析物水平的电化学检测的系统包括测试条,所述测试条包括电极和反电极,所述电极和反电极位于样品接收区附近。所述系统还包括在所述电极和反电极之一上的涂层,所述涂层包括用于分析物的试剂涂层。在一个替代方案中,所述试剂涂层包含肌酐亚氨基水解酶、脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+。或者,所述试剂涂层包括葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、黄递酶和介体。在另一个替代方案中,所述介体选自亚甲基蓝、麦尔多拉蓝(meldora blue)、吩嗪硫酸甲酯、2,6-二氯苯酚吲哚酚、尼罗蓝和铁氰化钾。或者,所述试剂涂层包括尿素酶、脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+。在另一个替代方案中,所述试剂涂层包括表面活性剂和缓冲剂。或者,所述试剂缓冲剂包括粘合剂和稳定剂。
在一个实施方案中,一种用于电化学检测分析物水平的系统包括测试条,所述测试条包括电极和反电极,所述电极和反电极位于样品接收区附近。所述系统还包括在所述电极和反电极之一上的涂层,所述涂层包括用于分析物的试剂涂层。所述系统还包括分析器,用于接收所述测试条,并且包括存储在非暂时性介质上的指令,所述指令用于将电流施加到所述测试条并响应地确定所述分析物的量。在一个替代方案中,所述试剂涂层包含肌酐亚氨基水解酶、脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+。或者,所述试剂涂层包括葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、黄递酶和介体。在另一个替代方案中,所述介体选自亚甲基蓝、麦尔多拉蓝、吩嗪硫酸甲酯、2,6-二氯苯酚吲哚酚、尼罗蓝和铁氰化钾。或者,所述试剂涂层包括尿素酶、脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+。
在一个实施方案中,一种检测分析物的方法包括提供电化学测试条。所述方法还包括将所述电化学测试条放置在分析器中。所述方法还包括将血液样品放置在所述电化学测试条上。所述方法还包括测量通过所述血液样品和电化学测试条提供的电流。所述方法进一步包括基于所述电流利用所述分析器来计算分析物的水平,所述分析物选由肌酐和尿素。在一个替代方案中,所述测试条包括电极和反电极,所述电极和反电极位于样品接收区中,以及在所述电极和反电极之一上的涂层,所述涂层包括用于肌酐的试剂涂层,并且所述方法进一步包括使肌酐与肌酐亚氨基水解酶反应。或者,所述方法还包括从第一反应中产生氨(NH3);使所述氨与脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+反应以生成NAD+。或者,使所述NAD+与脱氢酶反应以进行测量。在另一个替代方案中,所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶。或者,在测量中进一步使用黄递酶和介体。在另一替代方案中,所述测试条包括电极和反电极,所述电极和反电极位于样品接收区中;以及包括在所述电极和反电极之一上的涂层,所述涂层包括用于尿素的试剂涂层并且所述方法还包括使尿素与尿素酶反应。
附图简述
图1示出了使用全血和提出的肌酐试剂方案所产生的概念证明图;
图2示出了肌酐的电化学反应方案的一个实施方案;
图3示出了用于BUN的电化学反应方案的一个实施方案;和
图4示出了测试条设计的一个实施方案。
详细描述
在此仅为了方便起见而使用某些术语,不应将其视为对用于电化学肌酐测定的系统和方法的实施方案的限制。在附图中,相同的附图标记用于在若干幅图中指定相同的元件。在许多实施方案中,用于电化学肌酐测定的系统和方法包括四种酶的使用。在许多实施方案中,反应方案基于氨的形成。氨是由肌酐亚氨基水解酶或脱亚氨基酶产生的。然后将氨处理成可读取的电化学形式。
在许多实施方案中,所述系统被设计为创建电化学肌酐/BUN测定。为了使实施方案在成像市场中有用,需要高水平的精确度以确定1和1.1mg/dL肌酐之间的差异。使用基于反射率的测试很难达到这种精确度水平。由于电化学测定通常具有更好的精确度,因此这种方法用于肌酐。
所提议的测试具有许多潜在优势。首先,由于自动化和所使用的试剂量少,生产电化学测试条通常是便宜的。其次,公开的电化学肌酐/BUN测定不依赖于氧气,因此可以同时测试静脉血和毛细血管血液。第三,通过电化学测试肌酐通常得到更好的精确度。如果要为成像市场开发这种检测方法,则精确度和准确性至关重要。四个酶反应而不是五个酶反应也有助于提高精确度。第四,在许多实施方案中,电化学肌酐/BUN测定的测试范围大于反射率测定。在高浓度下,反射率测试受到所能产生颜色的数量的限制。然而,电化学测定能够测量高得多的浓度。第五,在许多实施方案中,样本量小;为2-5μL,而不是20μL。
在许多实施方案中,使用了用于电化学检测肌酐的方案。肌酐是肌肉代谢的废物分子。血流将肌酐输送到肾脏,在那里大部分肌酐被滤出并作为尿液处置。升高的肌酐水平是肾脏功能不全的指标。肌酐是确定肾脏功能性的一项重要测试,可在成像市场上用于确定是否应将造影染料给予患者。
有若干种测量肌酐的方法。最受欢迎的酶促方法是下面列出的反应方案。
对于这种酶促方法,除非去除内源性肌酸,否则它会成为引起过度恢复的干扰剂。使用上述方法的化学分析器可以通过两次测定并减去肌酸来消除内源性肌酸的影响。POC设备还需要减去天然肌酸影响。这使创建POC肌酐测定的成本增加了一倍,并且基于减法步骤可能会有复合误差(compounded error)。
以下方程中列出了POC肌酐测定的更直接的反应方案。这是PTS Diagnostics当前在美国专利公开号2004/0126833中使用的方法,在此并入作为参考。这是具有5种不同酶的复杂反应。由于酶的成本,它也相当昂贵。另外,NMHase和CSHase具有极低活性,需要大量的酶。
因此,在许多实施方案中,期望采用更好的方案。测量电化学POC系统的肌酐的更好方法是仅使用四种酶。反应方案描述如下并示于图2。
这个反应方案基于利用肌酐亚氨基水解酶或脱亚氨基酶形成NH3(氨)。血液中氨的正常范围是11-32μM/L。正常的肌酐血液水平范围为74-107μM/L。氨的干扰可能很小,或者可能需要减去。如果需要从所述测定中减去内源性氨,那将与仅在单独的通道中使用步骤2-4的反应一样简单。如果需要,POC分析器还可以报告氨水平。高氨水平将是肝硬化或肝炎的指标。
反应步骤3-4中的葡萄糖/葡萄糖脱氢酶反应不是这个测定中可以使用的唯一反应。在各种替代方案中,可以使用与NAD+和脱氢酶反应的任何底物。因此,可以替代葡萄糖。所述测定实质上是测量从步骤2形成的NAD+的量。例如,一个可以使用β-羟丁酸和β-羟丁酸脱氢酶测量形成的NAD+。葡萄糖脱氢酶可能会根据可用性和成本来选择。
上述反应方案的优点是NAD+被酶循环系统放大。注意,在反应4结束时也会产生NAD+。这在如肌酐等分析物水平非常低的分析中很有帮助。增强信号的另一种方法是使用叉指电极(interdigitated electrodes)。
反应步骤3-4对于电化学反应是良好表征的。任何会产生出色剂量响应的合适介体都可以使用。为了我们的目的,我们选择了铁氰化物来展示概念证明。不优化任何成分,制备了一种试剂并在碳电极上干燥。肌酐样品在含20mM葡萄糖的盐水中制成以促进反应。结果示于图1。图1展示了肌酐的电化学响应。碳传感器使用400mV电势。虽然尚未对试剂进行优化,但肌酐测定的工作原理很明确。信号可以用叉指电极放大。
除了具有电流分析肌酐传感器外,其他测定可以包含使用多用电化学测试条并提供具有肌酐测试的多个测试。在测试肌酐时,检查其他重要分析物如尿素、氨、葡萄糖、酮类、甘油三酯类等可能会有帮助。
在另一个实施方案中,可以使用类似的反应方案来确定BUN(血尿素氮)。在许多实施方案中,这个测试在多用电化学测试条上与肌酐测定结合。除肌酐外,许多临床医生想了解尿素或BUN水平以评估肾功能。经常报告BUN与肌酐比率。
提出的肌酐反应方案也适用于尿素,但有一些修改。尿素与尿素酶反应也会产生氨。因为尿素的正常范围为0.64至2.53mM,尿素不太可能受氨干扰的影响。反应方案也如图3所示。
总之,可以使用上述的肌酐反应方案来创建电化学肌酐和BUN测定。如果可以达到所述灵敏度,也可以创建氨测定。使用提议的反应方案的优势在于,对于BUN和肌酐,最后三个反应的反应方案相同。同样,两种测定均对氧气免疫,因此静脉血和毛细血管血都能使用。这将是研究肾功能的所需测试。
在许多实施方案中,可以使用金或碳传感器(电极)。或者,可以使用铂、氯化银或其他类型的电极。金传感器的优点是在保持相同斜率的同时具有较少的背景信号。对于通过基于包括利用了相角移位以检测血细胞比容的技术的AC阻抗来测量血细胞比容的方法,使用金传感器也是有利的。
除了具有电流分析肌酐传感器外,多用电化学测试条还可以提供具有肌酐测试的多种测试。在测试肌酐时,检查其他重要分析物如葡萄糖、酮类、甘油三酯类等也会有帮助。在一些实施方案中,电化学传感器可能包括如图4所示的多个测试区。
图4示出了条设计的一个实施方案。示出了四个条10。条10从左到右具有4、3、2和1个样品接收端口20。每个样品接收端口可以具有电极30、反电极40和参比电极50。参比电极50可以提供填充指示,因为它仅在样品到达电极50时才通电压。触头70、80也是可见的,它们与电极互连并在插入时连接到分析器中的触头。条大小不会根据测定次数而改变。另外,电极放置不会根据测定的类型而改变。根据测试方案的要求,可以打印一个、两个、三个或四个分析物的薄片。其背后的精神不是将面板的尺寸限制为仅四种分析物,而提供受保护的概念是无论一个还是十个分析物都可以测试。而且,电极不必全部都在条的一侧。先进技术可能能够在所述条的两侧放置电极,从而实现小型化。这些测试条被设计为与相应的测量血液分析物水平的仪表相配。
在一些实施方案中,单个分析物测试条被设计成与至少四个相关电极具有相同的位置。看起来像“h”的电极60用于分析器的条检测。其余测定将具有至少三个电极—一个用于样品填充检测,另外两个作为反电极和工作电极。这些测定不限于一定数量的电极,因为在一些实施方案中可以预见可添加更多电极以用于确定和校正血细胞比容或其他干扰物质的目的。
在多种配置中,可以将试剂涂在电极上。或者,如在本领域中明显地,试剂可以被印刷、涂覆(coated)、浸涂(dip coated)或以其他方式施加。如对本领域技术人员明显的,也可以使用各种类型的电极,包括由碳、金、铂、铜或其他导电材料制成的电极。
图4显示了每种测定的单独的血液采样端口。一些实施方案可以包括单独的采样端口,特别是如果试剂之间可能存在“串扰”(“cross talk”)。总之,已经提出了用于电化学肌酐传感器的新颖构思的实施方案。电化学肌酐测试将具有更小的样品大小、更短的测试时间、更好的精度,并且制造更便宜,以及可以容易地与BUN测定结合。
在一个实施方案中,提供了一种测试条和仪表组合。测试条包括肌酐和尿素的测试区。添加样品后,所述测试条和仪表组合将测试肌酐和尿素并得出两者的比率以及每一个的个别测量。
在许多实施方案中,系统的部分被设置在包括微处理器的设备中。本文描述的系统和方法的各种实施方案可以全部或部分地以软件和/或固件来实现。所述软件和/或固件可以采取包含在非暂时性计算机可读存储介质中或之上的指令的形式。然后,那些指令可以由一个或多个处理器读取并执行,以使得能够执行本文所述的操作。指令可以是任何合适的形式,例如但不限于源代码、编译代码、解释代码、可执行代码、静态代码、动态代码等。这样的计算机可读介质可以包括用于被一或多个计算机可读的形式来存储信息的任何有形非暂时性介质,例如但不限于只读存储器(ROM);随机存取存储器(RAM);磁盘存储介质;光学存储介质;闪存等。
本文描述的系统和方法的实施方案可以在各种系统中实现,包括但不限于智能手机、平板电脑、笔记本电脑以及计算设备和云计算资源的组合。例如,部分操作可以发生在一个设备中,而其他操作可以发生在远程位置,例如一个或多个远程服务器。例如,数据的收集可以在智能手机处进行,数据分析可以在服务器或云计算资源处进行。任何单个计算设备或计算设备的组合都可以执行所述方法。
虽然特定的实施方案在前面的详细描述中已经被详细描述并在附图中进行了说明,但是本领域技术人员将理解,可以根据本公开的整体教导及其广义的发明构思,对这些细节进行各种修改和替代。因此,应理解,本公开的范围不限于本文所公开的特定实例和实施方式,而是旨在覆盖由所附权利要求及其任何和所有等价形式限定的其精神和范围内的修改。注意,尽管示出了特定实施方案,但是每个附件的特征可以在实施方案之间互换。
Claims (25)
1.一种用于电化学检测分析物水平的系统,所述系统包含:
包括电极和反电极的测试条,所述电极和反电极位于样品接收区附近;和
在所述电极和反电极之一上的涂层,所述涂层包括用于分析物的试剂涂层。
2.权利要求1的系统,其中所述试剂涂层包括肌酐亚氨基水解酶、脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+。
3.权利要求2的系统,其中所述试剂涂层包括葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、黄递酶和介体。
4.权利要求3的系统,其中所述介体选自:亚甲基蓝、麦尔多拉蓝、吩嗪硫酸甲酯、2,6-二氯苯酚吲哚酚、尼罗蓝和铁氰化钾。
5.权利要求1的系统,其中所述试剂涂层包括尿素酶、脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2 +。
6.权利要求5的系统,其中所述试剂涂层包括表面活性剂和缓冲剂。
7.权利要求6的系统,其中所述试剂缓冲剂包括粘合剂和稳定剂。
8.一种用于电化学检测分析物水平的系统,所述系统包括:
包含电极和反电极的测试条,所述电极和反电极位于样品接收区附近;
在所述电极和反电极之一上的涂层,所述涂层包括用于分析物的试剂涂层;和
分析器,其用于接收所述测试条并包括存储在非暂时性介质上的指令,所述指令用于将电流施加至所述测试条并响应性地确定所述分析物的量。
9.权利要求8的系统,其中所述试剂涂层包括肌酐亚氨基水解酶、脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+。
10.权利要求9的系统,其中所述试剂涂层包括葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、黄递酶和介体。
11.权利要求10的系统,其中所述介体选自:亚甲基蓝、麦尔多拉蓝、吩嗪硫酸甲酯、2,6-二氯苯酚吲哚酚、尼罗蓝和铁氰化钾。
12.权利要求8的系统,其中所述试剂涂层包括尿素酶、脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+。
13.一种检测血液分析物的方法,所述方法包括:
从第一反应产生氨(NH3);
使所述氨与脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+反应以生成NAD+;和
用至少两个电极测量所述血液分析物的水平。
14.权利要求13的方法,其中所述NAD+与脱氢酶反应以进行测量。
15.权利要求14的方法,其中所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶。
16.权利要求15的方法,其中在所述测量中还使用了黄递酶和介体。
17.权利要求13的方法,其中所述血液分析物是肌酐并且所述第一反应包括使所述肌酐与肌酐亚氨基水解酶反应。
18.权利要求13的方法,其中所述血液分析物是尿素并且所述第一反应包括使所述尿素与尿素酶反应。
19.一种检测分析物的方法,所述方法包含:
提供电化学测试条;
将所述电化学测试条置于分析器中;
将血液样品置于所述电化学测试条上;
测量通过所述血液样品和所述电化学测试条提供的电流;和
用所述分析器根据所述电流计算分析物的水平,所述分析物选自肌酐和尿素。
20.权利要求19的方法,其中所述测试条包括电极和反电极,所述电极和反电极位于样品接收区中;以及包括在所述电极和发电极之一上的涂层,所述涂层包括用于肌酐的试剂涂层,并且所述方法进一步包括使所述肌酐与肌酐亚氨基水解酶反应。
21.权利要求20的方法,其中所述方法还包括:
从第一反应产生氨(NH3);和
使所述氨与脱酰胺NAD+、ATP和NAD合成酶/Mg2+反应以生成NAD+。
22.权利要求21的方法,其中所述NAD+与脱氢酶反应以进行所述测量。
23.权利要求22的方法,其中所述脱氢酶是葡萄糖脱氢酶。
24.权利要求23的方法,其中在所述测量中还使用了黄递酶和介体。
25.权利要求19的方法,其中所述测试条包括电极和反电极,以及在所述电极和发电极之一上的涂层,所述电极和反电极位于样品接收区中;所述涂层包括用于尿素的试剂涂层,并且所述方法进一步包括使所述尿素与尿素酶反应。
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